CN110075121B - miR-4295在制备治疗胃癌的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及miR‑4295在制备治疗胃癌的药物中的用途。miR‑4295靶向并负调节LRIG1表达以激活EGFR/PI3K/AKT信号传导途径，从而促进胃癌细胞的增殖，并抑制由DDP诱导的胃癌细胞的凋亡。因此，miR‑4295是胃癌患者的新型治疗靶点。

Description

miR-4295在制备治疗胃癌的药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及miR-4295在制备药物中的用途。

背景技术

胃癌(GC)是世界上最常见的癌症。据报道，幽门螺杆菌感染被认为是级联的起始因子，并且是GC的重要因素。不同国家的GC发病率存在明显差异。虽然GC的发病率有所下降，但一些国家的贲门癌发病率正在上升。尽管GC的临床治疗有很大改进，但化疗仍然是高级GC最重要的治疗策略之一。结果发现，一些患者最终对包括顺铂(DDP)在内的化学治疗药物产生低化疗反应，并且可以是GC相关死亡率的主要原因。已经证明DDP是化学治疗剂，并且通过使用DDP的组合促进对肿瘤细胞增殖的抑制。多项发明已经证明了microRNA在GC中作为癌基因或肿瘤抑制因子的作用，以及参与化疗的治疗结果。

MicroRNA-4295(miR-4295)作为致癌基因起作用。表皮生长因子受体(EGFR)信号通路是重要的转导通路，对肿瘤的进展起着至关重要的作用。活化的受体包括：Ras/MAPK，PI3K/Akt，STAT和Src家族激酶，以促进转录因子的活化，导致细胞增殖，侵袭和迁移。富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)是泛阴性调节因子，被认为是表皮生长因子受体。LRIG1是EGFR信号通路的泛阴性调节因子。EGFR是与细胞生长和存活密切相关的重要信号组分。PI3K/AKT信号通路被激活，可增加肿瘤细胞增殖。

发明内容

在本发明中，miR-4295和LRIG1之间的靶向关系通过初始生物信息学预测，然后是确认性双荧光素酶报告基因测定来确定。在此，本发明人旨在通过靶向LRIG1基因来证实miR-4295通过EGFR/PI3K/AKT信号通路抑制DDP诱导的GC细胞凋亡的假设。

本发明的目的是通过富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1(LRIG1)介导的EGFR/PI3K/AKT信号通路，探讨miR-4295对顺铂(DDP)诱导的GC细胞凋亡的调控机制。

由此，本发明的目的是提供miR-4295在制备治疗胃癌的药物中的用途。

进一步地，本发明提供miR-4295抑制剂在制备治疗胃癌的药物中的用途。

优选地，本发明提供miR-4295抑制剂和顺铂在制备治疗胃癌的药物中的用途。

优选地，所述miR-4295靶向并负调节LRIG1表达。

优选地，所述miR-4295通过激活EGFR/PI3K/AKT信号传导途径抑制顺铂诱导的胃癌细胞的凋亡。

此外，本发明提供一种治疗胃癌的药物组合物，其包含miR-4295抑制剂。

所述miR-4295抑制剂可以降低和/或抑制/拮抗miR-4295表达。

进一步地，本发明提供一种治疗胃癌的药物组合物，其包含miR-4295抑制剂和顺铂。

本发明人选择了具有最高miR-4295表达的两种细胞系和用于实验的LRIG1的最低表达。计算DDP对人GC细胞MKN-28和MKN-45的半数抑制浓度，并通过TMRE染色检测GC细胞的线粒体膜电位。值得注意的是，通过MTT测定和平板克隆形成以及流式细胞术和TUNEL染色评估DDP处理或没有DDP处理后GC细胞的增殖和凋亡。Western印迹分析和RT-qPCR用于确定EGFR/PI3K/AKT信号通路相关基因和凋亡相关基因的表达。LRIG1被鉴定为miR-4295的靶基因。miR-4295的表达上调，LRIG1的表达在GC细胞中下调，此外，DDP增强GC细胞中miR-4295表达的减少和LRIG1表达的升高。miR-4295在没有DDP处理的GC细胞中促进增殖并抑制DDP诱导的凋亡。此外，miR-4295提高了EGFR，PI3K，AKT，p-PI3K和p-AKT的表达水平，表明miR-4295通过靶向LRIG1促进EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活。MiR-4295靶向并负调节LRIG1表达以激活EGFR/PI3K/AKT信号传导途径，从而促进GC细胞的增殖，并抑制由DDP诱导的GC细胞的凋亡。因此，miR-4295可以是GC患者的新型治疗靶点。

附图说明

图1为表达谱图。分析表明miR-4295通过靶向LRIG1通过PI3K/AKT信号传导途径影响GC细胞对DDP的敏感性。图1A，GSE31811的差异分析。横坐标表示样本编号，纵坐标表示差异基因。右上方的直方图是颜色渐变，颜色从上到下的变化表示芯片日期从高到低变化的表达。每个矩形代表每个样本的表达。每列显示每个样品中所有基因的表达。左侧树状图是指来自不同样品的不同基因的聚类分析。顶部的水平条纹表示样本的类型，部分表示具有DDP的有效样本，部分表示具有DDP的无效样本；图1B，差异基因与DDP的相关性。中心的钻石是指DDP，圆圈是指基因，线条是指基因与基因和基因与DDP的相关性。线的粗细指可靠性，线越粗，可靠性越高；图1C，基因与基因的相互作用。部分圆圈表示基因的名称，部分圆圈表示基因与基因的相互作用。线的粗细指可靠性，线越粗，可靠性越高；图1D，TargetScan数据库和miRDB数据库中预测结果的交集。左侧圆圈指的是TargetScan数据库中的前十个miRNA，右侧圆圈指的是miRDB数据库中获得较高分数的前十个miRNA，中间的重叠部分指的是TargetScan数据库和miRDB中预测结果的交集数据库；GC，胃癌；DDP，顺铂；下同。

图2为RT-qPCR和蛋白质印迹图。分析后选择MKN-28和MKN-45的GC细胞系。图2A，各细胞系中miR-4295的表达水平；图2B，各细胞系中LRIG1mRNA的表达水平；图2C，每个细胞系中LRIG1的蛋白质条带；图2D，每个细胞系中LRIG1的蛋白质水平；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；*，p<0.01，相对于GES-1细胞系；数据是三次独立实验的平均值±标准偏差；单因素方差分析用于分析数据。

图3为miR-4295和LRIG1基因之间的靶向关系图。通过初始生物信息学预测确定，然后是确认性双荧光素酶报告基因测定。图3A，miRanda的结果表明miR-4295和LRIG1之间的靶向关系；图3B，双荧光素酶测定的结果显示相对荧光素酶活性；*，p<0.05，相对于miR-4295模拟物和LRIG1-wt共转染组中的质粒；数据是三次独立实验的平均值±标准偏差；进行双尾学生t检验以分析数据。

图4为DDP对GC细胞的IC₅₀值的图。

图5为DDP处理之前和之后GC细胞中LRIG1和miR-4295表达的变化的图。图5A，通过RT-qPCR检测DDP给药前后的miR-4295表达；图5B，RT-qPCR检测DDP给药前后LRIG1mRNA的表达；图5C，5D，通过蛋白质印迹分析检测DDP施用前后LRIG1的蛋白质条带和蛋白质表达；*，p<0.05，与DDP给药前的表达相比；数据是三次独立实验的平均值±标准偏差；双尾t检验用于分析数据。

图6为平板克隆形成实验和MTT测定证实miR-4295在转染后促进GC细胞的增殖的图。图6A，MTT法检测MKN-28和MKN-45细胞系的细胞生长曲线；图6B，MKN-28和MKN-45细胞系中的平板克隆形成实验；图6C，MKN-28和MKN-45细胞系中的细胞克隆形成率；MTT，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物；*，p<0.05，与没有DDP处理的空白组相比；#，p<0.05，与DDP处理后的空白组相比；数据是三次独立实验的平均值±标准偏差；通过重复测量ANOVA进行吸光度比较；通过单向ANOVA确定细胞克隆形成率。

图7为miR-4295对GC细胞中DDP诱导的细胞凋亡的抑制作用的图。证实膜联蛋白V-FITC/PI双染色，TUNEL染色和TMRE染色。图7A，膜联蛋白V-FITC/PI双重染色，用于MKN-28和MKN-45细胞的凋亡；图7B，MKN-28和MKN-45细胞凋亡的TUNEL染色(×200)；图7C，线粒体跨膜电位的TMRE染色(×200)；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；TUNEL，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记；TMRE，四甲基罗丹明乙酯；DDP，顺铂；*，p<0.05，与没有DDP处理的空白组相比；#，p<0.05，与DDP处理后的空白组相比；数据是三次独立实验的平均值±标准偏差。

图8为RT-qPCR和蛋白质印迹图。分析显示miR-4295在DDP诱导的GC细胞中介导凋亡相关基因。图8A，蛋白质条带和通过蛋白质印迹分析检测的定量分析；图8B，RT-qPCR检测的mRNA表达的定量分析；*，p<0.05，与空白组相比；数据是三次独立实验的平均值±标准偏差；单因素方差分析用于分析数据；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；Bcl-2，B细胞淋巴瘤-2；Bax，BCL2相关X。

图9为miR-4295增强EGFR/PI3K/AKT信号传导途径的活化的图。图9A，蛋白质条带和通过蛋白质印迹分析检测的定量分析；图9B，RT-qPCR检测的mRNA表达的定量分析；RT-qPCR，逆转录定量聚合酶链反应；EGFR，表皮生长因子受体；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；AKT，丝氨酸/苏氨酸激酶；*，p<0.05，与空白组相比；数据是三次独立实验的平均值±标准偏差；单因素方差分析用于分析数据。

具体实施方式

基于以上发明内容的描述，本领域技术人员能够全面地应用本发明，所有相同原理或类似的改动均应视为包括在本发明的范围之内。

GEO数据筛选和差异表达谱分析：“胃癌”和“顺铂”是从NCBI检索公共GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)的关键词。选择数据集GSE31811，其包含用DDP处理的有效样品和用DDP处理的无效样品。测序平台是GPL6480。用DDP处理的无效样品作为对照，并在这两个数据集之间进行差异分析。进行R语言的limma包用于差异分析。|logFC|>2和p值<0.05作为选择差异基因的条件。接下来，使用R语言的pheatmap包来构建表达的差异基因的热图。

分析DDP相关基因和GC相关基因：STITCH(http://stitch.embl.de/)是化学品和蛋白质之间已知和预测的相互作用的数据库。交互包括直接(物理)和间接(功能)关联。在该数据库中，有35个与DDP相关的差异基因，并且预测了与DDP直接相关的差异基因。DigSee(http://210.107.182.61/geneSearch/)是一个文本挖掘搜索引擎，提供描述“基因”通过“生物事件”参与“疾病”发展的证据句子。“胃癌”是检索STITCH数据库的关键词。检索结果中的前十个基因包括在以下分析中。STRING(https://string-db.org/)可以检索蛋白质之间的相互作用。该数据库用于检索DigSee中与GC相关的10个基因与STITCH中与DDP相关的3个基因的相关性。

预测调节LRIG1的miRNA：基因名称是检索miRDB中基因潜在调节因子miRNA的关键词(http://www.mirdb.org/mirdb/index.html)。在miRDB的目标搜索中，选择的物种是人类。将LRIG1输入到基因靶标搜索中以检索数据库中基因的潜在调节因子miRNA。获得较高分数的前十个miRNA被包括在随后的分析中。维恩图网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)用于进行关于两个数据库的预测结果的两个维恩地图，并找到两个预测结果之间的交集。

细胞培养、分组和转染：GC细胞系MKN-28、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45、BGC-823和正常组织中的胃上皮细胞系GES-1(Shanghai Gene Chem Co.Ltd，中国上海)进行培养。RPMI 1640培养基，含10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，(Invitrogen，Carlsbad，USA)，37℃，100％湿度，5％CO₂。每48-72小时用完全培养基完全替换培养基。通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹分析选择具有最高miR-4295表达的细胞系和具有最低LRIG1表达的细胞系。选择MKN-45和MKN-28细胞系。选择的细胞系MKN-45和MKN-28处于生长的对数期，这些细胞系分为5组：空白组(GC细胞)，阴性对照(NC)组(pCMV-neo-Bam载体+GC细胞)，miR-4295抑制剂组(GC细胞系+抑制剂序列)，shRNA-LRIG1组(GC细胞+shRNA-LRIG1)和miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1组(co-转化组)。在转染期间，将对数表达的细胞系接种在六孔培养板中，并将细胞密度调节至2×10⁵个细胞/孔。通过LipofectamineTM-200(Invitrogen，Carlsbad，USA)转染细胞，并严格按照说明书进行。转染后，用DDP作为刺激冥想处理对数期细胞(顺铂，DPP，中国食品药品控制发明所，批号：100401-201302，纯度：99.8％)。48小时后，将细胞系用于以下实验。空白组和未经DPP处理的NC组也进行了细胞增殖和凋亡实验。

RT-qPCR：根据GenBank数据库中的序列，由上海GeneChem有限公司(中国上海)设计并合成PCR引物。从Grand Island Biological Company(California，USA)购买的Trizol试剂用于通过一步法提取总RNA，并且通过紫外分光光度计检测RNA的密度和纯度。取3μg总RNA并通过M-MLV逆转录酶逆转录。用SYBR绿色染料法进行RT-qRCR的扩增。RT-qPCR热循环参数：95℃预变性5min，95℃变性10s，退火30s，72℃延伸1min。共有40次循环，在72℃下延伸10分钟。U6基因用作miR-4295的内部参考，β-肌动蛋白用于其他测试基因。记录每个孔的Ct值。每组测试三次。用2^-ΔΔCt法计算反应靶基因的相对表达水平。

蛋白质印迹分析：裂解从细胞中提取的蛋白质，并根据二辛可宁酸(BCA)蛋白质定量试剂盒(产品号BCA1-1KT，Sigma，USA)的说明检测蛋白质浓度。以每孔50μg蛋白质进行SDS-PAGE电泳。通过恒压浴法(Millipore，USA)将细胞转移至PVDF膜。使用5％的重构脱脂乳来阻挡膜1小时。兔抗人LRIG1一抗(1:1000)，PI3K(1:1000)，p-PI3K(1:1000)，AKT(1:1000)，p-AKT(1:1000)，β-肌动蛋白(1:1000)(Cell Signaling Technology，USA)，EGFR(1:1000，ab52894)，使用Bcl-2(1:500，ab59348)，Bax(1:500，ab53154)，Caspase-3(1:1000，ab90437)，(Abcam，Cambridge，MA，USA)将蛋白质结合在膜上。将混合物在4℃下孵育过夜并用TBST洗涤。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊第二抗兔(1:1000，ab97091，Abcam PLC，Cambridge，UK)，在37℃温育1小时。将混合物用TBST洗涤三次，每次10分钟。电化学发光(ECL)显色试剂盒用于实现化学发光(Solarbio，Beijing，China)。通过Quantity One软件分析条带密度。

双荧光素酶报告基因测定：TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)上的预测表明LRIG1是miR-4295的靶向基因。Luciferase Reporter Gene Assays用于进一步证实LRIG1是否是miR-4295的靶向基因。野生型3'UTR和相互的3'UTR通过3'UTR扩增并与pGL3对照载体(Promega，USA)的Xhal基因座连接。转染试剂LipofectamineTM-200用于进行共转染。将细胞分为四组：①LIG1-wt 3'UTR+miR-4295模拟物；②LRIG1-wt 3'UTR+mimic-NC；③LRIG1-mut 3'UTR+miR-4295模拟物；④LRIG1-mut 3'UTR+mimic-NC。共转染48小时后除去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次。向每个孔中加入1×PLB约100μL到24孔培养板中。将板轻轻晃动约15分钟，将裂解物转移到EP管中。通过Dual-Lucy测定试剂盒(Promega，USA)检测荧光素酶报道基因测定的基因表达，并且根据试剂盒的说明书进行特定的方法。将EP管中的20μL裂解物转移到检测管中，然后加入100μLLARII。混合后，检测萤火虫荧光素酶活性，并加入100μL的Stop&Glo试剂，以检测海堇的荧光素酶活性。该测定的结果以萤火虫荧光素酶活性和海三色堇萤光素酶活性的比例的形式表示。

3-(4,5-二甲基噻唑-2-基(-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定：收集对数生长期的GC细胞，调节密度为8×10⁴/mL，然后接种到96孔板中。每组中设置两个重复的孔。在1天、2天、3天、4天和5天后，向每个孔中加入5g/L MTT溶液(20μL)。在培养箱中避免GC细胞发光，并在培养4小时后终止。每孔加入100μL DMSO，以通过避免光振荡充分摇动晶体。通过Microplate Reader以490nm的波长检测光吸收值(A)以绘制生长曲线。该实验进行三次，取平均值。将根据纵坐标的A值，时间(d)作为结果分析的生长曲线的横坐标。

半数抑制浓度的测定(IC₅₀)：将含有5×10⁴/mL细胞的100μL接种在96孔板中。用不同浓度的DDP(批号：100401-201302，99.8％，中国食品药品检验所)孵育12h后，DDP浓度分别为1、2、4、8、16、32、64μg/mL，100μL每孔，并且通过含有阴性对照孔的培养基对每种浓度的药物进行三次重复。培养48小时后，在每个孔中用20μL MTT溶液(5mg/mL)处理细胞。温育4小时后，除去细胞培养基，加入150μL DMSO并振荡10分钟。用自动酶免疫测定法在490nm吸光度下测量吸光度值(A)。细胞生长抑制率(％)＝(1-A实验组的值/对照组的A值)×100％。计算DDP对人GC细胞MKN-28和MKN-45的IC₅₀。

平板克隆形成测定：将各组对数生长期的细胞接种于6孔培养板中，每组接种于3个孔中，1×10³孔。将6孔板在横向上轻轻摇动，使细胞均匀分散。将六孔培养板在37℃，5％CO₂的培养箱中静置培养直至显示可见克隆。用PBS小心洗涤细胞两次，并用甲醇固定15分钟。使用Giemsa染色法将克隆染色15分钟。用水缓慢洗去染液，并在空气中干燥。计算大于50的克隆数，并计算菌落率。克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％。

膜联蛋白V-FITC/PI双染色：用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(556547，上海佳硕生物技术有限公司)检测细胞培养24小时后GC细胞(MKN-28和MKN-45细胞)的凋亡情况。实验如下：将10×结合缓冲液用去离子水稀释到1×结合缓冲液中。将所有组的GC细胞以2000rpm离心5分钟并收集细胞。将细胞预冷，然后用1×PBS悬浮，以2000rpm离心5-10分钟并洗涤。向细胞中加入300μL×结合缓冲液悬浮细胞。将5μL膜联蛋白V-FITC(异硫氰酸荧光素)与其混合。然后将混合物避光，并在室温下培养15分钟。向细胞中加入5μL PI，然后在使用流式细胞术(Cube6，Partec，Germany)之前将混合物在冰浴中保持黑暗5分钟。激发波长为480nm，检测到530nm处的FITC，检测575nm处的PI。

四甲基罗丹明、乙酯、高氯酸盐(TMRE)染色：在所有组培养24小时后，通过TMRE(sigma，USA)检测GC细胞线粒体膜电位。该实验的步骤如下：将处理后的细胞接种到24孔板中，用预热2次的PBS洗涤细胞。向每个孔中加入含有TMRE(10nmol/L)的500μL 1640培养基。将细胞在37℃下孵育30分钟并用PBS洗涤。加入500μL 1640培养基后，用荧光显微镜(Olympus，Japan)检测，计算相对荧光强度。

末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定：选择指数期细胞，以1×10⁸/L的密度接种于6孔板中培养24小时。转染三组细胞，每组两个孔。收集转染24小时的细胞并用40g/L多聚甲醛固定30分钟。用TUNEL方法标记尼克末端标记。根据Roche(美国罗氏)的指示，随机选择5个视野(×200)，并使用图像分析软件Spot Advance 4.0.2来收集图像。计数至少1000个细胞以确定染色结果，并计算凋亡指数(AI)。AI＝倒置显微镜下测量的凋亡细胞数/1000细胞×100％。

统计分析：通过SPSS 21.0(IBM Corporation，Somer，NY，USA)分析所有数据。测量数据表示为平均值±标准偏差。通过t检验检测两组之间的比较。通过单因素方差分析(AVONA)分析多组之间的比较。用Kolmogorov-Smirnov检验检查数据正态性。在具有正态分布的数据中的多组之间的比较使用单向AVONA中的多重比较的Tukey进行事后检验，而具有偏斜分布的数据使用Dunn在Kruskal-Wallis检验中的多重比较进行事后检验。通过重复测量AVONA确定组间细胞增殖的比较。p<0.05的值被认为是统计学上显著的。

结果：

DDP敏感性相关基因和调节miRNA预测的概况分析：在GSE31811数据集中使用DDP在有效和无效有效样本之间进行差异分析，结果显示有128个差异基因。此外，在DDP的有效样本中，有82个基因被上调，46个基因被下调。进行了关于128个差异基因中的前35个基因的热图(图1A)。为了进一步筛选与DDP相关的潜在基因，使用STITCH数据库检索与DDP相关的基因，并在STITCH数据库中分析35种差异基因和DDP(图1B)。结果表明，在35个差异基因中，LRIG1、GMPPA和DUSP1与DDP直接相关。选择这三种基因作为进一步选择的发明材料。检索与GC相关的基因，并将检索结果中的前十个基因纳入分析。在STRING数据库中，与GC相关的三个差异基因和十个基因进行蛋白质-蛋白质相互作用。结果显示LRIG1与ERBB2相互作用，并且DUSP1与GC中的大部分基因相互作用(图1C)。为了通过文献检索进一步确定LRIG1和DUSP1与DDP的相关性，以往的许多发明表明DUSP1可明显抑制DDP的有效性。在许多人类癌症中发现DUSP1对DDP的抑制作用，例如非小细胞肺癌(NSCLC)和卵巢癌。此外，还报道了DUSP1对肿瘤的作用机制。此外，之前的一项发明报道，LRIG1可以增强癌细胞对DDP的敏感性。所有这些结果表明，通过上述方法筛选的两个基因与肿瘤对DDP的敏感性密切相关，LRIG1可以增强癌细胞对DDP的敏感性。然而，尚未发明LRIG1的具体机制，并且还没有报道LRIG1与DDP的相关性。通过进一步分析DDP与GC的相关性，DDP可通过PI3K/AKT信号通路诱导GC细胞死亡，提示LRIG1可通过PI3K/AKT信号通路促进癌细胞对DDP的敏感性。为了进一步了解LRIG1对癌细胞对DDP敏感性的影响机制，miRNA数据库用于检索调节LRIG1的miRNA。采用miRDB和TargetScan数据库来检索调节LRIG1的miRNA。最后，在miRD数据库中发现了101个miRNA，在TargetScan数据库中发现了47个属于保守位点的miRNA。选择在两个数据库中获得较高分数的前十个miRNA的交集。该发现显示has-miR-130a和has-miR-4295存在于两个数据库中(图1D)。通过进一步分析两种miRNA与DDP的相关性，一些先前的发明报道miR-130a可以增强肿瘤细胞对DDP的抗性，而has-miR-4295与DDP的关联尚未被发明。因此，选择has-miR-4295进行发明。上述结果表明，在GC中，has-miR-4295可以调节LRIG1的表达，并通过PI3K/AKT信号通路影响GC细胞对DDP的敏感性。

细胞系筛选高表达的miR-4295和GC中表达不良的LRIG1：与正常受试者的胃上皮细胞系GES-1相比，GC细胞系中miR-4295的表达显著增加，而LRIG1的表达显著降低(均p<0.05)(图2)。它表明miR-4295的表达在GC细胞中过表达，并且LRIG1的表达在GC细胞中处于中等和低水平。在五种GC细胞系中，LRIG1的表达在MKN-28细胞中最高，并且miR-4295的表达最低(所有p<0.05)。MKN-45细胞呈现最低水平的LRIG1和最高水平的miR-4295(均p<0.05)。因此，选择MKN-28和MKN-45用于以下实验。

LRIG1是miR-4295的下游靶基因：双荧光素酶报告基因测定用于进一步证实LRIG1是否是miR-4295的靶基因。在对TargetScan网站进行发明后(图3A)，结果显示LRIG1是miR-4295的靶基因。双荧光素酶报告基因测定进一步证实了这一点(图3B)。根据该图，与miR-4295和模拟LRIG1-mut 3'UTR共转染组相比，共转染组中的荧光素酶活性在miR-4295模拟物和LRIG1-wt3'UTR组中降低(均p<0.05)。结果表明，miR-4295与LRIG1基因具有特异性结合，miR-4295与LRIG1之间存在靶向关系。

鉴定诱导MKN-28和MKN-45细胞系中DDP的浓度：如图4所示，随着DDP浓度的增加，对MKN-28和MKN-45细胞的抑制率增加。当DDP浓度为5.84μg/mL和25.49μg/mL时，对MKN-28和MKN-45细胞的抑制率接近一半。因此，DDP的IC₅₀为5.84μg/mL，MKN-45的IC₅₀为25.49μg/mL。

DDP诱导GC细胞中miR-4295表达的减少和LRIG1表达的增加：RT-qPCR和蛋白质印迹分析用于测量DDP处理后MKN-28和MKN-45细胞中LRIG1和miR-4295的表达水平。RT-qPCR(图5)和Western印迹分析结果证明，经DDP处理后，MKN-28和MKN-45细胞中miR-4295的表达水平显著降低，LRIG1的蛋白和mRNA水平显著更高(p<0.05)。

miR-4295促进GC细胞增殖：MTT测定用于检测MKN-28和MKN-45细胞系的GC细胞的增殖。如图6A所示，与没有DDP处理的那些相比，DDP处理后GC细胞增殖明显受到抑制(p<0.05)。DDP处理后，与空白组相比，NC组和miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1共转染组的GC细胞凋亡无统计学差异(均p>0.05)。shRNA-LRIG1组细胞凋亡率显著升高(p<0.05)，miR-4295抑制剂组细胞凋亡率显著降低(p<0.05)。平板克隆形成实验的结果(图6B-6C)表明，与没有DDP处理的相比，DDP处理后GC中细胞克隆形成的数量明显减少，集落形成率显著降低(p<0.05)。在DDP处理后，与空白组相比，shRNA-LRIG1组中GC中细胞克隆形成的数量增加(p<0.05)。集落形成率显著更高(p<0.05)。miR-4295抑制剂组中染色细胞的数量显著较低，肉眼可见，并且集落形成率显著降低(p<0.05)。miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1Co转染组无统计学差异，miR-4295和LRIG1具有拮抗作用。平板克隆形成实验和MTT测定的结果均显示miR-4295促进GC细胞的生长和增殖。

miR-4295抑制DDP诱导的GC细胞凋亡：TUNEL染色用于检测GC细胞的凋亡。图7A中膜联蛋白V-FITC/PI双染色结果显示，DDP处理后GC细胞凋亡率明显高于未经DDP处理的细胞凋亡率(p<0.05)。DDP处理后，与空白组和NC组相比，抑制剂组GC细胞凋亡率显著增加(p<0.05)，而shRNA-LRIG1组凋亡率显著降低(p<0.05)。共转染组无统计学差异(p>0.05)。TUNEL染色结果(图7B)表明，DDP处理后绿色荧光信号强度明显增强，细胞凋亡增加，与未经DDP处理的细胞相比(p<0.05)。DDP处理后，与空白组相比，绿色荧光信号强度和细胞凋亡没有差异。miR-4295抑制剂组绿色荧光信号强度显著增加，细胞凋亡也显著增加(p<0.05)，提示miR-4295可抑制DDP诱导的GC细胞凋亡。随着LRIG1沉默，绿色荧光信号强度显著降低，细胞凋亡也降低，证明LRIG1基因沉默可促进DDP诱导的GC细胞凋亡。与空白组相比，miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1共转染组的细胞凋亡率无统计学差异。

TMRE染色(图7C)用于检测线粒体跨膜电位。与未经DDP处理的患者相比，DDP处理后红色荧光信号明显减弱，线粒体跨膜电位降低，凋亡细胞数增加(p<0.05)。DDP处理后，与空白组相比，NC组红色荧光信号强度(非凋亡细胞线粒体)和凋亡细胞数(p>0.05)无显著差异。与空白组相比，miR-4295抑制剂组显示红色荧光信号消失，线粒体跨膜电位降低，凋亡细胞数增加(p<0.05)，而shRNA-LRIG1显示相反的结果(p<0.05)。与空白组相比，miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1组凋亡细胞数无明显差异(p>0.05)。结果表明，miR-4295可通过靶向LRIG1抑制DDP诱导的GC细胞凋亡。

miR-4295调节DDP诱导的GC细胞中凋亡相关基因的表达：遵循RT-qPCR和蛋白质印迹分析以确定凋亡相关基因的表达，其结果显示在图8A-8B中。DDP处理后，与空白组相比，NC组Bcl-2，Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白水平无显著差异(p>0.05)。与空白组和NC组相比，miR-4295抑制剂组显示Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白水平降低(p<0.05)，表明LRIG1可促进细胞凋亡相关基因表达并激活细胞凋亡相关信号通路。虽然与空白组和NC组相比，miR-4295抑制剂组显示Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白水平增加但Bcl-2减少(p<0.05)，表明抑制miR-4295可以促进DDP诱导的GC细胞凋亡。与空白组和NC组相比，miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1组中Bcl-2，Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白水平无显著差异(p>0.05)。

miR-4295通过靶向LRIG1促进EGFR/PI3K/AKT信号传导途径的激活：采用RT-qPCR和蛋白质印迹分析来确定EGFR，PI3K，AKT，p-PI3K和p-AKT的表达水平。正如图9A所示，与空白组和NC组相比，miR-4295抑制剂组中EGFR，PI3K，AKT，p-PI3K和p-AKT的蛋白水平显著降低(均p<0.05)，这表明DDP处理后EGFR/PI3K/AKT信号通路受到抑制。shRNA-LRIG1组中EGFR，PI3K，AKT，p-PI3K和p-AKT的蛋白水平较高(p<0.05)。说明LRIG1基因沉默可抑制EGFR/PI3K/AKT通路的激活，诱导细胞凋亡。然而，与空白组和NC组相比，miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1组中EGFR，PI3K，AKT，p-PI3K和p-AKT的mRNA水平没有统计学差异。类似地，如图9B所示，与空白组和NC组相比，miR-4295抑制剂组中EGFR，PI3K，AKT mRNA的表达显著降低(p<0.05)，EGFR，PI3K的表达，shRNA-LRIG1组中AKT mRNA较高(p<0.05)。与空白组和NC组相比，miR-4295抑制剂+shRNA-LRIG1组中EGFR，PI3K，AKT mRNA的表达水平无统计学差异(均p>0.05)。结果表明miR-4295通过抑制LRIG1促进EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活。

本发明的一个重要发现是miR-4295在GC细胞中高度表达。此外，本发明人发现LRIG1是miR-4295的下游靶基因，并且LRIG1在GC细胞中下调。

其次，本发明人的实验数据显示，DDP诱导未经DDP处理的GC细胞中miR-4295表达的减少和LRIG1表达的增加。此外，目前发明的结果提示miR-4295促进增殖并抑制DDP诱导的GC细胞凋亡。

最后，本发明人发现miR-4295通过负调节LRIG1表达促进EGFR/PI3K/AKT信号通路的激活。EGFR-PI3K-AKT信号通路在GC细胞中的Mhyorhinis促进的细胞迁移中起重要作用，从而为GC中的Mhyorhinis的发病机制提供线索。

总之，miR-4295通过靶向LRIG1基因，通过EGFR/PI3K/AKT信号通路抑制DDP诱导的GC细胞凋亡。miR-4295可抑制DDP诱导的GC细胞凋亡，LRIG1基因可激活EGFR/PI3K/AKT信号通路，诱导GC细胞凋亡。

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (2)

1.降低和/或抑制miR-4295表达的miR-4295抑制剂在制备治疗胃癌的药物中的用途。

2.降低和/或抑制miR-4295表达的miR-4295抑制剂和顺铂在制备治疗胃癌的药物中的用途。

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