CN111378753A - 人pno1基因在肺癌中的用途及相关产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可用作肺癌诊断靶标和治疗靶标的RNA结合蛋白PNO1。特别地，本发明公开了RNA结合蛋白PNO1在肺癌细胞中过表达，该过表达能够促进肺癌细胞增殖，并且与肺癌病人的短的预后生存时间相关。降低该PNO1表达导致肺癌细胞生长和转移抑制，增加肺癌细胞凋亡，因此抑制该PNO1表达代表了肺癌治疗的一个新策略。

Description

人PNO1基因在肺癌中的用途及相关产品
技术领域
本发明属于生物医药研究领域，具体涉及人PNO1基因的用途及相关产品。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC占肺癌中的85％癌症病例，通过组织病理学异质性研究又可将其进一步分为三类，包括腺癌(ADC)，鳞状细胞癌(SCC)，和大细胞癌，其中肺腺癌(LADC)占NSCLC中超过50％的病例。由于肺癌的异质性，目前尚未有有效的个体化诊疗方案，亟需开发可用于肺癌治疗的新型药物靶标以及预后预测的生物标志物。
研究证明，核糖体生物合成在肺癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的进展中具有重要作用。RNA结合蛋白PNO1(partner of NOB1)，也叫做Dim2或Rrp20，是一种核糖体装配因子，是核糖体生物合成所必须的。PNO1通过与NOB1结合调节18S的裂解。降表达PNO1会抑制18S rRNA的合成，从而降低40S亚基的合成。仅有一项研究指出了PNO1在结直肠癌(CRC)细胞的核糖体生物合成中的重要作用，且PNO1可作为CRC的生物标志物。
然而，目前还未有PNO1基因用于肺癌诊疗的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明提供了人PNO1基因的用途及相关产品。特别地，本发明涉及一种可用作肺癌诊断靶标和治疗靶标的RNA结合蛋白PNO1。本发明公开了RNA结合蛋白PNO1在肺癌细胞中过表达，该过表达能够促进肺癌细胞增殖，并且与肺癌病人的短的预后生存时间相关。降低该PNO1表达导致肺癌细胞生长和转移抑制，增加肺癌细胞凋亡，因此抑制该PNO1表达代表了肺癌治疗的一个新策略。
具体地，本发明提供以下各项：
1.检测RNA结合蛋白PNO1的基因转录(mRNA)水平或蛋白表达水平或生物活性水平的试剂在制备肺癌的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。所述肺癌优选为哺乳动物中的肺癌，更优选为人的肺癌。在一个实施方案中，本发明提供了诊断癌症的方法，所述方法包括检测受试者的样品中PNO1的表达水平(即基因转录(mRNA)水平或蛋白表达水平或生物活性水平)，其中相对于对照(健康或正常样品)，PNO1在受试者的样品中的过表达指示受试者患有癌症的(高)风险或患有癌症。
2.根据以上1所述的应用，其中所述试剂为针对PNO1基因的特异性探针、基因芯片或PCR引物。
3.根据以上1所述的应用，其中所述肺癌为小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，和/或选自腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌。
4.根据以上1至3中任一项所述的应用，其中所述PNO1的氨基酸序列为人PNO1的氨基酸序列，优选其GenBank登录号为NP_064528，如SEQ ID NO:11所示；更优选其编码PNO1基因为人PNO1的基因序列，其GenBank登录号为NM_020143，如SEQ ID NO:12所示。
SEQ ID NO：11 NP_064528
MESEMETQSARAEEGFTQVTRKGGRRAKKRQAEQLSAAGEGGDAGRMDTEEARPAKRPVFPPLCGDGLLSGKEETRKIPVPANRYTPLKENWMKIFTPIVEHLGLQIRFNLKSRNVEIRTCKETKDVSALTKAADFVKAFILGFQVEDALALIRLDDLFLESFEITDVKPLKGDHLSRAIGRIAGKGGKTKFTIENVTRTRIVLADVKVHILGSFQNIKMARTAICNLILGNPPSKVYGNIRAVASRSADRF
SEQ ID NO：12 NM_020143
Figure BDA0002434676020000021
Figure BDA0002434676020000031
5.降低或抑制RNA结合蛋白PNO1的基因转录(mRNA)水平或蛋白表达水平或生物活性水平(降表达PNO1基因)的试剂在制备肺癌的药物中的应用。降低或抑制PNO1表达的试剂的本质对于本发明来说并不重要，只要它降低或抑制PNO1的表达即可。
6.根据以上5所述的应用，其中降低或抑制RNA结合蛋白PNO1的基因转录(mRNA)水平或蛋白表达水平或生物活性水平的试剂选自由以下组成的组：gapmer、反义RNA、siRNA(优选其针对的PNO1基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示，并且第一链的序列如SEQ ID NO：2所示)、esiRNA、shRNA(优选其针对的PNO1基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示，更优选所述shRNA的序列如SEQ ID NO：3所示)、miRNA、RNA适体、TALEN、CRISPR、锌指核酸酶、单克隆或多克隆抗体和小分子化合物。在特别优选的实施方案中，用于反义RNA、siRNA和shRNA的具体序列是本申请说明书实施例中使用的那些序列。
7.根据以上5所述的应用，其中所述肺癌为小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，和/或选自腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌，优选地其中所述PNO1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，更优选其编码PNO1基因如SEQ ID NO:12所示。
8.根据以上6所述的应用，其中所述试剂被包装为慢病毒的形式。
9.根据以上5至8中任一项所述的应用，其中所述药物还包含另外的抗肺癌药，例如化疗药。即使PNO1表达的抑制足以实现治疗肺癌的效果，但是预期将降低或抑制PNO1表达的试剂与其他抗肺癌药物如化疗剂组合时，可以获得更强甚至协同的抗肺癌效果。
10.一种筛选抗肺癌药物的方法，所述方法包括下述步骤：
1)确定过表达PNO1的细胞中PNO1的表达水平(即基因转录(mRNA)水平、蛋白表达水平或生物活性水平)；
2)将候选化合物与步骤1)的细胞接触；
3)确定在步骤2)后细胞中PNO1的表达水平；和
4)比较步骤1)和步骤3)中确定的PNO1的表达水平，其中PNO1的表达水平降低指示所述候选化合物具有抗肺癌潜力，
优选所述细胞为肺癌细胞。所述肺癌为小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，和/或选自腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌。
根据本发明的另一个方面，提供了评价药剂在治疗和/或预防肺癌中的效果的方法，其中所述方法包括测试所述药剂是否能够降低肺癌细胞样品中PNO1的表达，如果能够降低，则说明所述药剂适合于治疗和/或预防肺癌。所述肺癌为小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，和/或选自腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌。
附图说明
图1，A：免疫组织化学法检测肺腺癌(LADC)患者组织芯片PNO1表达情况；
图1，B：不同PNO1表达水平肺腺癌(LADC)患者的比例；
图1，C：生存曲线显示PNO1免疫组化分数与LADC患者总生存期的关系，PNO1低表达患者5年生存率为68.7％，而PNO1高表达患者仅为49.1％；
图2，A：Western Blotting检测肺腺癌患者肿瘤组织(T)与癌旁组织(N)PNO1蛋白表达水平；
图2，B：实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肺腺癌患者肿瘤组织(T)与癌旁组织(N)PNO1 mRNA水平；
图3，A：RT-PCR(左)及检测A549细胞mRNA水平靶基因消减效率，Western Blotting(右)检测A549细胞靶点降低PNO1基因蛋白水平表达情况；
图3，B：RT-PCR(左)检测NCI-H1299细胞mRNA水平靶基因消减效率，WesternBlotting(右)检测NCI-H1299细胞靶点降低PNO1基因蛋白水平表达情况；
图4，A：Migration趋化实验显示PNO1基因表达下调后A549细胞趋化能力下降；
图4，B：Migration趋化实验显示PNO1基因表达下调后NCI-H1299细胞趋化能力下降；
图5，A：Invasion侵袭实验显示PNO1基因表达下调后A549细胞侵袭能力下降；
图5，B：Invasion侵袭实验显示PNO1基因表达下调后NCI-H1299细胞侵袭能力下降；
图6，A：划痕愈合实验显示PNO1基因表达下调后A549细胞运动能力下降；
图6，B：划痕愈合实验显示PNO1基因表达下调后NCI-H1299细胞运动能力下降；
图7，A：MTT实验显示PNO1基因的消减抑制A549细胞的增殖能力；
图7，B：MTT实验显示PNO1基因的消减抑制NCI-H1299细胞的增殖能力；
图8，A：细胞克隆形成法检测PNO1基因对A549细胞增殖能力的影响；
图8，B：细胞克隆形成法检测PNO1基因对NCI-H1299细胞增殖能力的影响；
图9，A：Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shPNO1对A549细胞凋亡的影响，左侧为流式细胞凋亡示意图，右侧柱状图结果以细胞百分比平均值±标准差显示；
图9，B：Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shPNO1对NCI-H1299细胞凋亡的影响，左侧为流式细胞凋亡示意图，右侧柱状图结果以细胞百分比平均值±标准差显示。
具体实施方式
除非另外指出，本文中所用术语具有本领域技术人员理解的一般技术含义。对于本领域的定义和术语，特别推荐技术人员参考Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor出版社，Plainsview，New York(1989)；以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，New York(1999)。
术语“RNA结合蛋白PNO1”或“PNO1”优选是指GenBank登录号为NP_064528的蛋白。在本发明中，其序列可以由SEQ ID NO:11表示。除非另外说明，否则术语“RNA结合蛋白PNO1”或“PNO1”还涵盖其不同同种型。
关于RNA结合蛋白PNO1的表达，意指其两个水平上的表达：一为DNA水平上的表达；二为RNA水平上的表达。
术语“过表达”是指当基因表达(转录)的严格控制被打乱时，基因可能不恰当被“关闭”，或以高速度进行转录。高速转录导致大量mRNA产生。对于本发明的RNA结合蛋白PNO1的过表达而言，是指其DNA或RNA表达水平比对照(正常或健康组织/细胞)至少高30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或300％，或者甚至是对照中LETN的表达水平的4、5、6、7、8、9、10倍或以上。
用于检测基因表达水平的技术和试剂是本领域技术人员公知的。在本发明中，优选该试剂选自PNO1的特异性探针(优选核酸探针，带有检测标记，通常与目的基因互补)、基因芯片或用于PCR特异性扩增反应的PCR引物。
术语“降低或抑制RNA结合蛋白PNO1表达”是指将RNA结合蛋白PNO1的表达水平降低至原来的表达水平的80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、15％以下或10％以下，例如5％以下、2％以下、1％以下或甚至0％。在一个实施方案中，通过基因敲除或敲减可以降低或抑制RNA结合蛋白PNO1的表达。
术语“敲除(knock out)”是指一种遗传工程技术，其中利用外源的已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源的正常同源基因，从而使内源基因失活而表现突变体的性状。
术语“敲减(knock down)”是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。其利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。它不同于基因敲除使目标基因永久性的表达沉默，而是通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。
基因敲除或敲减的技术是本领域公知的，包括但不限于，逆转录病毒基因转移，造成突变，例如点突变、插入、删除、移码、或错义突变。可以将基因敲除的另一方式是，使用锌指核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性酶。可以对锌指结构域进行改造以靶向目的DNA序列，这可使锌指核酸酶靶向复杂基因组中的独特序列。其它可用来敲除基因的基因组定制技术有TAL效应物核酸酶(TALENs)。另一种技术是基因组编辑技术CRISPR/Cas系统，其可以被用来实现RNA引导的基因组改造。
实现“降低或抑制RNA结合蛋白PNO1表达”的技术还可以包括使用gapmer、反义RNA、siRNA、esiRNA、shRNA、miRNA或RNA适体。
“反义RNA”是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。可以例如作为表达质粒来递送反义构建体，其中当所述表达质粒在细胞中表达时，产生与细胞RNA结合蛋白PNO1的至少一个独特部分互补的RNA。
反义RNA策略的另一特殊形式是gapmer。Gapmer是嵌合的反义寡核苷酸，其包含长度足以诱导RNase H切割的脱氧核苷酸单体的中心区段(central block)。Gapmer的设计和合成是本领域技术人员公知的并且可以由商业公司(例如，Exiqon，Isispharmaceuticals)完成。
“小干扰RNA(siRNA)”，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度约为20-25个碱基对，其通过RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。它干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。本发明的siRNA可以靶向RNA结合蛋白PNO1靶序列中约19至25个连续核苷酸的任何区段，在本申请中提供了其实例。用于选择siRNA的靶序列的技术在本领域公知的。
“短发夹RNA”(short hairpin RNA，缩写shRNA)是包括两个短反向重复序列的RNA序列，可以经由RNA干扰(RNAi)使基因表现沉默化。
“esiRNA”的英文全名是Endoribonuclease-prepared siRNAs，是通过大肠杆菌的RNase III(一种核糖核酸酶)切割长双链RNA(dsRNA)而生成的siRNA混合物，长度在18-25bp之间，可以用于高效敲除靶标基因的表达水平。
本发明通过免疫组织化学、免疫印迹、实时荧光定量PCR等技术，证实PNO1在肺癌患者中高表达，并通过数据分析证明PNO1高表达与患者的肿瘤分期、生存期等相关。从细胞功能学角度出发证实PNO1基因在肺癌发生及进展中的作用。通过构建目的基因shRNA慢病毒后转染肺腺癌细胞，与转染对照慢病毒作对比，检测两组肺癌细胞系内mRNA及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡等检测，结果显示shRNA组与对照组对比，shRNA组肺癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组，细胞凋亡率增加程度较对照组高。依据上述研究结果，进一步探索，开发针对该基因的诊断治疗新方法，能给肺癌患者的诊断治疗提供更多选择。
具体地，本发明采用如下技术方案：
一、本发明提供了人PNO1基因在制备肺癌(尤其是肺腺癌)诊断试剂或药物中的用途。
所述将人PNO1基因作为靶标用于制备肺癌诊断试剂或药物具体是指：将PNO1基因转录和/或表达产物作为一项肺癌诊断指标应用于肺癌(尤其是肺腺癌)诊断试剂或药物的制备。
所述PNO1基因的转录产物为人PNO1 mRNA，表达产物为人PNO1蛋白。生物信息学分析表明，PNO1蛋白在肺腺癌患者中高表达并与肺腺癌患者高TNM分期及淋巴结转移相关；PNO1 mRNA水平低的患者生存期更长。我们通过免疫组织化学实验、免疫印迹实验以及RT-PCR实验等手段，证明了PNO1在肺腺癌患者肿瘤组织中表达水平高，且与不良预后相关。PNO1是肺腺癌患者的有效生物标志物，可以被作为靶标用于制备肺癌(尤其是肺腺癌)诊断试剂或药物。
所述通过PNO1基因制备获得的肺癌诊断试剂或药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
二、本发明提供人PNO1基因作为靶标在制备肺癌治疗药物中的用途。
所述人PNO1基因作为靶标在制备肺癌治疗药物具体是指：将PNO1基因作为作用对象，对药物或者抑制剂进行筛选，以找到可以抑制人PNO1基因表达的药物作为肺癌治疗备选药物。如本发明所述的PNO1基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人PNO1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肺癌细胞增殖作用的药物。除此之外，还包括可将PNO1基因作为作用对象的抗体药物，小分子药物等。
所述肺癌治疗药物为能够特异性抑制PNO1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制PNO1蛋白的表达或活性的分子，从而降低肺癌细胞中PNO1基因的表达水平，达到抑制肺癌细胞的增殖、生长、分化、迁移、侵袭和/或存活的目的。
所述通过PNO1基因制备获得的肺癌治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、小向导RNA(sgRNA)、核酶、小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。
所述肺癌治疗药物的施用量为足够降低人PNO1基因的转录或翻译，或者足够降低人PNO1蛋白的表达或活性的剂量，以使人PNO1基因的表达被降低50％-100％。
采用前述肺癌治疗药物治疗肺癌的方法，主要是通过降低人PNO1基因的表达水平抑制肺癌细胞的增殖与转移来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人PNO1基因表达水平的物质给药于患者。
三、提供PNO1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：
治疗肺癌；
抑制肺癌细胞侵袭；
抑制肺癌细胞迁移；
抑制肺癌细胞的增殖速率；
抑制肺癌细胞克隆形成；
抑制肺癌细胞生长；
促进肺癌细胞凋亡。
所述产品包括PNO1抑制剂，并以PNO1抑制剂作为前述功效的有效成分。
所述产品中，PNO1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述PNO1抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。如本发明实施例列举的，所述PNO1抑制剂可以为降低肺癌细胞中PNO1基因表达的核酸分子。具体的，可以是双链RNA或shRNA。
四、本发明公开了一种降低肺癌细胞中PNO1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。
其中，所述双链RNA和shRNA中含有能够与人PNO1基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PNO1基因中的靶序列基本相同。
所述PNO1基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默PNO1基因表达时，被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的PNO1基因中的片段。
进一步的，所述双链RNA的靶序列如SEQ ID NO:1所示。具体为：5’-GCTGAACAATTTCAGTCATTT-3’。更进一步的，所述双链RNA第一链的序列如SEQ ID NO:2所示。具体为5’-GCUGAACAAUUUCAGUCAUUU-3’。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。
SEQ ID NO:2为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人PNO1基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肺癌细胞中内源PNO1基因表达的作用。
所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PNO1基因中的靶序列基本相同。所述sh RNA的靶序列如SEQ ID NO:1所示。
所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默肺癌细胞中内源PNO1基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。
更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:3所示。具体为5’-CCGGGCTGAACAATTTCAGTCATTTCTCGAGAAATGACTGAAATTGTTCAGCTTTTTG-3’。
五、本发公开了一种PNO1基因干扰核酸构建载体，含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
本发明公开的PNO1基因干扰慢病毒载体是将编码前述PNO1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述PNO1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肺癌细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默PNO1基因的表达。
进一步的，所述PNO1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肺癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、Tet-pLKO-puro、Tet-pLKO-neo、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以pGCSIL-puro为载体构建的人PNO1基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-puro-PNO1-siRNA。
本发明的PNO1基因siRNA可用于抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进一步地可以用作治疗肺癌的药物或制剂。PNO1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述PNO1基因siRNA。当用作治疗肺癌的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于包含人在内的哺乳动物。
六、本发明公开了一种PNO1基因干扰慢病毒。
所述PNO1基因干扰慢病毒由前述PNO1基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肺癌细胞并产生针对PNO1基因的小分子干扰RNA，从而抑制肺癌细胞的增殖。该PNO1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肺癌的药物。
七、本发明提供前述核酸分子，或前述PNO1基因干扰核酸构建体，或前述PNO1基因干扰慢病毒的用途为：用于制备预防或治疗肺癌的药物，或用于制备降低肺癌细胞中PNO1基因表达的试剂盒。
所述预防或治疗肺癌的药物的应用为肺癌的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肺癌的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。
进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内肺癌时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述肺癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肺癌的生长、增殖、复发和/或转移的10％-99％的部分被抑制。
所述药物的有效物质含有：前述的核酸分子；和/或前述PNO1基因干扰核酸构建体；和/或前述PNO1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
综上所述，本发明提供了人PNO1基因及其表达产物作为肺癌(尤其是肺腺癌)诊断的生物标志物的可行性证据。设计了针对人PNO1基因的RNAi靶点序列，构建相应的PNO1RNAi载体，其中RNAi载体pGCSIL-puro-PNO1-siRNA能够显著下调PNO1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-puro-PNO1-siRNA能够靶向地将针对PNO1基因的RNAi序列高效导入肺癌A549、NCI-H1299细胞，降低PNO1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的PNO1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究发现，采用RNAi方法下调人PNO1基因的表达后可有效地抑制肺癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，可以有效地控制肺癌的生长和转移。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制肺癌细胞的增殖速率、促进肺癌细胞凋亡、抑制肺癌细胞克隆、抑制肺癌细胞侵袭、抑制肺癌细胞转移、抑制肺癌生长，从而治疗肺癌，为肺癌治疗开辟新的方向。此外，本发明通过免疫组织化学、免疫印迹以及实时荧光定量RCR等方法证明了PNO1在肺腺癌患者中高表达并且与不良预后相关，因此可以作为肺腺癌诊断的生物标志物，为肺癌诊断试剂或药物的开发提供了依据。
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
实施例1.免疫组织化学法检测肺癌患者肿瘤组织PNO1表达水平
在石蜡包埋的LADC(来源于天津医科大学肿瘤医院病理科)样本中应用免疫组化法(一抗Anti-PNO1 Antibody，品牌LifeSpan，货号LS-C179090；二抗为兔二步法试剂盒，品牌中杉金桥，货号PV-6001)检测肿瘤细胞内PNO1的表达水平，进行免疫组化评分的建立，进一步分析PNO1表达水平与生存预后间及临床病理学指标之间的关系。免疫组化评分细则：免疫组化的染色强度划分区域在0-3之间(0表示没有产生免疫反应，1表示产生弱免疫反应，2表示产生中强免疫反应，3表示产生强免疫反应)；免疫组化的染色百分比划分区域在0-3之间(0表示没有发现阳性细胞，1表示发现30％以下的阳性细胞，2表示发现30-60％的阳性细胞，表示发现60％以上的阳性细胞)。免疫组化的染色强度评分与百分比评分的乘积为最终免疫组化评分。应用SPSS25.0中的单因素Kplan-Meier法以及多因素Cox法分析影响LADC患者预后的独立危险因素及生存函数。
结果如图1，A-C所示，PNO1在不同LADC患者中的表达水平不同，PNO1是影响LADC患者的独立危险因素。
实施例2.Western Blotting检测肺癌患者肿瘤组织与癌旁组织中PNO1表达水平
将手术切除的新鲜肺癌样本(肺腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织，来源于天津医科大学肿瘤医院)置于液氮中冻存后，用组织蛋白提取仪提取组织蛋白。蛋白提取使用RIPA裂解液裂解细胞，提取全蛋白，BCA法测定蛋白浓度。分别取各组蛋白与10％SDS-PAGE凝胶电泳分离，分离后将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭l小时。加入一抗(Anti-PNO1Antibody，品牌LifeSpan，货号LS-C179090)4℃摇床孵育过夜。洗膜后加对应的二抗(GoatAnti-Rabbit IgG-HRP，品牌Santa Cruz，货号sc-2357)(1:4000)，室温孵育1小时。洗膜后以ECL法曝光显影并进行图像分析。应用Western Blot检测LADC患者的癌组织和癌旁组织中PNO1在蛋白水平的表达差异；进一步分析同一患者的癌旁组织、癌组织中PNO1在蛋白水平间的表达差异。
结果如图2，A所示，PNO1在8例配对的肺腺癌肿瘤和癌旁组织的蛋白水平上具有表达差异，且在肿瘤组织中高表达。
实施例3.RT-PCR检测肺癌患者肿瘤组织与癌旁组织中PNO1 mRNA水平
将手术切除的新鲜肺癌样本(肺腺癌患者肿瘤组织及癌旁组织，来源于天津医科大学肿瘤医院)置于液氮中冻存后，待提取mRNA时用研钵研磨，用TRIzol试剂(Invitrogen)来提取肺癌组织内总RNA，并进行反转录，所得cDNA用
Figure BDA0002434676020000131
Premix Ex TaqTM(PerfectReal Time)试剂(TaKaRa)根据其说明书进行实时定量PCR，上游引物5’-GGCTCCTGAGTGGGAAAGAA-3’(SEQ ID NO:7)和下游引物5’-CAAGTGCATCCTCCACCTGA-3’(SEQID NO:8)。检测PNO1在癌及其相应癌旁组织中mRNA水平的表达差异。
结果如图2，B所示，PNO1在8例配对的肺腺癌肿瘤和癌旁组织的RNA水平上具有表达差异，且在肿瘤组织中高表达。
实施例4.针对人PNO1基因siRNA慢病毒的制备
1.筛选针对人PNO1基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取人PNO1(NM_020143)基因信息；设计针对PNO1基因的有效的siRNA靶点。表1-1列出了筛选出的针对PNO1基因的有效siRNA靶点序列。
表1-1 靶向于人PNO1基因的siRNA靶点序列
SEQ ID NO TargetSeq(5’-3’)
1 GCTGAACAATTTCAGTCATTT
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点(以SEQ ID NO:1为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNAOligo序列(表1-2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-puro(购于上海吉凯基因化学技术有限公司)载体，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表1-2 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNAOligo
Figure BDA0002434676020000141
通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表1-3所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNAOligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表1-4所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，过夜振荡培养，提取质粒后进行质粒测序，测序引物序列：5’-GTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGG-3’(SEQ ID NO:6)，进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO:1的表达siRNA的载体，命名为pGCSIL-puro-PNO1-siRNA(以下也称为PNO1-siRNA慢病毒)。
表1-3 pGCSIL-puro质粒酶切反应体系
试剂 体积(μl)
pGCSIL-puro质粒(1μg/μl) 2.0
10×buffer 5.0
100×BSA 0.5
Age I(10U/μl) 1.0
EcoR I(10U/μl) 1.0
dd H<sub>2</sub>O 40.5
总共 50.0
表1-4 载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系
试剂 阳性对照(μl) 自连对照(μl) 连接组(μl)
线性化的载体DNA(100ng/μl) 1.0 1.0 1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) 1.0 - 1.0
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0
T4噬菌体DNA连接酶 1.0 1.0 1.0
dd H<sub>2</sub>O 16.0 17.0 16.0
总共 20.0 20.0 20.0
3.包装PNO1-siRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-puro-PNO1-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ IDNO:2所示。对照慢病毒(Scr-siRNA慢病毒)的包装过程同PNO1-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-puro-Scr-siRNA载体，代替pGCSIL-puro-PNO1-siRNA载体。
构建pGCSIL-puro-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。构建pGCSIL-puro-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNAOligo序列(表1-5)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-puro-PNO1-siRNA。
表1-5 两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
Figure BDA0002434676020000161
实施例5.检测侵染了PNO1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的沉默效率
处于对数生长期的人肺癌A549、NCI-H1299细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数值(MOI，A549：10、NCI-H1299：10)，加入适宜量的实施例4制备的慢病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。
a)实时荧光定量RT-PCR法检测基因的沉默效率
根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表2-1，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。PNO1基因的引物如下：上游引物5’-GGCTCCTGAGTGGGAAAGAA-3’(SEQ ID NO:7)和下游引物5’-CAAGTGCATCCTCCACCTGA-3’(SEQ ID NO:8)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO:9)和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO:10)。按表2-2中的比例配置反应体系。
表2-1 逆转录反应体系
Figure BDA0002434676020000162
Figure BDA0002434676020000171
表2-2 Real-time PCR反应体系
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq 6.0
引物MIX(5μM) 0.3
cDNA 0.6
ddH<sub>2</sub>O 5.1
总共 12.0
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了PNO1 mRNA的表达丰度。侵染对照病毒的细胞作为对照。实验结果如图3，A(左)和图3，B(左)所示，表明人肺癌A549细胞中PNO1 mRNA的表达水平下调了50％左右；肺癌NCI-H1299细胞中PNO1 mRNA的表达水平下调了70％左右。
b)Western Blotting法检测基因的沉默效率
1.细胞总蛋白抽提
(1)接收细胞样品，PBS洗涤两次。取适当量的RIPA裂解液，使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
(2)加入适当量的RIPA裂解液，冰上裂解10-15min。细胞刮刮下细胞转移入新的EP管中，然后超声破碎细胞(40W共20次，每次1s，间隔2s)。
(3)4℃、12000g，离心15min，取上清BCA法测定蛋白浓度。
(4)加入新的裂解液将每个样品蛋白浓度调为一致，一般为2μg/μL。然后加入1/5体积的6X lodding buffer混匀，100度金属浴煮10min，短暂离心后-80℃保存备用。
2.SDS-PAGE
(1)制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如下：
表3-1 8mL不同浓度分离胶组分
Figure BDA0002434676020000181
表3-2 10mL不同浓度分离胶组分
Figure BDA0002434676020000182
表3-3 不同浓度5％浓缩胶组分
Figure BDA0002434676020000183
(2)上样：胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。
(3)电泳：浓缩胶80mA，20min；分离胶120mA，1h。
3.免疫印迹(湿转)
电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。
4.抗体杂交：
(1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜。
(2)一抗(Anti-PNO1 Antibody，品牌LifeSpan，货号LS-C179090)孵育：封闭液稀释抗体，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，并用TBST洗膜4次，每次8min。
(3)二抗(Goat Anti-Rabbit IgG-HRP，品牌Santa Cruz，货号sc-2357)孵育：用封闭液稀释相应的二抗，室温下孵育PVDF膜1.5h，并用TBST洗膜4次，每次8min。
5.X光显影：(采用CST公司20X Lumi
Figure BDA0002434676020000191
Reagent and 20X Peroxide#7003试剂盒)
(1)将试剂盒中A液和B液按1:1比例混合颠倒混匀，放置数分钟后可使用。
(2)将膜取出，吸水纸擦干，平铺入暗盒，滴加适量混匀的ECL发光液，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1s-数min(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)。
(3)取出X光片，放入显影液中，出现条带后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min。
(4)取出X光片，晾干，分析。
结果如图3，A(右)和图3，B(右)所示，表明两个靶点对目的基因的内源表达有敲减作用，因而是有效靶点。
实施例6.侵染PNO1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞趋化运动能力检测
1.Migration趋化实验
将人肺癌A549、NCI-H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5μg/ml polybrene。将以上实施例4制备的PNO1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI，A549：10、NCI-H1299：10)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到80％。
取出试剂盒，将所需数目的小室置于新的24孔板中，上室加100μL无血清培养基，37℃培养箱中放置1h。制备无血清细胞悬浮液，并计数，细胞数根据预实验调整，一般为8*104/孔(24孔板)。小心除去上室中培养基并加入100μL细胞悬液，下室内加入600μL 30％FBS培养基。同时，使用该细胞悬液铺一块MTS96孔板，每孔约接种5000个细胞，接种后即测定OD570，作为转移参照。37℃培养箱培养一段时间(具体时间根据预实验调整)。倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞，滴2-3滴Giemsa染色液到膜的下表面染色转移细胞3-5min后，将小室浸泡冲洗数次，空气晾干。显微镜拍照：每个transwell小室，随机选取视野，拍100X照片4张，200X照片9张。以200X的照片来计数，进行数据分析，比较实验组与对照组细胞转移能力的差异：计算各组转移细胞数(Migratorycells per field)，标准差，T-Test分析得到p值，判断是否有显著性差异(p<0.05，有显著性差异，否则无显著性差异)。
结果如图4，A和图4，B所示，表明与对照干扰(sh-Ctrl组：感染Scr-siRNA慢病毒组)相比，RNA干扰降低PNO1基因的表达(sh-PNO1组)后，肿瘤细胞的趋化能力降低。
2.划痕愈合实验
将人肺癌A549、NCI-H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5μg/ml polybrene。将以上实施例4制备的PNO1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI，A549：10、NCI-H1299：10)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到80％。
按照实验设计的组别(sh-PNO1：感染PNO1-siRNA慢病毒组，sh-Ctrl：感染Scr-siRNA慢病毒组)，在孔中加入约5×104个感染后的细胞，以次日细胞达到90％以上汇合度为准。第二天换低浓度血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕。使用无血清培养基轻轻漂洗2-3遍，加入低浓度血清培养基(如0.5％FBS)，拍照。37℃、5％CO2培养箱培养，根据预实验选择合适的时间点拍照(一般可选择0h、8h、16h、24h等)。荧光显微镜拍照(以96孔中心阴影区域为参照，划痕在图片的正中。)根据划痕后的图片，计算各组细胞迁移率。
结果如图5，A和图5，B所示，表明与对照干扰(sh-Ctrl组)相比，RNA干扰降低PNO1基因的表达(sh-PNO1组)后，肿瘤细胞的运动能力降低。
实施例7.侵染PNO1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞侵袭水平检测
将人肺癌A549、NCI-H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5μg/ml polybrene。将以上实施例4制备的PNO1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI，A549：10、NCI-H1299：10)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到80％。
侵袭室放到培养箱中使其达到室温；用70％乙醇消毒镊子，用镊子处理transwell小室；加300μl温无血清培养基到小室内，室温放置1～2h使ECM层(ExtracellularMatrix)再水化；准备1.0×106/ml(用无血清培养基)细胞悬液；在步骤3再水化后，从小室内小心移去培养基；加500μl含10％FBS的培养基于下室中；加300μl步骤4准备好的细胞悬液到每个小室中；在组织培养箱中培养48h；用棉拭子轻轻移去非-侵袭细胞；加500μl染色液到板的空孔中；将小室浸泡在染色液中20min，在膜的下表面染色侵入细胞；浸泡小室在一个大的水杯中，冲洗数次。空气中晾干小室显微镜拍照：每个小室，随机选取视野，拍100X照片4张，200X照片9张。以200X的照片来计数，进行数据分析，比较实验组与对照组细胞侵袭能力的差异：计算各组侵袭转移细胞数(Migratory cells per field)，标准差，T-Test分析得到p值，判断是否有显著性差异异(p<0.05，有显著性差异，否则无显著性差异)。
结果如图6，A和图6，B所示，与对照干扰(sh-Ctrl组(感染Scr-siRNA慢病毒组))相比，RNA干扰降低PNO1基因的表达(sh-PNO1组(感染PNO1-siRNA慢病毒组))后，肿瘤细胞的侵袭能力降低。
实施例8.MTT法检测侵染了PNO1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人肺癌A549、NCI-H1299细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，A549：10、NCI-H1299：10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，收集处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(2000个细胞/孔)，每组3-5重复，统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如：发现对照组(sh-Ctrl组)细胞较多，降低细胞量再次铺板)，放入细胞培养箱中培养。从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液。4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μL DMSO溶解甲瓒颗粒。振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值。数据统计分析。
结果如图7，A和图7，B所示，结果表明，慢病毒侵染肿瘤后(sh-PNO1组)，增殖速度显著减缓，远低于对照组(sh-Ctrl组)肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了54.4％(A549)、66.3％(NCI-H1299)，表明PNO1基因沉默导致人肺癌A549、NCI-H1299细胞增殖能力被抑制。
实施例9.侵染PNO1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测
将人肺癌A549、NCI-H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5μg/ml polybrene。将PNO1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI，A549：10、NCI-H1299：10)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到80％。
将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；细胞计数后接种于6孔板中(800个细胞/孔)，将接种好的细胞于培养箱中继续培养到8天，中途隔3天进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；实验终止时用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤细胞后，Giemsa染色，拍照。
结果如图8，A和图8，B所示，与对照干扰(sh-Ctrl组)相比，RNA干扰降低基因的表达(sh-PNO1组)后，人肺癌A549、NCI-H1299细胞形成的克隆数目显著减少、克隆的体积明显减小；表明PNO1基因沉默导致人肺癌A549、NCI-H1299细胞形成克隆的能力下降。平板克隆形成实验检测降低基因的表达后，肿瘤细胞的克隆形成能力下降。
实施例10.侵染PNO1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞凋亡水平检测
人肺癌A549、NCI-H1299细胞胰酶消化后接种于6孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基。将PNO1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI，A549：10、NCI-H1299：10)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染120h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；与上清细胞收集于同一5mL离心管中，每组设三个复孔(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×105/处理)。1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀。1×结合缓冲液洗涤细胞沉淀一次，1300rmp、3min离心，收集细胞。200μL 1×结合缓冲液重悬细胞沉淀。加入10μLAnnexin V-APC染色，室温避光10-15min。根据细胞量，补加400-800μL 1×结合缓冲液，上流式细胞仪进行检测。对结果进行分析。
如图9，A和图9，B所示，表明下调基因表达后肿瘤细胞的凋亡比例增加。与对照干扰(sh-Ctrl组)相比，RNA干扰降低基因的表达(sh-PNO1组)后，凋亡肿瘤细胞数显著增多，表明基因沉默导致肿瘤细胞凋亡。
本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。
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Claims (10)

1.检测RNA结合蛋白PNO1的基因转录(mRNA)水平或蛋白表达水平或生物活性水平的试剂在制备肺癌的诊断剂或诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述试剂为针对PNO1基因的特异性探针、基因芯片或PCR引物。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述肺癌为小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，和/或选自腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其中所述PNO1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，更优选其编码PNO1基因如SEQ ID NO:12所示。
5.降低或抑制RNA结合蛋白PNO1的基因转录(mRNA)水平或蛋白表达水平或生物活性水平的试剂在制备肺癌的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中降低或抑制RNA结合蛋白PNO1的基因转录(mRNA)水平或蛋白表达水平或生物活性水平的试剂选自由以下组成的组：gapmer、反义RNA、siRNA(优选其针对的PNO1基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示，并且第一链的序列如SEQ ID NO：2所示)、esiRNA、shRNA(优选其针对的PNO1基因中的靶序列如SEQ ID NO：1所示，更优选所述shRNA的序列如SEQ ID NO：3所示)、miRNA、RNA适体、TALEN、CRISPR、锌指核酸酶、单克隆或多克隆抗体和小分子化合物。
7.根据权利要求5所述的应用，其中所述肺癌为小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)，和/或选自腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌，优选地所述PNO1的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，更优选其编码PNO1基因如SEQ ID NO:12所示。
8.根据权利要求6所述的应用，其中所述试剂被包装为慢病毒的形式。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的应用，其中所述药物还包含另外的抗肺癌药，例如化疗药。
10.一种筛选抗肺癌药物的方法，所述方法包括下述步骤：
1)确定过表达PNO1的细胞中PNO1的表达水平(即基因转录(mRNA)水平、蛋白表达水平或生物活性水平)；
2)将候选化合物与步骤1)的细胞接触；
3)确定在步骤2)后细胞中PNO1的表达水平；和
4)比较步骤1)和步骤3)中确定的PNO1的表达水平，其中PNO1的表达水平降低指示所述候选化合物具有抗肺癌潜力，
优选所述细胞为肺癌细胞。
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