CN111088357B - 针对escc的肿瘤标志物及其应用 - Google Patents

针对escc的肿瘤标志物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111088357B
CN111088357B CN201911417599.8A CN201911417599A CN111088357B CN 111088357 B CN111088357 B CN 111088357B CN 201911417599 A CN201911417599 A CN 201911417599A CN 111088357 B CN111088357 B CN 111088357B
Authority
CN
China
Prior art keywords
escc
gene
ctd
cells
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911417599.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111088357A (zh
Inventor
翟日洪
杨林
丁培堃
杨文瀚
郑文靖
宋译
王亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen University
Original Assignee
Shenzhen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen University filed Critical Shenzhen University
Priority to CN201911417599.8A priority Critical patent/CN111088357B/zh
Publication of CN111088357A publication Critical patent/CN111088357A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111088357B publication Critical patent/CN111088357B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种针对食管磷癌(ESCC)的肿瘤标志物及其应用。本发明提供的肿瘤标志物，为具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA(lncRNA)，该lncRNA在ESCC病人血浆外泌体、ESCC癌组织以及ESCC细胞中的表达水平均分别显著高于健康人血浆外泌体、癌旁组织以及正常食管上皮细胞。同时，该lncRNA具有显著的促进ESCC细胞肿瘤增殖、迁移及侵袭的能力；在ESCC细胞中敲除该lncRNA后可显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移及侵袭的能力。因而，本发明提供的如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA，可作为一种肿瘤标志物，为食管癌患者的预后评估以及治疗效果的监测提供有效信息，并为其个体化治疗的靶点选择提供依据，具有重要的临床应用价值。

Description

针对ESCC的肿瘤标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种针对ESCC的肿瘤标志物及其应用。
背景技术
食管癌是全球肿瘤致死的第六大病因，而中国食管癌的发病率和病死率均居世界之首。食管癌的病理类型主要有鳞癌和腺癌，其中90%的病例是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）。由于早期症状不具有特异性容易被忽视，而且现行临床ESCC诊断方法如X线钡餐造影等容易漏诊早期病变，因而大部分ESCC患者确诊时已经是中晚期。另外，由于目前对食管癌的治疗手段非常有限，因此，患者的预后较差，其总的5年生存率不足17%。但是，与中晚期食管鳞癌不同的是，现有的治疗方法对早期ESCC患者治疗的5年生存率可达90%以上。因此，探索食管癌早期诊断和预后的分子标记物，研究食管癌新的治疗靶点，具有重要的潜在临床价值。
长链非编码RNA （long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸序列的RNA聚合酶II的转录产物，位于细胞核或细胞质内。由于lncRNA缺乏明显的开放阅读框，不具有编码蛋白质的功能,起初它们被认为是转录过程中的“噪音”。但近年来的研究表明，lncRNAs在多种肿瘤中异常表达，在细胞的增殖、迁移、凋亡及转移过程中发挥重要的调控作用。在肿瘤生长过程中，lncRNA可以直接以RNA形式通过多种层面参与蛋白质编码基因的表达调控，如染色质修饰、表观遗传标记、控制基因转录以及结合mRNA发挥转录后调控等。深入探索lncRNA与肿瘤发生发展的关系及其作用机理将有可能为发现肿瘤新的发病机制及发现新的治疗靶标提供科学依据。
研究发现在食管癌细胞中存在多种异常表达的lncRNAs，分别发挥促癌或抑癌作用。目前已经发现具有促癌作用的lncRNAs有AFAPI-AS1、MALAT1、HOTAIR、TUG1、PlncRNA-1等。而MEG3、ZNF667-AS1、LincRNA-p21等lncRNAs则被发现具有抑癌的作用。例如，HOTAIR在ESCC癌组织中表达显著升高，并且和瘤体大小、临床分期、淋巴结转移等呈正相关，与瘤体分化程度及5年生存率呈负相关。PlncRNA-1在ESCC组织中高表达，其高表达与肿瘤的临床分期及淋巴结转移呈正相关；敲除PlncRNA-1则能抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。AFAP1-AS1在食管癌中极度低甲基化和过表达，利用siRNA沉默AFAP1-AS1的表达后可以在不改变对应编码蛋白AFAP1的情况下抑制食管癌细胞的增殖、侵润和转移的能力，诱发细胞凋亡。然而，目前对lncRNA与ESCC的关系的研究尚处于起步阶段，大多数已知的lncRNAs的功能及机制有待进一步研究挖掘。
由于lncRNA已被证实在肿瘤的发生发展中起多重调节作用，阐明它们的作用及机制，针对lncRNA作用的特异靶点开发肿瘤新药具有很大的潜在价值。 RNA干扰（RNAi）导致的基因沉默对定位于细胞核的lncRNAs有良好的靶向作用，包括siRNA、shRNA反义寡核苷酸（ASO）等效应分子。其中，siRNA由于结构简单，效率高被广泛应用，双链的siRNA在细胞内被RNase III水解为单链后结合沉默复合体RISC，并由RISC中的Argonaute 2蛋白介导靶基因的降解。在乳腺癌中使用siRNA干扰掉HOTAIR分子可以显著减少乳腺癌细胞在基质中的侵润。在肝癌细胞中用siRNA敲除HULC和MALAT1分子可以减少癌细胞增殖，引起细胞周期停滞。ASO是针对特异的靶基因设计的单链RNA或DNA，其通过序列互补结合RNA靶标，并招募RNase H1降解RNA。有报道指出在肺癌小鼠中注射靶向MALAT1的ASO会导致该基因表达下调，并抑制肿瘤转移过程。靶向CCAT1-L的ASO可下调结肠癌细胞内MYC等原癌基因的表达。近年来，CRISPR/Cas9 基因编辑技术异军突起，为高效敲除基因提供了新的手段。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过向导RNA（guide RNA, gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，细胞随之利用非同源末端连接或者同源重组方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。这些新的基因编辑技术为以lncRNA为靶点开发抗肿瘤药物提供了广阔的前景。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种肿瘤标志物，旨在为ESCC个体化精准治疗方案提供新的靶点。
本发明的另一目的在于提供上述肿瘤标志物的应用，又一目的在于提供一种试剂，再一目的在于提供一种细胞株。
本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明实施例提供了一种肿瘤标志物，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA。
第二方面，本发明实施例提供了上述肿瘤标志物在如下a1-a4至少一种中的用途：
a1、作为肿瘤的诊断标志物，或者应用于肿瘤诊断的产品；
a2、作为肿瘤的预后标志物，或者制备用于肿瘤预后评估的产品；
a3、制备用于肿瘤疗效监测的产品；
a4、制备用于治疗肿瘤的产品。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂，用于敲除肿瘤细胞中的上述肿瘤标志物，所述试剂包括：针对于所述肿瘤标志物的向导RNA。
第四方面，本发明实施例提供了一种细胞株，所述细胞株为稳定敲除了如SEQ IDNo.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA的肿瘤细胞。
本发明提供的肿瘤标志物，为具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA（lncRNA），该lncRNA在ESCC病人血浆外泌体、ESCC癌组织以及ESCC细胞中的表达水平均分别显著高于健康人血浆外泌体、癌旁组织以及正常食管上皮细胞。同时，通过采用CCK8实验、细胞迁移试验和细胞划痕实验等方法进行研究，发现该lncRNA具有显著的促进ESCC肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的能力。而且，在ESCC细胞中敲除该lncRNA后可显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移及侵袭的能力。因而，本发明提供的如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA，可作为一种肿瘤标志物，为食管癌患者的预后评估以及治疗效果的监测提供有效信息，并为其个体化治疗药物或制剂的研发提供新的靶点。
本发明提供的上述肿瘤标志物的用途，通过采用该肿瘤标志物作为肿瘤的诊断标志物或预后标志物，以应用在制备肿瘤诊断的产品、肿瘤预后评估的产品、肿瘤疗效监测的产品以及治疗肿瘤的产品中。也可以为食管癌患者的预后评估以及治疗效果的监测提供有效信息，并为其个体化治疗的选择提供依据，具有重要的临床应用价值。
本发明提供的试剂，用于敲除肿瘤细胞中的上述肿瘤标志物，包括：针对于上述肿瘤标志物的向导RNA。研究结果表明，采用该向导RNA来沉默上述肿瘤标志物的表达，有利于抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，为食管癌的针对性治疗提供了新的靶点，具有应用于制备治疗肿瘤的产品的潜在价值。
本发明提供的细胞株，为稳定敲除了如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA的肿瘤细胞，通过利用该细胞株，能够实现对该lncRNA基因功能的进一步研究，有利于阐明食管癌的发生、发展机制，为食管癌的针对性治疗提供科学依据。
附图说明
图1为ESCC患者和正常对照组的血浆外泌体中CTD-2017C7.1基因表达水平差异结果；
图2为CTD-2017C7.1基因在癌组织和癌旁组织的表达水平差异结果；
图3为CTD-2017C7.1基因在癌细胞系和正常食管上皮细胞的表达水平差异结果；
图4为CTD-2017C7.1基因在癌细胞的细胞核和细胞浆中的表达水平差异结果；
图5为CTD-2017C7.1过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro的图谱；
图6为CTD-2017C7.1过表达TE-1细胞、空载PCDH对照TE-1细胞和TE-1细胞的CTD-2017C7.1基因相对表达水平差异结果；
图7为CTD-2017C7.1过表达促进ESCC细胞增殖的实验结果图；
图8为CTD-2017C7.1过表达促进ESCC细胞迁移的实验结果图；
图9为CTD-2017C7.1过表达促进ESCC细胞侵袭的实验结果图；
图10为gRNA-Y6560对CTD-2017C7.1基因敲除效果的实验结果图；
图11为敲除CTD-2017C7.1基因后抑制ESCC细胞增殖的实验结果图；
图12为敲除CTD-2017C7.1基因后抑制ESCC细胞迁移的实验结果图；
图13为敲除 CTD-2017C7.1基因后抑制ESCC细胞侵袭的实验结果图；
图14为gRNA-Y6560的序列信息。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种肿瘤标志物，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA。
本发明实施例提供的肿瘤标志物，为具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA（lncRNA），该lncRNA在ESCC病人血浆外泌体、ESCC癌组织以及ESCC细胞中的表达水平均分别显著高于健康人血浆外泌体、癌旁组织以及正常食管上皮细胞。同时，通过采用CCK8实验、细胞迁移试验和细胞划痕实验等方法进行研究，发现该lncRNA具有显著的促进ESCC肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭的能力。而且，在ESCC细胞中敲除该lncRNA后可显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移及侵袭的能力。因而，本发明提供的如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA，可作为一种肿瘤标志物，为食管癌患者的预后评估以及治疗效果的监测提供有效信息，并为其个体化治疗药物或制剂的研发提供新的靶点。
具体地，所述长链非编码RNA的 ENSG ID为: ENSG00000256705.3，在本申请说明书中表示为CTD-2017C7.1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：
AGGCGTGCACTGGTGAAGCCTCACCAGCTCAGGTCAGGGTGTCCACAGGTGCCTGTGGAGTAGGGGCACAGATGGGGAAGAAGAGGACTGGCAGGAAGTCGTCGCAGGCTGTTCTCACAGGCCCTGTGCCACCTGTGGTCACGTAACTTGACTCTGGAAATGAGTGTTCTTTTTTTTTTTTGGAGACAGAGTCTTGCTCCGTTGCCTAGGTTGGAGTGCAGTGGTGCGATCTTGGCTTACTGCAACGTCCGCCTCCCGGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGCAGCTGGGATTACAGGCATGTGCCACCACTCCCGGCTAATTTTGTATTTTTAGCAGAAATGGGATTTCACCATGTTGGCTAGGCTGGTCTCGAACTTCTGACCTCAGATGATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCCACCGCACCCGGCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTCTAATTTGAGACAGAGTCTTGCTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTTCAGTGGTGCAATCTCGGCTCACTGCAACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGATAACAG。
作为一种实施方式，所述肿瘤为食管癌。在一些实施例中，所述食管癌包括食管鳞癌（esophagealsquamouscellcarcinoma,ESCC）。
在本申请人的前期研究过程中，创造性地发现了CTD-2017C7.1基因在ESCC病人血浆外泌体和健康人群血浆外泌体中显著差异表达，并通过进一步采用qRT-PCR方法证实了CTD-2017C7.1基因在ESCC癌组织中的表达显著高于癌旁组织，CTD-2017C7.1基因在多种ESCC细胞中的表达也明显高于正常食管上皮细胞。同时，本申请人通过采用CCK8实验、细胞迁移试验和细胞划痕实验等方法进行研究，发现CTD-2017C7.1基因表达升高能够促进多种ESCC细胞的肿瘤活性，包括增殖、迁移和转移。另外，当敲除CTD-2017C7.1基因时能够抑制ESCC细胞增殖、抑制ESCC细胞迁移和转移。因而，CTD-2017C7.1基因具有显著的促进ESCC细胞肿瘤活性的能力，为一种新发现的致癌lncRNA活性分子，可作为一种肿瘤标志物，为食管癌患者的预后评估以及治疗效果的监测提供有效信息，并为其个体化治疗的选择提供靶点。
作为一种实施方式，所述肿瘤标志物来源于正常人或肿瘤病人的血浆外泌体，或所述肿瘤标志物来源于肿瘤病人的癌组织或癌旁组织。该肿瘤标志物在ESCC病人的血浆外泌体、癌组织和癌细胞中高表达，均分别显著高于健康人血浆外泌体、癌旁组织以及正常食管上皮细胞。可通过检测该肿瘤标志物在ESCC病人的血浆外泌体、癌组织和癌旁组织中的表达水平来监测ESCC病人的治疗效果以及预后评估，为ESCC个体化精准治疗的新方案提供了新的靶点。
所述肿瘤标志物的制备，可采用TRIZOL试剂提取ESCC病人的血浆外泌体、癌组织和癌旁组织的总RNA，然后采用特定引物结合qRT-PCR反应扩增总RNA中的肿瘤标志物，并分析获得该肿瘤标志物的表达水平。其中，qRT-PCR反应中所使用到的酶和试剂可参考本领域常规技术，本发明实施例不一一赘述。
可以理解的，qRT-PCR反应中所使用的引物对对肿瘤标志物的扩增具有重要作用。作为一种实施方式，所述特定引物对包括：如SEQIDNo.2所示序列的上游引物，以及如SEQIDNo.3所示序列的下游引物。
SEQIDNo.2：GGAAGTCGTCGCAGGCTGTT；
SEQIDNo.3：GGCAGGAGAATCACTTGAACCC。
基于上述技术方案，本发明实施例还提供了上述肿瘤标志物的应用、一种试剂和一种细胞株。
相应地，上述肿瘤标志物在如下a1-a4至少一种中的用途：
a1、作为肿瘤的诊断标志物，或者应用于肿瘤诊断的产品；
a2、作为肿瘤的预后标志物，或者制备用于肿瘤预后评估的产品；
a3、制备用于肿瘤疗效监测的产品；
a4、制备用于治疗肿瘤的产品。
本发明实施例提供的上述肿瘤标志物的用途，通过采用该肿瘤标志物作为肿瘤的诊断标志物或预后标志物，以应用在制备肿瘤诊断的产品、肿瘤预后评估的产品、肿瘤疗效监测的产品以及治疗肿瘤的产品中，为食管癌患者的预后评估以及治疗效果的监测提供有效信息，并为其个体化治疗的选择提供依据，具有重要的临床应用价值。
具体地，上述肿瘤标志物在上述a1-a3的用途中，待测样本为血浆外泌体、癌组织或癌旁组织。该肿瘤标志物在ESCC病人的血浆外泌体、癌组织和癌旁组织中高表达，通过检测该肿瘤标志物的表达水平，可实现对ESCC病人的肿瘤预后评估和肿瘤疗效进行有效监测，为其个体化治疗的选择提供依据，具有重要的临床应用价值。
具体地，上述肿瘤标志物在上述a4的用途中，待测样本为血浆外泌体、癌组织或癌旁组织。通过检测ESCC病人使用了治疗该肿瘤的产品后的上述肿瘤标志物的表达水平，对于筛选合适的试剂盒或药物以应用于预防或治疗食管癌，具有重要的临床应用价值。
作为一种实施方式，所述产品包括：芯片、试剂盒或药物；其中，所述芯片包括基因芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒；所述药物包括基因药物。所述产品的具体存在形式和使用方法可参考本领域常规诊断和治疗产品，基因芯片、基因检测试剂盒以及基因药物的结构和组成部分，具体根据待测样本的条件以及ESCC病人的使用方法进行设计。在一些实施例中，所述基因检测试剂盒包括引物对，用于特异性筛选所述肿瘤标志物；所述引物对包括：如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，以及如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。进一步地，所述基因检测试剂盒还可以包括有PCR反应常用的酶和试剂。
相应地，一种试剂，用于敲除肿瘤细胞中的上述肿瘤标志物，所述试剂包括：针对于所述肿瘤标志物的向导RNA。
本发明实施例提供的表达抑制剂，用于敲除肿瘤细胞中的上述肿瘤标志物，包括：针对于上述肿瘤标志物的向导RNA。我们的研究结果表明，采用该向导RNA来沉默上述肿瘤标志物的表达，有利于抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力，为食管癌的针对性治疗提供了新的靶点，具有应用于制备治疗肿瘤的产品的潜在价值，具有重要的临床应用价值。
在本发明实施例中，所述向导RNA为单链的gRNA，用于敲除ESCC细胞中的上述肿瘤标志物。
作为一种实施方式，所述向导RNA主要由靶点序列和第一序列组成，所述靶点序列的3'端连接所述第一序列的5'端；
其中，所述第一序列具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；
所述靶点序列为第一靶点、第二靶点、第三靶点或第四靶点，所述第一靶点具有如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列，所述第二靶点具有如SEQIDNo.6所示的核苷酸序列，所述第三靶点具有如SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，所述第四靶点具有如SEQIDNo.8所示的核苷酸序列。
在本发明实施例中，所述向导RNA的靶点序列作用于CTD-2017C7.1基因，通过互补配对与CTD-2017C7.1基因的部分片段结合，通过结合，以实现沉默ESCC细胞的CTD-2017C7.1基因，从而实现抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力。
在本申请说明书中，“第一序列”中的“第一”仅用于描述目的，用于区分向导RNA中非靶点序列部分，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
SEQIDNo.4：
guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu；
SEQIDNo.5：UGGUGAAGCCUCACCAGCUC；
SEQIDNo.6：GAGUCAAGUUACGUGACCAC；
SEQIDNo.7：UCGUCGCAGGCUGUUCUCAC；
SEQIDNo.8：AGAGUCUUGCUCCGUUGCCU。
具体地，所述向导RNA为gRNA-Y6560或gRNA-Y6561，每条gRNA分别敲除CTD-2017C7.1基因的两个靶点。
其中，如图14所示，gRNA-Y6560的序列具体为：gNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu，该序列中的20个N对应靶点序列的20个碱基，用于替换如SEQIDNo.5所示序列的第一靶点或替换如SEQIDNo.6所示序列的第二靶点。
gRNA-Y6561的序列具体为：gNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt，该序列中的20个N对应靶点序列的20个碱基，用于替换如SEQIDNo.7所示序列的第三靶点或替换如SEQIDNo.8所示序列的第四靶点。
通过相关研究证实，上述gRNA-Y6560和gRNA-Y6561这两条gRNA均为针对CTD-2017C7.1基因的特定序列，可通过剪辑互补配对CTD-2017C7.1基因，结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，可使得核酸内切酶Cas9与gRNA结合形成双链的基因区域进行切割，从而实现对ESCC细胞中的CTD-2017C7.1基因进行敲除，从而沉默ESCC细胞中CTD-2017C7.1基因的功能表达。采用上述gRNA-Y6560和gRNA-Y6561敲除ESCC细胞中的CTD-2017C7.1基因后，可显著抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭的能力，具有应用于制备治疗肿瘤的产品的潜在价值，具有重要的临床应用价值。
采用上述试剂敲除ESCC细胞的具体过程以及功能验证过程可参考本领域常规技术，如一些实施例中，采用Crispr-Cas9基因敲除技术，结合上述两条向导RNA（gRNA-Y6560；gRNA-Y6561），对TE-1细胞内的CTD-2017C7.1基因进行敲除，获得稳定沉默了如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA的TE-1细胞。然后通过利用该细胞株，能够实现对该lncRNA基因功能的进一步研究，有利于解释食管癌的发生、发展过程，为食管癌的针对性治疗提供更多的临床应用信息。
相应地，一种细胞株，所述细胞株为稳定敲除了如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA的肿瘤细胞。
本发明实施例提供的细胞株，为稳定敲除了如SEQIDNo.1所示核苷酸序列的长链非编码RNA的肿瘤细胞，通过利用该细胞株，能够实现对该lncRNA基因功能的进一步研究，有利于解释食管癌的发生、发展过程，为食管癌的针对性治疗提供更多的临床应用信息。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例一种针对ESCC的肿瘤标志物及其应用的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。
实施例1
本实施例发现了一种新的食管鳞癌标志物，具体发现过程如下：
1、研究对象选择
从深圳市人民医院胸外科收集符合研究条件要求的经病理确诊的ESCC病例、与病例年龄匹配的经消化内镜确诊的食管炎患者及健康对照。研究方案经过深圳大学医学伦理委员会的审核（批准号：2016001）。所有病人及对照在被选为研究对象前均签署了知情同意书。
2、研究对象（ESCC患者，食管炎患者，健康对照）的血浆外泌体lncRNA表达谱分析比较
抽取研究对象外周血，4℃下静置1小时，1000g离心10min分离血浆，分离后的血浆在-80℃条件下保存待测。
采用外泌体分离试剂盒（Ribo-Exosome-Isolation-KitC10110），按说明书进行操作，分离获得血浆外泌体。将获得的外泌体采用电子显微镜观察外泌体的形态及大小，并采用Malvern纳米颗粒分析仪分析外泌体径粒分布，用流式细胞仪检测外泌体表面蛋白标记物（CD63，CD81），获得符合要求的血浆外泌体。
采用TRIZOL试剂（Invitrogen）提取血浆外泌体RNA。提取出的RNA用RNaseyMiniKit（Qiagenp/n74104）进行纯化，提取的RNA用DNaseI消化，用RiboZeroMagneticGoldKit去除rRNA，RNA片段化后用随机引物生成第一链cDNA，加dUTP合成第二链cDNA。双链cDNA用聚合酶进行末端修复并加A，链接酶连接Illumina特异性接头，qPCR扩增纯化得到RNA测序文库。
RNA测序文库库检合格后，使用HiSeqRapidPEClusterKitV2（Illumina）试剂在cBot上生成簇（cluster），然后在HiSeq3000platform测序平台上运行双端测序程序（2×150bp），测序数据（Rawreads）按质控标准去除含有接头及低质量的短序。Reads经人类rRNA序列数据库（GeneBankandGENCODEv26）比对，去除rRNA，获得高质量数据（Cleanreads）。使用HISAT2aligner将cleanread与参考人类基因组（GRCh38）进行比对，得到BAM文件。用cufflinks软件将比对后的序列进行组装并估算其相对丰度，使用edgeR-robustsoftware软件计算基因的表达水平（FPKM，fragmentsperkilobaseoftranscriptpermillionmappedreads），表达差异foldchange进行比较。
经多重比较t检验分析及Bonferroni校正后，发现ESCC病人血浆外泌体有89条lncRNA表达水平和食管炎组及健康对照组相比较具有显著性差异（Foldchange≧2.0；BonferroniP<0.05）。其中，ESCC病人外泌体内CTD-2017C7.1基因的表达水平与食管炎及正常对照的差异的P值分别为0.006及0.003，图1为ESCC患者和正常对照组的血浆外泌体中CTD-2017C7.1基因表达水平差异结果，表明CTD-2017C7.1基因可作为诊断ESCC的标志物。
实施例2
本实施例测试了CTD-2017C7.1基因在ESCC癌组织及癌细胞系中的表达水平，具体包括以下测试过程：
1、组织标本
组织标本取自深圳市人民医院胸外科手术切除的组织标本，ESCC的诊断根据《食管癌诊断》（WS337—2011）标准进行诊断，以病理学明确诊断的病例作为研究病例。排除以下情况患者：做过放化疗、近半年服用过抗肿瘤药物或免疫抑制剂、有传染病史、肿瘤已向远端转移、既往有其他恶性肿瘤病史。
取样标准：取每个患者手术中切除的癌组织和癌旁组织，癌旁组织要求距离癌组织5公分以上且肉眼观察无病理性改变，每块组织重量在150-200mg之间；组织标本切除后立即置于2mL外旋盖冻存管中，在管壁做好标记后在离体15分钟内置于液氮罐保存。
2、细胞系
ESCC细胞系采用KYSE30、KYSE180、KYSE70、KYSE450、TE1和EC109，以正常食管上皮细胞系NE3为正常对照。
3、组织及细胞总RNA提取
采用TRIZOL试剂（Invitrogen），按说明书推荐的标准方法提取总RNA。提取后的RNA用电泳检测RNA样品质量，并用分光光度计测定各RNA样品的OD260/OD280，计算总RNA浓度及纯度。
4、制备cDNA
选用TaKaRaPrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit（D6210A）试剂盒制备cDNA混合反应液：RNA700ng；基因特异引物mix(10uM)1µl；dNTPsMix（2.5mM）1.6µl；加无RNA酶的H2O至总体积14.5µl。
将混合反应液在65℃水浴5分钟，冰上放置2分钟。短暂离心后，在离心管中依次加入RT反应液：5XFirst-StrandBuffer4µl；0.1MDTT1µl；RNaseIhibitor0.3µl；SuperScriptIIIRT 0.2µl。混合后37℃恒温1分钟；50℃温育60分钟；70℃温育15分钟使酶失活，之后将制得的cDNA置冰浴或-20℃保存，待用。
5、qRT-PCR反应
将所有cDNA样品分别配置RealtimePCR反应体系：2×MasterMix5µl；10uM的PCR特异引物F 0.5µl；10uM的PCR特异引物R0.5µl；加水至总体积为8µl；其中，PCR特异引物F 具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，PCR特异引物R具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列。
将反应体系5000rpm短暂离心，加样：a）将8µl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中；b）再加入对应的2µlcDNA；c）小心粘上SealingFilm封口膜，并短暂离心混合；c）在设置PCR程序前将准备好的PCR板放在冰上；将上述384-PCR板置于RealtimePCR仪上进行PCR反应，程序如下：95℃，10min；40个PCR循环（95℃，10秒；60℃，60秒（收集荧光））。
为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后（95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒），从60℃缓慢加热到99℃（仪器自动进行-RampRate为0.05℃/秒）。结果与计算：各样品的目的lncRNA和内参β-actin分别进行RealtimePCR反应；数据采用2-△△CT法进行分析。
图2和图3为CTD-2017C7.1基因的表达水平差异结果。如图2所示，ESCC癌组织中CTD-2017C7.1基因的相对表达水平显著高于癌旁组织；如图3所示，CTD-2017C7.1基因在多种ESCC癌细胞系（在图中表示为ESCC）中的表达水平也显著高于正常食管细胞系（在图中表示为NE3），表明CTD-2017C7.1基因在ESCC中高表达。
实施例3
本实施例测试了CTD-2017C7.1基因在食管癌细胞中的表达部位，具体测试过程如下：
采用细胞核/细胞浆分离试剂盒（Phygene，PH1466），按说明书的步骤分离TE1细胞的细胞核及细胞浆。用Trizol试剂分别分离细胞核和细胞浆中的总RNA，cDNA合成及进行qRT-PCR反应。如图4结果所示，表明CTD-2017C7.1基因在TE-1细胞中主要定位在细胞核，细胞核表达显著高于细胞浆（P<0.01）。由于CTD-2017C7.1主要位于细胞核，提示CTD-2017-C7.1主要作用于基因的转录调控。
实施例4
本实施例测试了CTD-2017C7.1基因高表达在促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力方面的测试，具体测试过程如下：
1、构建CTD-2017C7.1基因过表达TE-1细胞稳定株
（1）构建慢病毒表达载体
在NCBI数据库中查询人类lncRNACTD-2017C7.1基因序列（ENSG00000256705.3），合成CTD-2017C7.1基因，编码序列如SEQIDNo.1所示；将该序列构建到如图5所示的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体（简写为pCDH载体）上，CTD-2017C7.1基因的插入位置在pCDH载体的EcoRI和NotI之间，之后筛选标记有EGFP绿色荧光蛋白和嘌呤霉素的质粒，接着对质粒进行大量提取，获得高浓度无内毒素残留的慢病毒表达载体，以备后面的病毒包装。
（2）过表达慢病毒包装
1）293T细胞传代，接种10cm平皿，24小时后转染步骤（1）制得的慢病毒表达载体以及慢病毒包装质粒pSPAX2和pMD2.G，这三种质粒的重量比为4：3：1，共24µg；
2）过夜培养后弃去培养基，换成含2-5%FBS的DMEM培养基，继续培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，12000rpm离心10min，去除细胞碎片，再用0.45µm滤膜过滤；
3）采用PEG8000方法浓缩病毒上清液，获得慢病毒。
（3）过表达稳定株构建
1）将TE-1细胞接种到12孔板中，每孔1×105个细胞；
2）分别加入上述步骤（2）制得的慢病毒以及对照病毒，每孔加入200µl病毒原液，并补加500µl完全培养基，同时加入终浓度为8µg/mlploybrene；
3）感染24h后换成正常1640培养基继续培养24h；
4）48h后将细胞分孔传代，并分浓度梯度加入嘌呤霉素，嘌呤霉素浓度为2µg/ml、3µg/ml、5µg/ml、6µg/ml；
5）每隔三天换液一次，同时按要求加入不同浓度的嘌呤霉素；
6）观察各组细胞死亡情况及荧光情况，然后根据细胞的生长状态选择嘌呤霉素浓度为5µg/ml的细胞进行扩大培养，并将CTD-2017C7.1基因有明显过表达效果的细胞株（表示为TE-1-CTD-2017C7.1）及对照细胞株（表示为TE-1-PCDH）进行扩大培养后冻存。
待细胞扩增后收集细胞进行qPCR检测目的基因的表达情况，荧光定量PCR检测结果表明，如图6所示，CTD-2017C7.1过表达TE-1细胞组（表示为TE-1-CTD-2017C7.1）相比空载对照组TE-1-PCDH细胞及TE-1细胞均显著升高，**表示P＜0.01，说明CTD-2017C7.1基因过表达的TE-1稳定株构建成功。
（3）测试CTD-2017C7.1过表达在促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力方面的测试。
2、进行ESCC细胞增殖、迁移和侵袭测试
（1）采用TE-1-CTD-2017C7.1过表达稳定株为测试样品，以空载对照稳定株TE-1-PCDH为对照样品；
（2）方法和结果
采用CCK8实验检测TE-1-CTD-2017C7.1过表达稳定株在促进ESCC细胞增殖的作用，图7为ESCC细胞增殖测试结果，显示TE-1-CTD-2017C7.1过表达稳定株在分别培养24h、48h和72h后的细胞增长数量均大于TE-1-PCDH对照组，表明CTD-2017C7.1基因过表达可促进ESCC细胞增殖。
采用细胞迁移侵袭试验技术（Transwell）检测TE-1-CTD-2017C7.1过表达稳定株在促进ESCC细胞迁移的作用。图8为ESCC细胞迁移测试结果，显示TE-1-CTD-2017C7.1过表达组的细胞迁移率大于TE-1-PCDH对照组，表明CTD-2017C7.1基因过表达可促进ESCC细胞迁移。
采用细胞划痕实验检测TE-1-CTD-2017C7.1过表达稳定株在促进ESCC细胞侵袭的作用，图9为ESCC细胞侵袭测试结果。显示TE-1-CTD-2017C7.1过表达稳定株的细胞侵袭数量大于TE-1-PCDH对照组，表明CTD-2017C7.1基因过表达可促进ESCC细胞侵袭。
实施例5
本实施例测试了在敲除CTD-2017C7.1基因后在抑制ESCC细胞增殖、迁移和侵袭能力方面的测试，具体测试过程如下：
1、CTD-2017C7.1基因敲除
采用Crispr-Cas9基因敲除技术，对TE-1细胞内的CTD-2017C7.1基因进行敲除。
（1）设计合成针对CTD-2017C7.1基因的单链gRNA，利用单链gRNA通过碱基互补配对CTD-2017C7.1基因位点，随后Cas9核酸内切酶结合到与gRNA形成双链的基因区域进行切割。我们设计并合成了2条gRNA，分别为gRNA-Y6560以及gRNA-Y6561，每条gRNA分别敲除CTD-2017C7.1基因的两个靶点。
其中，gRNA-Y6560作用CTD-2017C7.1基因的两个靶点的序列为SEQIDNo.5和SEQIDNo.6，gRNA-Y6561作用CTD-2017C7.1基因的两个靶点的序列为SEQIDNo.7和SEQIDNo.8。
经qRT-PCR检测结果可知，如图10所示，gRNA-Y6560作用的靶点沉默目的基因CTD-2017C7.1表达的效果明显，因而，在后续实验中我们使用gRNA-Y6560敲除细胞CTD-2017C7.1基因，以作为CTD-2017C7.1基因敲除试剂进行功能验证。
2、 CCK8检测
1）将 TE-1细胞按照1×104细胞/孔/100μL接种于3块96孔板中，同时设置培养基对照孔；
2）培养 24h后开始转染，分为正常细胞组和gRNA-Y6560组。用Lipofectamine2000（Invitrogen，11668-019）进行转染，方法同上；最终每孔加10μL质粒-脂质体混合液，每孔脂质体为0.2μL，质粒为0.1μg，每组5个重复；
3）各孔在24h、48h、72h分别加入CCK8试剂10μl，孵育4h后，酶标仪检测OD450nm吸光值；
图11为敲除CTD-2017C7.1基因后抑制ESCC细胞增殖的实验结果，TE-1细胞转染gRNA-Y6560质粒沉默CTD-2017C7.1表达组（图中表示为gRNA-Y6560）与正常细胞对照组（TE-1）相比，细胞增殖活性显著降低（**表示P＜0.01）。
3、 Transwell检测细胞迁移
1）先按上述方法接种细胞至6孔板，进行gRNA-Y6560转染；同时，设置TE-1空白组作为正常细胞对照；
2）24h后将两组细胞消化后，1500rpm离心5min收集细胞，用无血清培养基吹散细胞并计数，调整细胞浓度达到2×105/mL左右；
3）取24孔细胞培养板，每孔加入600μL含15%FBS的完全培养液，将Corning公司8μm孔径PET膜的transwell小室置于其中；
4）每个上层小室内加入稀释后的细胞200μL，48小时后取出细胞培养板，取出小室，弃掉上层培养液，湿润的棉签轻柔擦掉上层的细胞，4%多聚甲醛固定15分钟，0.1%结晶紫溶液染色20分钟，每张膜随机选取5个视野，倒置显微镜下(100×)计数每个视野内的细胞数，并拍照保存。
图12为敲除CTD-2017C7.1基因后抑制ESCC细胞迁移的实验结果，显示TE-1细胞转染gRNA-Y6560质粒沉默CTD-2017C7.1表达组（图中表示为gRNA-Y6560）的迁移细胞数与正常细胞对照组（图中表示为TE-1control）相比显著降低，说明沉默CTD-2017C7.1基因能够抑制TE-1细胞迁移（**表示P＜0.01）。
4、细胞划痕实验检测
1）两组细胞分别接种1×106细胞于6孔板中，待细胞长成单层后进行划痕；
2）用白枪头垂直于细胞孔，进行划痕；
3）分别于0h，24h进行拍照观察。
图13为敲除CTD-2017C7.1基因后抑制ESCC细胞侵袭的实验结果，显示TE-1细胞转染gRNA-Y6560质粒沉默CTD-2017C7.1表达组（图中表示为gRNA-Y6560）与正常细胞对照组（图中表示为TE-1control）相比，24h后细胞划痕面积愈合显著低于正常细胞组，说明沉默CTD-2017C7.1基因能够抑制TE-1细胞增殖迁移（**表示P＜0.01）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 针对ESCC的肿瘤标志物及其应用
<130> 2019
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 613
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaauucaggc gugcacuggu gaagccucac cagcucaggu cagggugucc acaggugccu 60
guggaguagg ggcacagaug gggaagaaga ggacuggcag gaagucgucg caggcuguuc 120
ucacaggccc ugugccaccu guggucacgu aacuugacuc uggaaaugag uguucuuuuu 180
uuuuuuugga gacagagucu ugcuccguug ccuagguugg agugcagugg ugcgaucuug 240
gcuuacugca acguccgccu cccggguuca agugauucuc cugccucagc cuccugagca 300
gcugggauua caggcaugug ccaccacucc cggcuaauuu uguauuuuua gcagaaaugg 360
gauuucacca uguuggcuag gcuggucucg aacuucugac cucagaugau ccaccugccu 420
cagccuccca agugcuggga uuacaggcau gagccaccgc acccggcuuu uuuuuuuuuu 480
uucuuuucua auuugagaca gagucuugcu cugucgccca ggcuggaguu cagugguggu 540
uucugaagaa ugaucaaacc auauaauuaa accaaucauu uuagguaacu gugugauccu 600
cuaacgcggc cgc 613
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagtcgtc gcaggctgtt 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggcaggagaa tcacttgaac cc 22
<210> 4
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uggugaagcc ucaccagcuc 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagucaaguu acgugaccac 20
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
ucgucgcagg cuguucucac 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
agagucuugc uccguugccu 20

Claims (3)

1.检测CTD-2017C7.1基因mRNA表达量的引物对在制备辅助诊断食管鳞状细胞癌的试剂中的应用，其特征在于，所述试剂的检测样本为人血浆外泌体、癌组织和癌细胞，所述CTD-2017C7.1基因的编码序列如SEQ ID No.1 所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物对由如SEQ ID No.2所示的上游引物以及如SEQ ID No.3所示的下游引物组成。
3.靶向CTD-2017C7.1基因的gRNA-Y6560和gRNA-Y6561在制备治疗食管鳞状细胞癌的产品中的应用，其特征在于，所述gRNA-Y6560的序列为：gNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu，所述gRNA-Y6560的序列中的20个N对应靶点序列的20个碱基，用于替换如SEQ ID No.5所示的第一靶点序列或替换如SEQ ID No.6所示的第二靶点序列；所述gRNA-Y6561的序列为： gNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatc aacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttt，所述gRNA-Y6561的序列中的20个N对应靶点序列的20个碱基，用于替换如SEQ ID No.7所示的第三靶点序列或替换如SEQ ID No.8所示的第四靶点序列。
CN201911417599.8A 2019-12-31 2019-12-31 针对escc的肿瘤标志物及其应用 Active CN111088357B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911417599.8A CN111088357B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 针对escc的肿瘤标志物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911417599.8A CN111088357B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 针对escc的肿瘤标志物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111088357A CN111088357A (zh) 2020-05-01
CN111088357B true CN111088357B (zh) 2022-09-20

Family

ID=70397984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911417599.8A Active CN111088357B (zh) 2019-12-31 2019-12-31 针对escc的肿瘤标志物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111088357B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115612734A (zh) * 2021-07-14 2023-01-17 郑州大学 人食管鳞状细胞癌的分子标记物组及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923982A (zh) * 2014-03-27 2014-07-16 南京市第一医院 Hoxd-as1在食管鳞癌诊断和治疗中的作用
CN103952474A (zh) * 2014-03-27 2014-07-30 南京市第一医院 一种食管癌诊断标志物及其使用方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2014227653B2 (en) * 2013-03-15 2017-04-20 The General Hospital Corporation Using RNA-guided foki nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
CN104762368B (zh) * 2014-01-02 2017-08-29 中国医学科学院肿瘤医院 一种用于辅助预测食管鳞癌患者术后生存时间的试剂盒
CN103952478A (zh) * 2014-03-27 2014-07-30 南京市第一医院 一种在食管鳞癌中显著下调的长链非编码rna的检测及应用
CN103952477A (zh) * 2014-03-27 2014-07-30 南京市第一医院 食管癌相关的长链非编码rna的检测及其用途
CN103952476B (zh) * 2014-03-27 2018-05-15 南京市第一医院 一种长链非编码rna的检测和应用
US20180142236A1 (en) * 2015-05-15 2018-05-24 Ge Healthcare Dharmacon, Inc. Synthetic single guide rna for cas9-mediated gene editing
EP3655531A4 (en) * 2017-07-18 2021-09-08 Exosome Diagnostics, Inc. SEQUENCING OF NUCLEIC ACIDS ASSOCIATED WITH EXOSOMAL ISOLATION IN PATIENTS WITH MULTIFORM GLIOBLASTOMA
CN110343724B (zh) * 2018-04-02 2021-10-12 北京大学 用于筛选和鉴定功能性lncRNA的方法
CN108531604B (zh) * 2018-06-07 2019-04-19 浙江省人民医院 一种非编码RNA分子lnc-DC在预测乳腺癌预后中的应用
CN110358834B (zh) * 2019-07-12 2023-05-16 深圳大学 一种lncRNA的应用以及试剂盒和药物

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103923982A (zh) * 2014-03-27 2014-07-16 南京市第一医院 Hoxd-as1在食管鳞癌诊断和治疗中的作用
CN103952474A (zh) * 2014-03-27 2014-07-30 南京市第一医院 一种食管癌诊断标志物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111088357A (zh) 2020-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017156015A2 (en) Micrornas and methods of their use
CN102892898B (zh) 用于肝细胞癌诊断的含微rna生物标记的诊断试剂盒和方法
Liu et al. miR-371-5p down-regulates pre mRNA processing factor 4 homolog B (PRPF4B) and facilitates the G1/S transition in human hepatocellular carcinoma cells
CN110423819B (zh) 一种参与人结直肠癌增殖和耐药的lncRNA及其应用
CN113462780B (zh) 一种用于前列腺癌辅助诊断的标志物及试剂盒
CN111304326B (zh) 检测及靶向lncRNA生物标志物的试剂及其在肝细胞癌中的应用
CN109321655B (zh) Nkiras2基因调控区序列、调控序列及其在鼻咽癌中的应用
CN111455059A (zh) 检测及靶向生物标志物的试剂在口腔鳞癌中的应用
CN111088357B (zh) 针对escc的肿瘤标志物及其应用
CN109371130B (zh) Ripor3在制备用于乳腺癌检测和治疗的生物制品中的应用
Peng et al. CircFAT1 promotes lung adenocarcinoma progression by sequestering miR-7 from repressing IRS2-ERK-mediated CCND1 expression
CN111455060A (zh) 诊断和治疗口腔鳞癌的相关生物标志物及应用
CN111172290A (zh) 肝细胞癌诊断和治疗的miRNA
CN114032305B (zh) 环状RNA CircNFIB在肝内胆管细胞癌诊断、治疗及预后中的用途
CN112641797B (zh) 抑制结直肠癌生长、转移的靶标与诊断标志物及其应用
CN110643707B (zh) 一种与ESCC相关的lncRNA LLNLR-299G3.1及其应用
CN110468134B (zh) 一种与NSCLC相关的tRF及其应用
CN111635941A (zh) Sdpr基因表达和/或sdpr基因甲基化水平的检测试剂盒及应用
CN107604063B (zh) miRNA-633和miRNA-633抑制剂的应用及应用其的产品
KR102293777B1 (ko) 신규한 UQCRB-관련 순환 miRNA 바이오 마커 및 이를 이용한 대장암의 진단 방법
CN116694759B (zh) Scarna12基因调节细胞增殖与存活中的应用
CN115851939B (zh) 环状RNA cZNF215及其用途
CN116555268B (zh) 靶向rna结合蛋白stau2的寡核苷酸及其应用
CN111763735B (zh) 肿瘤差异表达基因及其应用
CN113122626B (zh) Klc3基因作为标志物在卵巢癌中诊断及治疗的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant