CN107604063B

CN107604063B - miRNA-633和miRNA-633抑制剂的应用及应用其的产品

Info

Publication number: CN107604063B
Application number: CN201710794919.6A
Authority: CN
Inventors: 王建勋; 李培峰; 庞鑫; 周志侠; 林志娟; 敖翔; 王艺霏
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2017-09-07
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2037-09-07
Also published as: CN107604063A

Abstract

本发明提供了一种miRNA‑633和miRNA‑633抑制剂的应用及应用其的产品，涉及生物医学工程的技术领域。本发明提供的miRNA‑633在胃癌组织和胃癌细胞中高表达；并且通过细胞凋亡检测发现，miRNA‑633的抑制剂能够显著提高胃癌细胞对低浓度化疗药物处理的敏感性，促进胃癌细胞凋亡。因此，miRNA‑633可作为一种诊断胃癌的生物标志物；而miRNA‑633的抑制剂，对胃癌具有潜在的治疗和预防价值，可成为一种胃癌化疗药物增敏剂，用于治疗胃癌的辅助药物。

Description

miRNA-633和miRNA-633抑制剂的应用及应用其的产品

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，尤其是涉及一种miRNA-633和miRNA-633抑制剂的应用及应用其的产品。

背景技术

胃癌是常见的严重影响广大人民健康的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，目前胃癌的致死率在所有肿瘤的致死率中排第二位，全世界每年约有90万胃癌新发患者，同时约有70万人死于胃癌。胃癌发病原因不明，可能与多种因素，如生活习惯、饮食种类、环境因素、遗传素质、精神因素等有关。近几年，随着现代生活的发展，胃癌出现了年轻化的趋势。手术仍然是可能治愈胃癌的主要手段，但大多数患者的病情在确诊时已属于进展期胃癌，术后复发及转移率很高。胃癌的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于胃癌的诊断、防治。

细胞凋亡是为维持细胞环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡过程，在生物体的发育和衰老过程中可以起到保持稳态的作用，也可以清除受损的细胞从而达到保护机体的功能。在生理和病理情况下都会发生细胞凋亡。肿瘤的发生从细胞凋亡角度看，一般认为是由于凋亡受阻所致，是肿瘤的凋亡机制受到抑制不能正常进行细胞死亡清除的结果。肿瘤细胞中有一系列的癌基因和原癌基因被激活，并呈异常表达状态。这些基因的激活和肿瘤的发生发展之间有着及为密切的关系。

随着近来微小RNA(microRNA，miRNA)研究的热潮，这种内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程。miRNA是一类长度在22nt左右的内源非编码小RNA,广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。它主要通过与靶基因的3'UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译,从而参与调控机体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，预测超过1/3的人类基因都是保守的miRNA靶基因。实验证据表明，miRNA可通过调控其靶标基因参与细胞凋亡信号通路，影响肿瘤的发生和发展，发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。miRNA的发现为肿瘤发病机制的研究提供了新的思路，为肿瘤诊断和治疗提供了新的策略。

尽管越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，寻找胃癌中特异表达的、参与肿瘤细胞凋亡的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的胃癌的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供miRNA-633的应用；

本发明的第二个目的在于提供miRNA-633的前体RNA的应用；

本发明的第三个目的在于提供miRNA-633抑制剂的应用；

本发明的第四个目的在于提供用于预防和/或治疗胃癌的药物；

本发明的第五个目的在于提供用于诊断和/或预后评估胃癌的试剂盒；以缓解现有技术中存在的胃癌致病机理或者治疗药物等相关研究的不足。

本发明提供了miRNA-633在制备用于诊断和/或预后评估胃癌的试剂盒中的应用，所述miRNA-633含有如SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明还提供了miRNA-633的前体RNA在制备用于诊断和/或预后评估胃癌的试剂盒中的应用，所述miRNA-633的前体RNA为含有如SEQ ID NO.2所示的序列的核酸或者其生物活性功能的片段或变体。

本发明还提供了miRNA-633抑制剂在制备用于预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，所述miRNA-633抑制剂含有如SEQ ID NO.3所示的序列。

进一步地，所述胃癌包括隆起型胃癌、局限溃疡型胃癌、浸润溃疡型胃癌和弥漫浸润型胃癌中的一种或几种。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗胃癌的药物，所述药物含有如下I-Ⅴ中至少一种的物质：

I、含有SEQ ID NO.3所示序列的RNA分子；

II、含有SEQ ID NO.3所示序列的RNA分子，所述序列进行了硫代修饰、甲氧修饰或胆固醇修饰；

III、编码I所示RNA分子的重组载体；

Ⅳ、编码I所示RNA分子的重组病毒；

Ⅴ、编码I所示RNA分子的重组病毒载体。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或几种。

进一步地，所述药物以口服或注射的方式给药；所述注射给药方式选自静脉注射、肌肉注射或肿瘤内直接注射。

本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估胃癌的试剂盒，所述试剂盒包含用于特异性检测miRNA-633的引物。

进一步地，所述试剂盒中包含的引物具有以下所示的序列：

5’-CGCCGCTAATAGTATCTACCAC-3’(SEQ ID NO.4)；

5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO.5)。

进一步地，所述胃癌包括自隆起型胃癌、局限溃疡型胃癌、浸润溃疡型胃癌和弥漫浸润型胃癌中的一种或几种。

发明人通过研究发现，本发明提供的miRNA-633在胃癌组织中表达量明显高于正常胃组织，通过对miRNA-633进行特异性的检测能达到到诊断和/或预后评估胃癌的目的；并且通过细胞凋亡检测发现，miRNA-633抑制剂能够提高胃癌细胞在低浓度对化疗药物的敏感性，促进胃癌细胞的凋亡。因此，miRNA-633抑制剂可作为一种可用于制备防治肿瘤疾病的药物用于胃癌治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本发明实施例1提供的临床胃癌组织中miRNA-633表达水平的结果图；

图1B为本发明实施例1提供的胃上皮细胞系GES-1和多种胃癌细胞系中miRNA-633表达水平的结果图；

图2为本发明实施例2提供的miRNA-633抑制剂抑制内源性miRNA-633的表达水平的结果图；

图3A为本发明实施例3提供的抑制内源性的miRNA-633对0.2μM阿霉素(DOX)处理条件下胃癌细胞SGC-7901凋亡情况的结果图；

图3B为本发明实施例3提供的抑制内源性的miRNA-633对0.2μM阿霉素处理条件下胃癌细胞SGC-7901凋亡率统计结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中涉及的用于诊断和/或预后评估胃癌的序列可以为与miRNA-633序列(SEQ ID NO.1：5’-CUAAUAGUAUCUACCACAAUAAA-3’)或miRNA-633前体序列(SEQ ID NO.2：5’-AACCUCUCUUAGCCUCUGUUUCUUUAUUGCGGUAGAUACUAUUAACCUAAAAUGAGAAGGCUAAUAGUAUCUACCACAAUAAAAUUGUUGUGAGGAUA-3’)所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示序列的序列，或者SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列完全相同的序列。

本发明中涉及的胃癌，包括隆起型、局限溃疡型、浸润溃疡型和弥漫浸润型中的一种或多种。

本发明中涉及的miRNA-633抑制剂(miRNA-633inhibitor)可以为与miRNA-633inhibitor(SEQ ID NO.3：5’-TTTATTGTGGTAGATACTATTAG-3’)所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.3所示序列的序列，或者SEQ ID NO.3所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.3所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.3所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.3所示序列完全相同的序列。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗胃癌的药物，所述药物含有如下I-Ⅴ中任一种或两种以上的物质：

I、miRNA-633 inhibitor；

II、进行了硫代修饰、甲氧修饰或胆固醇修饰的miRNA-633inhibitor的RNA分子；

III、编码I所示RNA分子的重组载体；

Ⅳ、编码I所示RNA分子的重组病毒；

Ⅴ、编码I所示RNA分子的重组病毒载体；

其中，miRNA-633 inhibitor含有SEQ ID NO.3所示的序列。

在本发明中，抑制胃癌功能为促进胃癌细胞与药物结合，诱导胃癌细胞的凋亡，其中，胃癌细胞例如可以为，但不限于SGC-7901；药物是胃癌治疗药物，例如可以为，但不限于DOX(阿霉素)。

本发明提供的用于预防和/或治疗胃癌的药物，可以将miRNA-633抑制剂与药剂学上可以接受的载体或者辅料联合使用，载体或者辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或者多种，通过口服、静脉注射、肌肉注射、或直接肿瘤内注射的方式，用于防治胃癌发生。

另外，还提供了一种用于诊断和/或预后评估胃癌的试剂盒，涉及到用于特异性检测miRNA-633的引物。

其中，miRNA-633的上游引物为：

5’-CGCCGCTAATAGTATCTACCAC-3’(SEQ ID NO.4)

miRNA-633的下游引物为：

5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO.5)。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。

除非特别指出，以下各实施例中涉及的各种实验方法和操作，包括细胞培养，RNA的提取，RCR扩增，荧光定量PCR，载体的构建、扩增及转染，细胞染色等等，均可参见以下文献：

Li.Q,etal,MicroRNA-185 regulates chemotherapeutic sensitivity ingastric cancer by targeting apoptosis repressor with caspase recruitmentdomain,Cell Death Dis.2014 24；5:e1197.

Wang K,etal,miR-9 and NFATc3 regulate myocardin in cardiachypertrophy,J Biol Chem.2010 Apr16；285(16):11903-12.

Lin Z,etal,miR-23a functions downstream of NFATc3 to regulate cardiachypertrophy,PNAS,2009,106(29):12103-12108.

上述文献在此全文引入作为参考。

以下各实施例中使用的实验材料和试剂如下：

胃上皮细胞GES-1、胃癌细胞系SGC-7901等细胞购自ATCC(美国标准生物品收藏中心)；

TRI quick试剂购自北京索莱宝科技有限公司；

M-MLV逆转录酶购自Amersham公司；

Real-time RT PCR试剂盒均购自TaKaRa公司；

引物序列委托Invitrogen公司合成。

除非特别指出，以下实施例中涉及的miRNA-633的核苷酸序列具体为：5’-CUAAUAGUAUCUACCACAAUAAA-3’(SEQ ID NO.1)。

除非特别指出，以下实施例中涉及的miRNA-633抑制剂的核苷酸序列具体为：5’-TTTATTGTGGTAGATACTATTAG-3’(SEQ ID NO.3)。

实施例1临床胃癌组织及胃癌细胞系中miRNA-633表达水平

本实施例采用临床收集成对胃癌及癌旁组织标本，均来源于青岛市解放军四零一医院，为新鲜分离的肿瘤组织，经切割成小组织块后冻于-80℃备用。正常胃上皮细胞系GES-1及胃癌细胞系SGC-7901、AGS、MGC-803、BGC-823、NCI-N87为对象，检测miRNA-633表达水平。

1、总RNA提取：

采用TRI quick试剂分别提取组织或细胞总RNA。

(1)培养细胞系移去培养液，在培养皿中直接加入TRI quick裂解细胞，10cm²面积加1ml TRI quick。组织样本用匀浆器破碎组织后，加入1ml TRI quick，用取样器吹打混匀；

(2)4℃12000rpm离心10min，取上清；每使用1ml TRI quick向样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置5min；

(3)4℃12000rpm离心15min，样品分为三层，RNA主要在无色的水相，把水相转移到新管中；

(4)在转移到新管中的水相中加入等体积的冰冷异丙醇，混匀，室温放置20min；

(5)4℃12000rpm离心10min，去上清，加入1ml 75％乙醇(用RNase-free水配制)洗涤沉淀，4℃7000rpm离心5min，弃上清；

(6)室温放置凉干，加入适量RNase-free水，充分溶解RNA；

(7)-80℃保存RNA样品。

2、miRNA-633的c-DNA制备

1)设计引物序列：

miRNA-633逆转录(RT)引物序列如下：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTATT-3’(SEQ IDNO.6)；

U6作为内参基因同时进行逆转录。

2)miRNA-633的c-DNA制备：

加M-MLV前后充分混匀，42℃1h，95℃5min，-20℃保存样品。

3、Real-time PCR法检测miRNA-633的表达量

采用Real-time PCR试剂盒(购自TaKaRa公司)检测miRNA-633的表达量。

1)设计引物序列如下：

miRNA-633上游引物：

5’-CGCCGCTAATAGTATCTACCAC-3’(SEQ ID NO.4)

miRNA-633下游引物：

5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’(SEQ ID NO.5)

2)miRNA-633 Real-time PCR反应体系如下:

Real-time PCR反应条件如下：

结果如图1A所示，在胃癌组织中，miRNA-633表达水平显著高于其临近的癌旁组织；图1B结果显示，以正常胃上皮细胞GES-1为参照，几种胃癌细胞系中miRNA-633的表达水平均上调。

实施例2 miRNA-633抑制剂的抑制效率

采用合成的miRNA-633抑制剂(miRNA-633 inhibitor)，以SGC-7901为模型，按照5μg的量转入细胞，24h后按照实施例1提供的方法提取RNA，反转录和实时荧光定量PCR进行miRNA-633表达水平的检测。

其中，作为阴性对照的Scrumble control序列为：

5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3”(SEQ ID NO.7)

结果如图2所示，从结果图中可以看出miRNA-633 inhibitor转染到胃癌细胞中后，miRNA-633的表达水平显著下调。说明miRNA-633的抑制剂能够有效降低内源性miRNA-633的表达水平。

实施例3 miRNA-633抑制剂提高凋亡诱导处理的SGC-7901细胞的死亡率

本实施例选取对数生长期的SGC-7901细胞，用细胞转染技术将miRNA-633的抑制剂(miRNA-633 inhibitor)转入细胞中，进行0.2μM DOX处理24h，采用TUNEL法检测SGC-7901细胞的死亡率。

采用罗氏TUNEL细胞凋亡检测试剂盒测定胃癌细胞的细胞凋亡，实验步骤如下：

胃癌细胞爬片常规固定。

PBS洗细胞一次，加入0.1％TritonX-100 0.1％柠檬酸钠，在冰上孵育2min。PBS洗2次，干燥样品5min。

在每个切片上加入50μl TUNEL混合试剂。2个阴性对照加50μl Labelsolution(vial 2)。其中，Tunel混合试剂的配制为：Label solution(vial 2)∶酶液(vial1)＝9∶1。

摇动载玻片，保证混合试剂覆盖整个组织。

盖上盖玻片，用锡薄纸包装，在培养箱内放置1小时。

PBS洗3次。封片。样品在荧光显微镜下直接检测，激发波长为450-500nm。发射波长为515-565nm。

实验结果如图3A和图3B所示，表示了胃癌细胞转染miRNA-633抑制剂对低浓度DOX(0.2μM)处理的细胞凋亡率的影响。由图3A和图3B可以看出，在同样条件的DOX处理后，转染miRNA-633抑制剂组的细胞凋亡率显著升高，说明抑制内源性miRNA-633表达水平提高了胃癌细胞对化疗药物DOX促凋亡的敏感性。

综上所述，发明人通过大量的实验研究发现miRNA-633在胃癌组织及细胞系中表达显著上调。具体地，本发明人通过合成miRNA-633抑制剂在低浓度化疗药物处理条件下，抑制miRNA-633的表达发现，miRNA-633低表达在细胞水平能提升胃癌细胞对化疗药物的敏感性。更具体而言，发明人发现，与对照组相比，miRNA-633在胃癌细胞中有明显的提高，这意味着miRNA-633可作为一种早期诊断、早期预防和治疗胃癌的生物标志物。因此，本发明提供了包含特异性检测miRNA-633的引物的试剂盒，通过实时荧光定量PCR等技术检测患者外周血血浆中miRNA-633的表达水平，用于对胃癌的诊断和/或预后评估。

另外，本发明人通过大量的试验证明miRNA-633的抑制剂对增强胃癌细胞的化疗药物敏感性有明显作用。具体地，本发明人在细胞水平通过转染miRNA-633的抑制剂发现，它能够引起，胃癌细胞在低浓度化疗药物处理条件下，细胞凋亡率显著升高。以上说明，miRNA-633的抑制剂通过增强胃癌细胞化疗药物敏感性，对胃癌细胞凋亡具有促进作用，它对多种胃癌具有潜在的治疗和预防价值，可成为一种胃癌化疗药物增敏剂，用于治疗胃癌的辅助药物。因此，本发明提供了将miRNA-633抑制剂与适当载体或辅料如壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等包装形成药物，通过口服、静脉注射、肌肉注射或直接中瘤内注射的方式，用于预防和/或治疗胃癌。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> miRNA-633和miRNA-633抑制剂的应用及应用其的产品

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 智人种（Homo sapiens）

<400> 1

cuaauaguau cuaccacaau aaa 23

<210> 2

<211> 98

<212> DNA

<213> 智人种（Homo sapiens）

<400> 2

aaccucucuu agccucuguu ucuuuauugc gguagauacu auuaaccuaa aaugagaagg 60

cuaauaguau cuaccacaau aaaauuguug ugaggaua 98

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttattgtgg tagatactat tag 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgccgctaat agtatctacc ac 22

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgcagggtc cgaggt 16

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactttatt 50

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caguacuuuu guguaguaca a 21

Claims

1.miRNA-633在制备用于诊断和/或预后评估胃癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA-633的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.miRNA-633的前体RNA在制备用于诊断和/或预后评估胃癌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA-633的前体RNA的序列如SEQ ID NO.2所示。

3.miRNA-633抑制剂在制备用于预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，其特征在于，所述miRNA-633抑制剂的序列如SEQ ID NO.3所示。