CN110656111B

CN110656111B - Pno1抑制剂在制备食管癌治疗药物中的用途

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Publication number: CN110656111B
Application number: CN201910918761.8A
Authority: CN
Inventors: 汪国文; 陶涛; 李其才; 王祖义
Original assignee: First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College
Current assignee: First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: CN110656111A

Abstract

PNO1抑制剂在制备食管癌治疗药物中的用途。本发明属于生物医药研究领域，具体涉及一种PNO1抑制剂的用途。本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，PNO1可作为食管癌治疗靶点。PNO1抑制剂可抑制食管癌细胞的增殖速率、抑制食管癌细胞的克隆形成能力、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞转移、抑制食管癌细胞侵袭转移，从而治疗食管癌，为食管癌治疗开辟新的方向。

Description

PNO1抑制剂在制备食管癌治疗药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及PNO1抑制剂在制备食管癌治疗药物中的用途。

背景技术

食管癌(Esophageal cancer,EC)是常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围内，食管癌的病死率高居第六位，也是我国的高发癌种，居于我国恶性肿瘤死亡率的第4位。食管癌分为两大主要病理类型，分别是食管腺癌和食管鳞癌。目前食管癌的有效治疗手段主要依赖早期手术，其5年生存率仍低于10％。化疗作为晚期食管癌、肿瘤切除及放疗后常规治疗方法，已经在临床上广泛应用。然而由于患者个体差异导致原发和获得耐药性等原因，化疗的疗效受到了限制。

目前急需食管癌的可行的治疗策略。

发明内容

为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供PNO1抑制剂的新用途。

为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了PNO1抑制剂用于制备食管癌治疗药物的用途。

进一步地，所述食管癌治疗药物至少具有以下功用之一：

抑制食管癌细胞的增殖速率、抑制食管癌细胞的克隆形成能力、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞转移、抑制食管癌细胞侵袭转移。

进一步地，所述PNO1抑制剂是指对PNO1具有抑制效果的分子。

对于PNO1具有抑制效果包括但不限于：抑制PNO1活性，或者抑制PNO1基因转录或表达。

所述PNO1抑制剂可以为双链RNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述PNO1抑制剂可以为siRNA或shRNA。所述双链RNA的靶序列或shRNA的靶序列如SEQ ID NO：3所示。

在一种实施方式中，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，所述双链RNA为siRNA，所述siRNA的第一链的序列如SEQ IDNO：4所示。

在一种实施方式中，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

所述食管癌治疗药物必然包括PNO1抑制剂，并以PNO1抑制剂作为前述功用的有效成分。

所述食管癌治疗药物中，发挥前述功用的有效成分可仅为PNO1抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。

亦即，PNO1抑制剂为所述食管癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述食管癌治疗药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述食管癌治疗药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述食管癌治疗药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第二方面，提供了一种治疗食管癌的方法，为向对象施用PNO1抑制剂。

所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的食管癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述食管癌细胞可以为离体食管癌细胞。

所述对象可以是罹患食管癌的患者或者期待治疗的食管癌的个体。或者所述对象为食管癌患者或者期待治疗食管癌的个体的离体食管癌细胞。

所述PNO1抑制剂可以在接受食管癌治疗前、中、后向对象施用。

本发明第三方面公开了一种降低食管癌细胞中PNO1基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够与PNO1基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够与PNO1基因杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PNO1基因中10-25个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与PNO1基因中13-20个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与PNO1基因中15、17或者19个连续的核苷酸序列基本相同。

更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PNO1基因中的靶序列基本相同。

所述双链RNA第一链和第二链的长度均为10-25个核苷酸；较佳的，长度均为13-20个核苷酸；最佳的，长度均为15、17或者19核苷酸。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：4所示，具体为5’-UGAACAAUUUCAGUCAUUU-3’。

SEQ ID NO：4为以SEQ ID NO:3所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人PNO1基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默食管癌细胞中内源PNO1基因表达的作用。

进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PNO1基因中10-25个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默食管癌细胞中内源PNO1基因表达的作用。

更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PNO1基因中的靶序列基本相同。

较佳的，所述正义链片段与PNO1基因中13-20个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与PNO1基因中15、17或者19个连续的核苷酸序列基本相同。

进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：5’-CCGGGCTGAACAATTTCAGTCATTTCTCGAGAAATGACTGAAATTGTTCAGCTTTTTG-3’。

shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默食管癌细胞中内源性人PNO1基因表达的作用。

编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO：3序列及其互补序列。

所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与PNO1基因中的靶序列基本相同，所述PNO1基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默PNO1基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的PNO1基因中的片段。

较佳的，所述PNO1基因中的靶序列含有SEQ ID NO:3之任一序列。

进一步的，所述PNO1基因来源于人。

本发明第四方面，公开了一种PNO1基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

所述的人PNO1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人PNO1基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述PNO1基因干扰核酸构建体为PNO1基因干扰慢病毒载体。

本发明公开的PNO1基因干扰慢病毒载体是将编码前述PNO1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述PNO1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染食管癌细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默PNO1基因的表达。

进一步的，所述PNO1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码食管癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明第五方面，公开了一种PNO1基因干扰慢病毒，由前述PNO1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对PNO1基因的小分子干扰RNA，从而抑制食管癌细胞的增殖。该PNO1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗食管癌的药物。

本发明的第六方面，提供用于预防或治疗食管癌的药物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，前述PNO1基因干扰核酸构建体，和/或前述PNO1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。

本发明第七方面，提供一种食管癌联合治疗药物组合，包括有效量的PNO1抑制剂和至少一种其他食管癌治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将PNO1抑制剂和其他食管癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他食管癌治疗药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他食管癌治疗药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将PNO1抑制剂和其他食管癌治疗药物配置成复方制剂，在将PNO1抑制剂和其他食管癌治疗药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

本发明的第八方面，提供一种治疗食管癌的方法，为向对象施用有效量的PNO1抑制剂以及向对象施用有效量的其他食管癌治疗药物和/或向对象实施其他食管癌治疗手段。

可以同步地或顺序地给予有效量的PNO1抑制剂和至少一种有效量的其他食管癌治疗药物。

基于PNO1为本发明首次发现的食管癌治疗靶点，在与PNO1抑制剂以外的其他食管癌治疗药物联合用药中，至少可以起到疗效相加的效果，进一步增强对于食管癌的治疗作用。

其他的食管癌治疗药物包括但不限制于：抗体药物、化学药物或靶向型药物等。

所述PNO1抑制剂可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。所述其他食管癌治疗药物可以是胃肠道给药或者胃肠外给药。对于抗体药物，一般采用胃肠外给药。

本发明的第九方面，提供PNO1抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：抑制食管癌细胞的增殖速率、抑制食管癌细胞的克隆形成能力、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞转移、抑制食管癌细胞侵袭转移。

本发明的第十方面，提供PNO1在制备和筛选食管癌治疗药物中的用途，或者在制备食管癌诊断药物中的用途。

所述将分离的PNO1基因用于制备或筛选食管癌治疗药物包括两方面的内容：其一，将PNO1基因作为药物或制剂针对食管癌细胞的作用靶标应用于制备食管癌治疗药物或制剂；其二，将PNO1基因作为药物或制剂针对食管癌细胞的作用靶标应用于筛选食管癌治疗药物或制剂。

所述将PNO1基因作为药物或制剂针对食管癌细胞的作用靶标应用于制备食管癌治疗药物或制剂具体是指：将PNO1基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对食管癌细胞的药物或制剂，从而能降低食管癌细胞内PNO1基因的表达水平。

所述将PNO1基因作为药物或制剂针对食管癌细胞的作用靶标应用于筛选食管癌治疗药物或制剂具体是指：将PNO1基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人PNO1基因表达的药物作为食管癌治疗备选药物。如本发明所述的PNO1基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人PNO1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制食管癌细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将PNO1基因及其蛋白作为作用对象。

所述将PNO1基因用于制备食管癌诊断药物，是指将PNO1基因表达产物作为一项食管癌诊断指标应用于食管癌诊断药物的制备。

所述食管癌治疗药物为能够特异性抑制PNO1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制PNO1蛋白的表达或活性的分子，从而降低食管癌细胞中PNO1基因的表达水平，达到抑制食管癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。

所述通过分离的PNO1基因制备或筛选获得的食管癌治疗药物或者食管癌诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。

所述食管癌治疗药物的施用量为足够降低人PNO1基因的转录或翻译，或者足够降低人PNO1蛋白的表达或活性的剂量。以使人PNO1基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。

采用前述食管癌治疗药物治疗食管癌的方法，主要是通过降低人PNO1基因的表达水平抑制食管癌细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人PNO1基因表达水平的物质给药于患者。

在一种实施方式中，所述PNO1基因的靶标序列如SEQ ID NO：3所示。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，PNO1可作为食管癌治疗靶点。PNO1抑制剂可抑制食管癌细胞的增殖速率、抑制食管癌细胞的克隆形成能力、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞转移、抑制食管癌细胞侵袭转移，从而治疗食管癌，为食管癌治疗开辟新的方向。

附图说明

图1：qPCR检测PNO1基因在食管癌细胞中表达情况。

图2：qPCR检测Eca-109细胞mRNA水平靶基因消减效率。

图3：qPCR检测TE-1细胞mRNA水平靶基因消减效率。

图4：Celigo细胞自动分析结果揭示PNO1基因的消减抑制食管癌细胞的增殖。(细胞系为ECA-109食管癌细胞，病毒感染后1，2，3，4以及5天分别对细胞数量进行统计)

图5：Celigo细胞自动分析结果揭示PNO1基因的消减抑制食管癌细胞的增殖。(细胞系为TE-1食管癌细胞，病毒感染后1，2，3，4以及5天分别对细胞数量进行统计)

图6：Western Blot检测ECA-109细胞靶点降低PNO1基因蛋白水平表达情况。

图7：Western Blot检测TE-1细胞靶点降低PNO1基因蛋白水平表达情况。

图8：FACS检测PNO1基因消减对ECA-109细胞凋亡的影响，左侧为流式细胞凋亡示意图，右侧柱状结果以细胞百分比平均值±标准差显示。

图9：FACS检测PNO1基因消减对TE-1细胞凋亡的影响，左侧为流式细胞凋亡示意图，右侧柱状结果以细胞百分比平均值±标准差显示。

图10：细胞克隆形成法检测PNO1基因对ECA-109细胞增殖能力的影响，shRNA慢病毒感染ECA-109细胞，培养11天后，观察克隆数，左侧为数码相机记录图，右侧柱状结果以细胞克隆数量平均值±标准差显示。

图11：细胞克隆形成法检测PNO1基因对TE-1细胞增殖能力的影响，shRNA慢病毒感染TE-1细胞，培养11天后，观察克隆数，左侧为数码相机记录图，右侧柱状结果以细胞克隆数量平均值±标准差显示。

图12：MTT实验结果显示病毒感染后不同时间点检测实验组以及对照组ECA-109食管癌细胞增殖情况；(酶标仪对波长490nm的光的吸收率随时间变化的对比，OD490在这里反映了具有活力的细胞的数量)及shPNO1组与对照组(shCtrl)活性细胞比率随时间变化的对比图。(统计数据根据不同时间点采集的活性细胞OD490数值与第一天采集的活性细胞OD490数值比值计算而来)。

图13：MTT实验结果显示病毒感染后不同时间点检测实验组以及对照组TE-1食管癌细胞增殖情况(酶标仪对波长490nm的光的吸收率随时间变化的对比，OD490在这里反映了具有活力的细胞的数量)及shPNO1组与对照组(shCtrl)活性细胞比率随时间变化的对比图。(统计数据根据不同时间点采集的活性细胞OD490数值与第一天采集的活性细胞OD490数值比值计算而来)。

图14：Wound-healing实验结果显示PNO1消减影响ECA-109食管癌细胞的迁移能力及PNO1处理组迁移细胞数与对照组(shCtrl)迁移细胞数比值分析结果。

图15：Wound-healing实验结果显示PNO1消减影响TE-1食管癌细胞的迁移能力及PNO1处理组迁移细胞数与对照组(shCtrl)迁移细胞数比值分析结果。

图16：Transwell实验显示PNO1消减影响ECA-109食管癌细胞的转移能力及PNO1处理组转移细胞数与对照组(shCtrl)转移细胞数比值分析结果。

图17：Transwell实验显示PNO1消减影响TE-1食管癌细胞的转移能力及PNO1处理组转移细胞数与对照组(shCtrl)转移细胞数比值分析结果。

图18：Transwell实验显示PNO1消减影响ECA-109食管癌细胞的侵袭能力及PNO1处理组侵袭细胞数与对照组(shCtrl)侵袭细胞数比值分析结果。

图19：Transwell实验显示PNO1消减影响TE-1食管癌细胞的侵袭能力及PNO1处理组侵袭细胞数与对照组(shCtrl)侵袭细胞数比值分析结果。

附图中，

柱形图代表三次实验的平均值，误差线表示标准偏差(SD)。

**,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比，P<0.01。

*,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比，0.01<P<0.05。

具体实施方式

本发明对TCGA数据库中食管癌基因相关信息进行开发，并进一步查阅大量文献。同时结合表达谱差异分析、高通量细胞筛选技术等功能基因筛选方法。最终，成功筛选出可能的促进食管癌转化的特异性癌基因PNO1，且该基因迄今为止尚未在食管癌领域得到进一步开发及研究。

随后，本发明从细胞功能学角度出发证实PNO1基因在食管癌发生中的作用。通过构建目的基因shRNA慢病毒，慢病毒转染食管癌细胞，与转染对照慢病毒做对比，检测两组食管癌细胞系内mRNA及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡、细胞克隆形成能力、细胞迁移等检测，结果显示shRNA组与对照组对比，shRNA组食管癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组，细胞凋亡率增加程度较对照组高。

依据上述研究结果，进一步探索，开发针对该基因的诊断治疗新方法，能给食管癌患者的诊断治疗提供更多选择。

PNO1抑制剂

指对于PNO1具有抑制效果的分子。对于PNO1具有抑制效果包括但不限于：抑制PNO1活性，或者抑制PNO1基因转录或表达。所述PNO1抑制剂包括但不限于siRNA、shRNA、抗体、小分子化合物。

抑制PNO1活性是指使PNO1活力下降。优选地，相比抑制前，PNO1活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制PNO1基因转录或表达是指：使PNO1的基因不转录，或降低PNO1的基因的转录活性，或者使PNO1的基因不表达，或降低PNO1的基因的表达活性。

本领域技术人员可以使用常规方法对PNO1的基因转录或表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

PNO1的基因转录或表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，PNO1基因转录或表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地PNO1基因完全没有表达。

小分子化合物

本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。

PNO1抑制剂制备药物

以PNO1抑制剂为主要活性成分或主要活性成分之一制备食管癌治疗药物。通常，药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。

“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。

“药学上可接受的载体或辅料”应当与PNO1抑制剂相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。

本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。

联合治疗药物组合和施用方法

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将PNO1抑制剂和其他食管癌治疗药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。使用时，可几种药同时使用，也可几种药先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对机体有效的期间内向机体施加其他药物。

抗体常用的用药方法为静脉注射、静脉滴注或动脉灌注。其用法用量可参考现有技术。

小分子化合物常用的用药方法可以是胃肠道给药或者是胃肠外给药。siRNA、shRNA、抗体则一般采用胃肠外给药。可以是局部给药亦可以为全身给药。

使用时，可将有效量的PNO1抑制剂和有效量的其他食管癌治疗药物同时使用，也可将有效量的PNO1抑制剂和有效量的其他食管癌治疗药物先后使用。先后给药时，应当在先用药物仍对生物体有效的期间内向生物体施加其他药物。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1

(一)实验方法

1.目的细胞

人食管癌细胞：Eca-109、TE-1。

2.PNO1基因在食管癌细胞中表达

2.1实验方法：

针对PNO1基因进行引物设计。引物序列为5’-TGTTAAACCCCTAAAGGGAGACC-3’(SEQIDNO：1)和5’-CCTTGTCCGTGTCACATTCTCT-3’(SEQ IDNO：2)抽提Eca-109、TE-1、EC9706细胞，分别抽提RNA，反转录获得cDNA，以GAPDH为内参，通过RT-PCR检测在ECA-109、TE-1、EC9706细胞中PNO1的mRNA表达情况。

2.2实验步骤

2.2.1总RNA抽提

(1)收集细胞，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5mL EP管中。

(2)每管加入200μL氯仿，上下颠倒EP管15s，然后室温静置10min。

(3)4℃、12800rpm，离心15min。

(4)吸取上层液体移至新的1.5mL EP管，加入等体积预冷的异丙醇，然后混匀后4℃静置10min。

(5)4℃、12800rpm离心12min后，弃去上清。

(6)加入1mL、75％乙醇(用DEPC水新鲜配制)，然后洗涤沉淀。

(7)4℃、11800rpm离心5min，弃去大部分上清。

(8)4℃、11800rpm再次离心5min，弃去上清，然后室温干燥。

(9)待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水(加入体积视RNA沉淀量而定)至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。

2.2.2反转录获得cDNA

(1)将1μL Oligo dT(0.5μg/μL)和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-Free H₂O至10μL；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火。

(2)在上述混合物中，按表2.1的比例配制反应体系(冰上进行)，混匀，短暂离心表2.1试剂用量

试剂	每管加入量
		5×RT buffer	4μL
10mM dNTPs	2μL
		Rnasin(40U/μL)	0.4μL
M-MLV-RTase(200U/μL)	1μL
		RNase-Free H<sub>2</sub>O	2.6μL

注：dNTPs是dATP，dCTP，dGTP，dTTP的混合，浓度为10mM

(3)上述体系在42℃水浴反应1h，然后在70℃水浴10min使RT酶失活，将得到的RT产物--cDNA置于-20℃保存备用。

2.1.3 Real-time PCR检测

(1)按表2.2比例配置反应体系(12μL体系)：

表2.2各组分量

试剂	每管加入量
		SYBR premix ex taq	6.0μL
引物mix(5μM)	0.3μL
		模板(反转录产物)	0.6μL
RNase-Free H<sub>2</sub>O	5.1μL

(2)两步法进行Real-Time PCR，并进行数据分析。

3.针对PNO1基因的干扰慢病毒制备

分组说明：

shCtrl：为正常目的细胞Eca-109、TE-1，加阴性对照病毒感染的细胞组。

shPNO1：为正常目的细胞Eca-109、TE-1，加PNO1基因shRNA慢病毒感染的细胞组。

针对PNO1基因，设计了特异性靶点干扰序列，针对PNO1的shRNA记为shPNO1，所述shPNO1所针对的靶序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：

5’-TGAACAATTTCAGTCATTT-3’。

shPNO1所对应的siRNA的序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：

5’-UGAACAAUUUCAGUCAUUU-3’。

所述sh PNO1自身的序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：

5’-CCGGGCTGAACAATTTCAGTCATTTCTCGAGAAATGACTGAAATTGTTCAGCTTTTTG-3’。

阴性对照(shCtrl)的靶序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：

5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。

根据靶点序列设计shRNA干扰序列，分别构建至hU6-MCS-CMV-puro^r质粒载体中，与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体质粒，共转染293T细胞，在转染48-72h获得未纯化的细胞上清，并对上清进行纯化浓缩获得高滴度的慢病毒。

4.qPCR检测mRNA水平PNO1基因消减效率

针对PNO1基因进行引物设计。引物序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。抽提对照组shCtrl以及shPNO1干扰慢病毒感染组细胞，分别抽提RNA，反转录获得cDNA，以GAPDH为内参，通过RT-PCR检测在ECA-109、TE-1细胞中PNO1的mRNA表达情况。

实验步骤与2.2相同。

5.Celigo检测PNO1基因消减对细胞增殖的影响

5.1实验方法

培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前一天将细胞分入96-well培养板培养，感染当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染2～3d，荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况(荧光率需达到70～90％)，待孔内细胞密度达到70～90％时收集细胞，通过Celigo识别带绿色荧光的细胞并拍照(即读板)。然后通过软件对拍照的图像进行分析处理，计算孔板中不同组别含有的细胞数目。连续读板5天后，即可绘制出细胞生长曲线图，从而呈现出细胞增殖状况。

5.2实验材料

5.2.1主要试剂

试剂信息见表5.1。

表5.1试剂信息

试剂名称	试剂来源	cat.No.
			胎牛血清	Ausbian	VS500T
基础培养基	Corning
			D-Hanks	上海吉凯基因技术有限公司配制
胰酶	生工生物工程(上海)股份有限公司	0458-50G

5.2.2主要仪器

仪器信息见表5.2。

表5.2仪器信息

仪器名称	仪器来源	cat.No.
			荧光显微镜	奥林巴斯	IX71
倒置显微镜	上海蔡康光学仪器有限公司	XDS-100
			CO2培养箱	日本三洋SANYO	MCO-175
离心机	赛默飞世尔科技(中国)有限公司	Fresco 21
			生物安全柜	上海振梓创空气净化设备有限公司	Bio 1200-II-A2
Celigo	Nexcelom

5.3实验步骤

5.3.1准备目的细胞

5.3.1.1细胞复苏

(1)从液氮罐中取出细胞冻存管；

(2)迅速放入37℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻；

(3)完全解冻后，适速离心，可1300rpm，离心约3min；

(4)75％酒精擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜；

(5)吸去冻存液上清，然后适量加入新鲜的完全培养基重悬细胞，可加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3mL含完全培养基的6-cm dish中，轻轻晃匀后置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

(6)次日应当更换一次培养液后再继续培养。

5.3.1.2细胞传代

(1)将生长约90％汇合的细胞进行传代；

(2)应当弃去旧培养液，加入适量灭菌的D-Hank’s溶液，可加入2mL灭菌的D-Hank’s溶液，洗涤细胞，然后弃去该溶液；

(3)加入适量胰酶消化液，可加入0.5mL胰酶消化液，37℃消化约1-2min，直到细胞完全消化下来；

(4)加入完全培养基适量，可加入1ml完全培养基，吹打数次，将壁上的细胞冲洗下来；

(5)混匀细胞后分至两个新的6-cm dish中，补足完全培养基至适量，可为4mL，继续培养。

5.3.2目的细胞慢病毒感染

(1)处于对数生长期的目的细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；

(2)将细胞悬液(细胞数约为1500～2500)接种于96-well中，37℃、5％CO₂培养箱培养待细胞融合度达到约20～30％；

(3)根据细胞MOI值，加入适宜量的病毒；

(4)12h后观察细胞状态，并更换培养基；

(5)感染2～3天后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况，荧光率一般应当达到70～90％，将细胞继续培养至细胞融合度达到70～90％时，收集细胞继续后续实验。

5.3.3Celigo细胞计数检测细胞增殖

(1)将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；

(2)根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为2000cell/well)。每组采用3复孔，培养体系一般为100μL/孔，应当注意铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致37℃、5％CO₂培养箱培养；

(3)从铺板后第二天开始，每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；

(4)通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；然后对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。

6.Western Blot检测靶点降低PNO1基因蛋白水平表达

6.1实验方法

将构建含有融合FLAG标签的PNO1表达克隆质粒和针对PNO1干扰靶点的RNAi病毒载体质粒，共转染至293T细胞中，48h后，收集蛋白并定量，运用flag抗体进行Western Blot检测蛋白敲减效率。

6.2实验步骤

6.2.1.总蛋白抽提

(1)接收细胞样品，PBS洗涤两次后，适量预冷的2×Lysis Buffer裂解，配方如下：

(2)细胞刮刮下细胞转移入EP管中，冰上裂解10-15min后超声破碎细胞(200W共4次，每次5s，间隔2s)。

(3)4℃、12000g，离心15min，取上清BCA法测定蛋白浓度。

(4)调整每个样品蛋白浓度为2μg/μL，-80℃保存备用。

6.2.2.SDS-PAGE

(1)制胶

(2)上样：胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。

(3)电泳：浓缩胶80mA，20min；分离胶120mA，1h。

6.2.3.免疫印迹(湿转)

电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。

6.2.4.抗体杂交：

(1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜。

(2)一抗孵育：封闭液稀释抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，并用TBST洗膜4次，每次8min。

(3)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜1.5h，并用TBST洗膜4次，每次8min。

6.2.5.X光显影：

(1)PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，以1：40的比例混合A液和B液，混合液均匀滴加在PVDF膜上，避光反应5min。

(2)将膜取出，稍微沥干多余的ECL底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1-2min。

(3)取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)。

(4)取出X光片，晾干，分析。

7.FACS检测PNO1基因消减对凋亡的影响

7.1实验方法

对ECA-109、TE-1细胞进行慢病毒感染3天后，传代铺板，待细胞融合度达85％后，消化收集细胞，加入Annnexin V-APC染色处理，使用流式细胞仪对细胞进行检测，并运用guava InCyte流式细胞仪分析软件进行分析。

7.2实验步骤

(1)待各实验组6孔板细胞生长至覆盖率约为70％时药物诱导凋亡。

(2)胰酶消化，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一5mL离心管中，每组设三个复孔(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×10⁵/处理)。

(3)1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的D-Hanks(pH＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀。

(4)1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1300rmp、3min离心，收集细胞。

(5)200μL 1×binding buffer重悬细胞沉淀。

(6)加入10μL Annexin V-APC染色，室温避光10-15min。

(7)根据细胞量，补加400-800μL 1×binding buffer，上机检测。

(8)结果分析，使用流式细胞仪分析软件guava InCyte进行分析。

8.检测PNO1基因消减对细胞克隆形成能力的影响

8.1实验方法：对ECA-109、TE-1细胞进行慢病毒感染3天后，传代接种于6孔板中，将接种好的细胞持续培养15天，中间每隔4天进行换液并观察细胞状态，加入1mL 4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，然后加入洁净、无杂质染液，染细胞10-20min，处理完毕后数码相机拍照。

细胞克隆实验参数见表8.1。

表8.1细胞克隆实验参数

接种细胞数cell/well	1500
		培养体系：	6孔板，2ml/well
检测时间：	感染3天后种板，持续培养15天，每4天换液一次

8.2实验步骤

(1)准备感染后细胞：将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。

(2)细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定)，每个实验组设3个复孔。

(3)将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14-15天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3-4天进行换液并观察细胞状态。

(4)实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，洗涤细胞1次。

(5)每孔加入1mL 4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，洗涤细胞1次。

(6)每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液500-1000μL，染细胞10-20min。

(7)ddH₂O洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照整，克隆计数。

9.MTT检测PNO1基因消减对细胞增殖的影响

9.1实验方法：

对ECA-109、TE-1细胞进行慢病毒感染3天后，传代接种与96孔板中，铺板数为2000，铺板24h后，培养终止前4h加入20μL 5mg/ml的MTT溶液，4h后加入100μL DMSO溶液，进行酶标仪检测。

MTT实验参数见表3.2。

表3.2 MTT实验参数

接种细胞数cell/well	1500
		培养体系	96孔板，100μl/well
检测时间	加药后24至120小时

shRNA慢病毒感染AGS细胞，培养5天后，经MTT处理4小时，加入DMSO溶液，进行酶标仪检测。

9.2实验步骤

(1)将处于对数生长期的本发明中的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。

(2)应当根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(一般为2000cell/well)，每组3-5重复，铺5张96孔板。

(3)然后，统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，应当在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果发现密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板，放入细胞培养箱中进行培养。

(4)应当从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液。

(5)4h后完全吸去培养液，应当注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μL DMSO溶解甲瓒颗粒。

(6)振荡器振荡适时时间，可为约2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值。

(7)然后进行数据的统计分析。

10.Wound-healing检测PNO1基因消减对细胞迁移的影响

10.1实验方法

通过慢病毒感染细胞，使得目的细胞表达GFP，以便于自动统计细胞数量，然后通过Celigo对划痕后的细胞拍照，分析细胞迁移率从而大通量的检测各基因对细胞迁移的影响；针对96孔板每个实验孔，通过Celigo扫板获得迁移0h和x h后的图片(细胞放大倍数为50倍)，分析0h和x h的细胞面积(像素面积)。迁移面积＝x h的细胞面积-0h的细胞面积

10.2实验步骤：

(2)根据细胞大小决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为50000cell/well)，以次日细胞达到90％以上汇合度为准。37℃、5％CO₂培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μL/孔。

(3)第二天换低浓度血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。

(4)使用无血清培养基轻轻漂洗2-3遍，加入低浓度血清培养基(如0.5％FBS)，

0h拍照。

(5)37℃、5％CO₂培养箱培养，根据愈合程度选择合适时间用Celigo扫板。

(6)用Celigo分析迁移面积。

11.Migration(无ECM的Transwell)检测PNO1基因消减对细胞转移的影响

对ECA-109、TE-1细胞进行慢病毒感染4天后，以5000细胞/孔密度接种于上室内(上室无血清培养基，下室30％FBS培养基)，37℃培养箱培养一段时间，移去小室内非转移细胞，Giemsa染色3-5min后，显微镜拍照。统计各组细胞比例，分析细胞转移情况。

12.Invasion(有ECM的Transwell)检测PNO1基因消减对细胞转移的影响

方法参照11中无细胞外基质(ECM)侵袭实验方法，唯一区别是检测器材采用含ECM小室进行实验。

(二)实验结果

如图1所示，以GAPDH为内参的QPCR结果提示PNO1基因在模式细胞Eca-109、TE-1中表达(纵坐标为ΔCt，ΔCt＝目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔCt相对较大的细胞，目的基因表达丰度相对较低)。

如图2和图3所示，经shRNA慢病毒感染3天后，实验组Eca-109、TE-1细胞中PNO1基因在mRNA水平的表达量受到抑制。

如图4和图5所示，经shRNA慢病毒感染3天后，细胞铺于96孔板，Eca-109、TE-1铺板数均为2000。Celigo连续检测5天，发现实验组Eca-109、TE-1细胞的增殖速率受到显著抑制。提示PNO1基因与Eca-109、TE-1细胞的增殖能力显著相关。

如图6和图7所示，从Western Blot结果可以看出，在Eca-109、TE-1细胞中，靶点对PNO1基因的内源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用。

如图8和图9所示，shRNA慢病毒感染5天后，实验组发生凋亡的Eca-109、TE-1细胞显著增加，提示PNO1基因与Eca-109、TE-1细胞的凋亡显著相关。

如图10和图11所示，shRNA慢病毒感染3天后，细胞铺于6孔板，铺板量为1000。10天后，观察克隆数，发现实验组Eca-109、TE-1细胞集落数目减少，克隆形成能力受抑制。提示PNO1基因与Eca-109、TE-1细胞的克隆形成能力显著相关。

如图12和图13所示，经shRNA慢病毒感染3天后，细胞铺于96孔板，铺板数为2000。连续检测5天，发现实验组Eca-109、TE-1细胞的增殖速率受到显著抑制。提示PNO1基因与Eca-109、TE-1细胞的增殖能力显著相关。

如图14和图15所示，经shRNA慢病毒感染3天后，Eca-109、TE-1细胞划痕24小时经Celigo检测，发现实验组Eca-109、TE-1细胞的迁移能力受到显著抑制。提示PNO1基因与Eca-109、TE-1细胞的迁移能力显著相关。

如图16和图17所示，shRNA慢病毒感染3天后，实验组Eca-109、TE-1细胞的转移能力受到显著抑制。提示PNO1基因与Eca-109、TE-1细胞的转移能力显著相关。

如图18和图19所示，shRNA慢病毒感染3天后，实验组Eca-109、TE-1细胞的侵袭转移能力受到显著抑制。提示PNO1基因与Eca-109、TE-1细胞的侵袭转移能力显著相关。

综合上述实验结果，证实干扰目的基因PNO1对食管癌细胞Eca-109、TE-1有抑制其增殖及转移的作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 蚌埠医学院第一附属医院

<120> PNO1抑制剂在制备食管癌治疗药物中的用途

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgttaaaccc ctaaagggag acc 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccttgtccgt gtcacattct ct 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaacaattt cagtcattt 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ugaacaauuu cagucauuu 19

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccgggctgaa caatttcagt catttctcga gaaatgactg aaattgttca gctttttg 58

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttctccgaac gtgtcacgt 19

Claims

1.PNO1抑制剂用于制备食管癌治疗药物的用途，所述PNO1抑制剂为shRNA；所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述食管癌治疗药物至少具有以下功用之一：抑制食管癌细胞的增殖速率、抑制食管癌细胞的克隆形成能力、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞转移、抑制食管癌细胞侵袭转移；

2)所述PNO1抑制剂是指对PNO1具有抑制效果的分子；

3)所述PNO1抑制剂为所述食管癌治疗药物的唯一有效成分或有效成分之一。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述shRNA靶序列如SEQ ID NO：3所示。

4.一种用于预防或治疗食管癌的药物，其有效物质含有：

分离的核酸分子，所述核酸分子为shRNA，所述shRNA中含有能够与PNO1基因杂交的核苷酸序列；所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

和/或，PNO1基因干扰核酸构建体；所述PNO1基因干扰核酸构建体，含有编码所述shRNA的基因片段，能表达所述shRNA；

和/或，PNO1基因干扰慢病毒，所述PNO1基因干扰慢病毒在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成；

以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

5.如权利要求4所述的用于预防或治疗食管癌的药物，其特征在于，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PNO1基因中的靶序列相同。

6.如权利要求4所述的用于预防或治疗食管癌的药物，其特征在于，所述shRNA靶序列如SEQ ID NO：3所示。

7.如权利要求4所述的用于预防或治疗食管癌的药物，其特征在于，所述PNO1基因干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。

8.PNO1抑制剂在制备具有以下任一项或多项作用的药物中的用途：抑制食管癌细胞的增殖速率、抑制食管癌细胞的克隆形成能力、促进食管癌细胞凋亡、抑制食管癌细胞迁移、抑制食管癌细胞转移、抑制食管癌细胞侵袭转移；所述PNO1抑制剂为shRNA；所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。