CN112410342B - 抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子，其由序列为SEQ ID NO:1的正义链和序列为SEQ ID NO:2的反义链组成；或者由序列为SEQ ID NO:3的正义链和序列为SEQ ID NO:4的反义链组成。本发明的siRNA分子可诱导人食管癌细胞TE‑1和EC9706凋亡、抑制上述食管癌细胞增殖、生长和克隆形成能力，因此可用于制备食管癌治疗药物。

Description

抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子及其在制备食管癌治疗药物中的用途。
背景技术
HIST1H2BD基因编码的蛋白质作为组蛋白H2B家族成员之一的复制依赖性组蛋白，是核小体的核心组成部分，具有抵抗细菌和真菌的活性。目前HIST1H2BD基因包含两个编码相同蛋白质的转录本，位于染色体6p21.33，在前列腺(RPKM 42.3)、睾丸(RPKM 29.8)等25个组织中均有表达。HIST1H2BD参与减数分裂和Rho GTP酶信号通路。基因注释分析发现该基因与序列特异性DNA结合、蛋白质异二聚体活性有关。该基因的重要同源物是HIST1H2BI(provided by RefSeq,Aug 2015)。HIST1H2BD基因参与激活的PKN1通路刺激雄激素受体调节基因KLK2和KLK3的转录。据报道，HIST1H2BD和其他几个组蛋白家族成员共同作为预测宫颈癌预后的分子标记物(Scientific Reports.2017 Nov 28；7(1):16495)，但该基因用于食管癌治疗的靶点尚未见报道。
RNA干扰(RNA interference e，RNAi)是由小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)引发其同源信使RNA(messenger RNA，mRNA)降解的一种转录后基因沉默形式(Nature.1998,391:806-811)。现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域，2016年12月23日，美国食品和药物管理局FDA批准了首个用于治疗脊髓性肌萎缩的RNA药物Spinraza(Nusinersen)的上市申请，标志着RNA药物正式加入药物大军，成为继化学药物、生物蛋白药物之后的第三大新药类型。目前国际上已有数十种siRNA药物进入临床阶段。RNAi药物现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。
发明内容
为了得到能有效治疗肿瘤比如宫颈癌的RNAi药物，发明人以HIST1H2BD基因为靶点，设计并筛选出数百种siRNA分子，发现其中一些能够特异性地抑制HIST1H2BD表达。更惊讶地发现，其中有两种有效抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子竟然也能够有效地抑制食管癌细胞TE-1和EC9706的增殖、克隆形成，促进细胞凋亡，提示该siRNA分子可以用于治疗食管癌。这一意外发现开拓了食管癌新的治疗基因靶点，为新的靶向治疗提供方向，从而形成了本发明的基础。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子，其由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’-GCAUCUCUUCCAAGGCAAU-3’(SEQ ID NO:1)，
反义链：5’-AUUGCCUUGGAAGAGAUGC-3’(SEQ ID NO:2)；或者
正义链：5’-UGACUAAGGCUCAGAAGAA-3’(SEQ ID NO:3)，
反义链：5’-UUCUUCUGAGCCUUAGUCA-3’(SEQ ID NO:4)。
作为siRNA分子实施RNAi功能的一种实施方式，本发明还提供了一种shRNA分子，其包含如权利要求1中所述的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，其序列为SEQ ID NO:5：
5’-CGGCAUCUCUUCCAAGGCAAUCUCGAGAUUGCCUUGGAAGAGAUGCCG-3’(SEQ ID NO:5)；或者
其包含如权利要求1中所述的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，其序列为SEQ ID NO:6：
5’-GGUGACUAAGGCUCAGAAGAACUCGAGUUCUUCUGAGCCUUAGUCACC-3’(SEQ ID NO:6)。
作为上述siRNA分子实施RNAi功能的另一种具体实施方式，本发明还提供了一种包含上述shRNA基因的shRNA病毒表达载体，所用病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体。该shRNA病毒表达载体用于在细胞内表达siRNA。shRNA病毒表达载体可以转染细胞，shRNA在细胞内会自动被加工成siRNA，持续稳定地表达出siRNA，作用时间更长。
本发明的第二个目的在于提供上述siRNA分子或者上述shRNA病毒表达载体在制备用于抑制HIST1H2BD表达的药物中的用途。
可选地，上述药物是抗肿瘤药物。
在一种实施方式中，上述药物是用于治疗食管癌的药物。
上述siRNA分子或者上述shRNA病毒表达载体用于抑制食管癌细胞TE-1和EC9706的生长、增殖，或者促进食管癌细胞TE-1和EC9706的凋亡。
在一种优选的实施方式中，上述药物可以是任何适合于将siRNA分子或者shRNA病毒表达载体施药于食管或滞留于食管部位的剂型。例如是适用于注射的剂型比如注射剂、静脉注射剂等；也可以是液体口服剂比如糖浆，其无首过效应之虞。
优选地，上述药物还包含必要的佐剂。
体外实验证明，本发明提供的siRNA分子或者shRNA病毒表达载体可特异性地下调HIST1H2BD基因表达，达到抑制食管癌细胞生长、转移以及促进癌细胞凋亡的技术效果。
附图说明
图1是显示慢病毒1和慢病毒2分别导致人食管癌细胞TE-1和EC9706中HIST1H2BD基因mRNA表达水平下调的柱状图。其中纵坐标是HIST1H2BD基因mRNA相对表达水平，横坐标是细胞组别：分别为感染阴性对照病毒(shCtrl)和感染使目的基因敲减的慢病毒(shHIST1H2BD)组食管癌细胞。
图2显示了用慢病毒1侵染后癌细胞TE-1和EC9706中HIST1H2BD蛋白表达情况的SDS-PAGE凝胶电泳照片。
图3显示慢病毒1和慢病毒2侵染后，食管癌细胞TE-1和EC9706的细胞增殖曲线图。其中纵坐标是细胞计数，横坐标是培养时间(天数)，shCtrl是感染阴性对照病毒的细胞，shHIST1H2BD是感染使目的基因敲减的慢病毒的细胞。
图4显示慢病毒1和慢病毒2侵染后，食管癌细胞TE-1和EC9706的细胞活力曲线图。其中纵坐标是OD490值，横坐标是培养时间(天数)，shCtrl是感染阴性对照病毒的细胞，shHIST1H2BD是感染使目的基因敲减的慢病毒的细胞。
图5是显示慢病毒1(KD/shHIST1H2BD)和阴性对照siScr慢病毒(NC/shCtrl)侵染食管癌细胞EC9706后在裸鼠体内成瘤能力的肿瘤体积曲线图(A)和肿瘤重量统计柱形图(B)。其中，图中A的横坐标单位是天数(day)；图中B的肿瘤重量是10只裸鼠的肿瘤重量平均值。
图6显示慢病毒1和慢病毒2侵染后，食管癌细胞TE-1和EC9706的形成细胞克隆数量的柱形图。其中纵坐标是细胞克隆数量，横坐标是细胞组别，shCtrl是感染阴性对照病毒的细胞，shHIST1H2BD是感染使目的基因敲减的慢病毒的细胞。
图7显示慢病毒1侵染后食管癌细胞TE-1和EC9706的凋亡比例的柱形图。其中纵坐标是凋亡百分比例，横坐标是细胞组别，shCtrl是感染阴性对照病毒的细胞，shHIST1H2BD是感染使目的基因敲减的慢病毒的细胞。
图8是显示慢病毒2侵染后食管癌细胞TE-1和EC9706的Caspase3/7活性的柱形图。其中纵坐标是Caspase3/7活性，横坐标是细胞组别，shCtrl是感染阴性对照病毒的细胞，shHIST1H2BD是感染使目的基因敲减的慢病毒的细胞。
具体实施方式
本发明人发现了一种siRNA分子，是由正义链SEQ ID NO:1和反义链SEQ ID NO:2组成的双链siRNA分子、或者是由正义链SEQ ID NO:3和反义链SEQ ID NO:4组成的双链siRNA分子，可以特异性靶向HIST1H2BD基因，阻断HIST1H2BD基因的mRNA转录，从而根本上抑制HIST1H2BD的表达，最终达到治疗食管癌或宫颈癌的目的。
在本文中，有时为了描述简便，会将HIST1H2BD蛋白质与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，HIST1H2BD基因指的是编码组蛋白HIST1H2BD的基因DNA。
在本文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”、“siRNA分子”、“双链siRNA”、或“双链siRNA分子”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，siRNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。
siRNA分子的制备可采用多种方法，比如：化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达RNA、PCR合成RNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间，可以获得更高的基因沉默效率。
同样，短发夹shRNA分子也可采用多种方法比如化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达RNA、PCR合成RNA表达元件等来制备。
在本文中，有时为了描述简便，可将表达siRNA的shRNA病毒表达载体简称为RNAi病毒或者RNAi质粒。例如，当病毒表达载体是慢病毒时，简称为“RNAi慢病毒”。
本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持RNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。该药物也可以是液体口服剂。
任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学上可接受的载体及佐剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持RNA分子或者病毒表达载体的活性。
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。本领域技术人员应当理解，下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。
实施例
本文中的siRNA、shRNA和PCR引物合成、测序皆委托苏州金唯智生物科技有限公司完成。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行，必要时可以通过简单试验予以调整。
实施例1表达siRNA的RNAi慢病毒的制备
1.表达siRNA(SEQ ID NO:1-2)的RNAi慢病毒
1.1表达第一种siRNA分子(SEQ ID NO:1-2)的RNAi慢病毒包含第一种shRNA分子SEQ ID NO:5基因序列。
所用载体骨架为pGCSIL-GFP载体。
制备表达siRNA分子(SEQ ID NO:1-2)的载体时两端带粘端的双链DNA Oligo序列包括下述正义链和反义链：
正义链(5’-3’)：
CCGGCGGCATCTCTTCCAAGGCAATCTCGAGATTGCCTTGGAAGAGATGCCGTTTTTG；
反义链(5’-3’)：
AATTCAAAAACGGCATCTCTTCCAAGGCAATCTCGAGATTGCCTTGGAAGAGATGCCG。
两端的酶切位点粘端种类为Age I和EcoR I酶切位点粘端。
构建的RNAi表达载体名称为pGCSIL-GFP-HIST1H2BD-siRNA。
鉴定慢病毒载体质粒是否构建成功的引物序列包括：
上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；
下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’。
构建获得的带有shRNA分子SEQ ID NO:5基因序列的慢病毒的名称是HIST1H2BD-siRNA(34710-2)慢病毒1(简称为慢病毒1)。
1.2阴性对照
阴性对照质粒名称是pGCSIL-GFP-Scr-siRNA。
阴性对照siRNA靶序列是：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。
阴性对照慢病毒名称：siScr慢病毒。
制备阴性对照质粒时两端带粘端的双链DNA Oligo序列包括下述正义链和反义链：
正义链(5’-3’)：
CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG；
反义链(5’-3’)：
AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA。
阴性对照质粒两端的酶切位点粘端种类为Age I和EcoR I酶切位点粘端。
1.3载体构建条件简述如下。
酶切。质粒酶切反应体系：
试剂 体积(μl)
pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl) 2.0
10×buffer 5.0
100×BSA 0.5
Age I(10U/μl) 1.0
EcoR I(10U/μl) 1.0
dd H<sub>2</sub>O 40.5
Total 50.0
连接。载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系：
试剂 阳性对照(μl) 自连对照(μl) 连接组(μl)
线性化的载体DNA(100ng/μl) 1.0 1.0 1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) 1.0 - 1.0
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0
T4噬菌体DNA连接酶 1.0 1.0 1.0
dd H<sub>2</sub>O 16.0 17.0 16.0
Total 20.0 20.0 20.0
转化。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。
鉴定。阳性克隆的PCR鉴定。
PCR反应体系：
Figure BDA0002816526340000061
Figure BDA0002816526340000071
PCR反应体系程序设定：
Figure BDA0002816526340000072
包装慢病毒包括如下步骤。
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒从鉴定结果正确的大肠杆菌菌液中提取RNAi质粒的DNA，配制成100ng/μl储存液。
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105个细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞融合度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80℃保存。
2.表达siRNA(SEQ ID NO:3-4)的RNAi慢病毒
2.1表达第二种siRNA分子(SEQ ID NO:3-4)的RNAi慢病毒包含第二种shRNA分子SEQ ID NO:6基因序列。
所用载体骨架为pGCSIL-GFP载体。
制备表达siRNA分子(SEQ ID NO:3-4)的载体时两端带粘端的双链DNA Oligo序列包括下述正义链和反义链：
正义链(5’-3’)：
CCGGGGTGACTAAGGCTCAGAAGAACTCGAGTTCTTCTGAGCCTTAGTCACCTTTTTG；
反义链(5’-3’)：
AATTCAAAAAGGTGACTAAGGCTCAGAAGAACTCGAGTTCTTCTGAGCCTTAGTCACC。
两端的酶切位点粘端种类为Age I和EcoR I酶切位点粘端。
构建的RNAi表达载体名称为pGCSIL-GFP-HIST1H2BD-siRNA。
鉴定慢病毒载体质粒是否构建成功的引物序列包括：
上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’；
下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’。
构建获得的带有shRNA分子SEQ ID NO:6基因序列的慢病毒的名称是HIST1H2BD-siRNA(69980-1)慢病毒2(简称为慢病毒2)。
2.2阴性对照
与上述1.2相同。
2.3载体构建条件与上述1.3相同。
实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测基因的沉默效率
试验的癌细胞对象包括人食管癌细胞TE-1、人食管癌细胞EC9706。
侵染复数(或称感染复数，即当感染效率达到80％时，病毒数与可感染细胞数之比，单位为pfu number/cell)MOI为TE-1细胞：20，EC9706细胞：10。
实时定量检测验证基因是否被沉默时的引物为：
上游引物：5’-TATTAACGCTACGATGCCTGAAC-3’；
下游引物：5’-TGGATCTCCCTGGAGGTGAT-3’。
实时定量检测验证基因是否被沉默时的内参为管家基因GAPDH。
实时定量检测验证基因是否被沉默时的内参引物为：
上游引物：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’；
下游引物：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。
实验步骤：
处于对数生长期的癌细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到3天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
逆转录反应体系：
试剂 体积(μl)
5×RT buffer 4.0
10mM dNTPs 2.0
RNasin 0.4
M-MLV-RTase 1.0
RNase-Free 2.6
Total 10.0
Real-time PCR反应体系：
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq: 6.0
引物MIX(5μM)： 0.3
cDNA 0.6
ddH<sub>2</sub>O 5.1
Total 12.0
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，30s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行40个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性15s，然后冷却至60℃，使DNA双链充分结合。从60℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染后目的基因的表达丰度。侵染对照病毒的细胞作为对照。
实验结果：
对于慢病毒1，与癌细胞对应的HIST1H2BD基因mRNA表达下调水平为：人食管癌TE-1细胞下调82.8％；EC9706细胞下调58.3％，如图1中A和B所示。对于慢病毒2，与癌细胞对应的HIST1H2BD基因mRNA表达下调水平为：人食管癌TE-1细胞下调73.7％；EC9706细胞下调60.7％，如图1中C和D所示。图1还表明，慢病毒1对TE-1细胞中HIST1H2BD的下调表达效果比慢病毒2更显著；慢病毒2对EC9706细胞中HIST1H2BD的下调表达效果比慢病毒1更显著。
实施例3用Western Blotting法检测基因的沉默效率
对于实施例2中用慢病毒1侵染的人食管癌细胞TE-1、人食管癌细胞EC9706，用SDS-PAGE凝胶电泳检测用慢病毒1侵染后，癌细胞TE-1和EC9706中HIST1H2BD蛋白的表达情况。
实验包括下述步骤。
3.1细胞总蛋白抽提
接收细胞样品，PBS洗涤两次。取适当量的RIPA裂解液，使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM(使用RIPA裂解液，说明书链接：http://www.beyotime.com/ripa-lysis-bufferm.htm)。
加入适当量的RIPA裂解液，冰上裂解10-15min。细胞刮刮下细胞转移入新的EP管中，然后超声破碎细胞(40W共20次，每次1s，间隔2s)。
4℃、12000g，离心15min，取上清BCA法测定蛋白浓度(BCA Protein Assay Kit说明书链接：http://www.beyotime.com/p0010s.htm)。
加入新的裂解液将每个样品蛋白浓度调为一致，一般为2μg/μL。然后加入1/5体积的6X lodding buffer混匀，100度金属浴煮10min，短暂离心后-80℃保存备用。
3.2SDS-PAGE电泳
制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶；
上样：胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样；
电泳：浓缩胶80mA，20min；分离胶120mA，1h；
免疫印迹(湿转)：电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。
3.3抗体杂交
封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜。
一抗孵育：封闭液稀释抗体(HIST1H2BD(abcam),1:100；GAPDH(Santa-Cruz),1:2000)，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，并用TBST洗膜4次，每次8min。
二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗(Anti-Mouse IgG(Santa-Cruz),1:2000；Anti-Rabbit IgG(Santa-Cruz),1:2000)，室温下孵育PVDF膜1.5h，并用TBST洗膜4次，每次8min。
3.4X光显影
采用CST公司20X
Figure BDA0002816526340000101
Reagent and 20X Peroxide#7003试剂盒进行操作。
将试剂盒中A液和B液按1:1比例混合颠倒混匀，放置数分钟后可使用。
将膜取出，吸水纸擦干，平铺入暗盒，滴加适量混匀的ECL发光液，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1s-数分钟(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)。
取出X光片，放入显影液中，出现条带后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min。
取出X光片，晾干，分析。
实验结果：
Western Blot实验表明，慢病毒1对HIST1H2BD基因的内源表达有敲减作用，如图2所示，因而HIST1H2BD是有效靶点。图2还显示，慢病毒1对TE-1细胞中HIST1H2BD的下调表达效果比EC9706细胞更显著。
实施例4检测侵染了慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力(Celigo实验)
实验的癌细胞对象包括人食管癌细胞TE-1、人食管癌细胞EC9706。
慢病毒1和慢病毒2侵染复数MOI为TE-1细胞：20，EC9706细胞：10。
实验步骤：
处于对数生长期的人食管癌细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104个/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到3天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104个/ml)，以细胞密度为1500个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Celigo仪器(Nexcelom)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。
实验结果：
在细胞培养5天后，对于慢病毒1侵染，人食管癌细胞TE-1的活力细胞数目下降比例为73.21％；细胞EC9706的活力细胞数目下降比例为52.61％，如图3中A和B所示。对于慢病毒2侵染，人食管癌细胞TE-1的活力细胞数目下降比例为62.4％；细胞EC9706的活力细胞数目下降比例为82.19％，如图3中C和D所示。图3还表明，慢病毒1对细胞TE-1的抑制效果比慢病毒2更显著，而慢病毒2对细胞EC9706的抑制效果要比慢病毒1更显著。
实施例5检测侵染了慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力(MTT实验)
实验的癌细胞对象包括人食管癌细胞TE-1、人食管癌细胞EC9706。
慢病毒1和慢病毒2侵染复数MOI为TE-1细胞：20，EC9706细胞：10。
实验步骤：
处于对数生长期的人食管癌细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104个/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，收集处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，并计数。根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(1500个/孔)，每组3-5重复，统一铺好后，待细胞完全沉淀下来后，在显微镜下观察各实验组的细胞密度，如果密度不均匀，则固定一组，微调其他组细胞的量再次铺板(如：发现对照组细胞较多，降低细胞量再次铺板)，放入细胞培养箱中培养。从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液。4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μLDMSO溶解甲瓒颗粒。振荡器振荡2-5min，酶标仪490/570nm检测OD值。然后，做数据统计分析。
实验结果：
在细胞培养3天后，对于慢病毒1侵染，人食管癌细胞TE-1的细胞活力下降比例为44.75％；细胞EC9706的细胞活力下降比例为43.82％，如图4中A和B所示。对于慢病毒2侵染，人食管癌细胞TE-1的细胞活力下降比例为47.29％；细胞EC9706的细胞活力下降比例为74.65％，如图4中C和D所示。图4还表明，慢病毒2对细胞EC9706的抑制效果要比慢病毒1更显著。
实施例6考察侵染慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力(动物成瘤实验)
实验的癌细胞对象为人食管癌细胞EC9706。
侵染复数MOI为20。
用慢病毒1侵染。
阴性对照慢病毒为siScr慢病毒。
实验动物为20只5-6周龄雌性BALB/c裸鼠，试验天数为20天。
考察内容为瘤体成瘤能力。
实验步骤：
处于对数生长期的癌细胞EC9706进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为1.25×106个/ml)接种于10cm皿中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的慢病毒1实验组细胞和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液。用一次性注射器将细胞悬液(4×106个细胞/鼠)注射到5-6周龄雌性BALB/c裸鼠右侧腋窝。实验组注射感染慢病毒1的癌细胞，对照组注射感染对照慢病毒的癌细胞，每组10只裸鼠。注射后1周饲养裸鼠至肉眼可见瘤体，第9天开始测量瘤块的体积和重量变化，每周测量3次。
实验结果：
如图5所示，感染慢病毒1癌细胞的小鼠体内的肿瘤体积始终小于感染对照慢病毒(NC)癌细胞的小鼠(图中A)；感染慢病毒1癌细胞的小鼠(KD)体内的肿瘤重量也明显小于感染对照慢病毒(NC)癌细胞的小鼠(图中B)。由此可见慢病毒1实验组(KD)的肿瘤细胞体内成瘤能力远低于对照组NC。基于此实验结果，认为慢病毒1可以在体内抑制肿瘤细胞的增殖。
实施例7侵染慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测(克隆形成实验)
实验的癌细胞对象包括人食管癌细胞TE-1、人食管癌细胞EC9706。
慢病毒1和慢病毒2侵染复数MOI为TE-1细胞：20，EC9706细胞：10。
实验步骤：
将癌细胞用胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5μg/ml聚凝胺(polybrene)。将慢病毒按照侵染复数加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染3天后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到80％。
将处于对数生长期的感染病毒后的癌细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；细胞计数后接种于6孔板中(TE-1细胞：800个细胞/孔，将接种好的细胞于培养箱中继续培养到15天；EC9706细胞1000个细胞/孔，培养12天)，中途隔3天进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，计数；实验终止时用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤细胞后，Giemsa染色，拍照，对细胞克隆计数。
实验结果：
对于慢病毒1侵染，在细胞培养15天后，人食管癌细胞TE-1的克隆形成能力的下降比例为86.4％；细胞EC9706的克隆形成能力的下降比例为62.6％，如图6中A和B所示。对于慢病毒2侵染，在细胞培养12天后，人食管癌细胞TE-1的克隆形成能力的下降比例为59.6％；细胞EC9706的克隆形成能力的下降比例为70.8％，如图6中C和D所示。图6还表明，慢病毒1对于细胞TE-1的抑制效果比慢病毒2更显著，而慢病毒2对于细胞EC9706的抑制效果要比慢病毒1更显著。
结果表明，与对照组相比，慢病毒1和慢病毒2降低了HIST1H2BD基因的表达后，肿瘤细胞形成的细胞克隆数目显著减少，细胞克隆的体积明显减小；表明基因沉默导致肿瘤细胞平板克隆形成的能力下降。
实施例8侵染慢病毒的肿瘤细胞细胞凋亡水平检测(Annexin V单染法检测)
实验的癌细胞对象包括人食管癌细胞TE-1、人食管癌细胞EC9706。
慢病毒1侵染复数MOI为TE-1细胞：20，EC9706细胞：10。
实验步骤：
癌症细胞用胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5μg/ml聚凝胺(polybrene)。将慢病毒按照侵染复数加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染3天后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；与上清细胞收集于同一5mL离心管中，每组设三个复孔(为保证上机细胞数足够，细胞数目≥5×105个/孔)。1300rmp离心5min，弃上清，用4℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀。1×binding buffer(eBioscience，88-8007)洗涤细胞沉淀一次，1300rmp、3min离心，收集细胞。200μL 1×binding buffer重悬细胞沉淀。加入10μL Annexin V-APC(eBioscience，88-8007)染色，室温避光10-15min。根据细胞量，补加400-800μL 1×binding buffer，上流式细胞仪进行检测。对结果进行分析。
实验结果：
慢病毒1侵染的人食管癌细胞TE-1的凋亡比例是阴性对照病毒侵染的人食管癌细胞TE-1的凋亡比例的4.2倍；慢病毒1侵染的人食管癌细胞EC9706的凋亡比例是阴性对照病毒侵染的人食管癌细胞EC9706的凋亡比例的6.4倍，如图7中A和B所示。
Annexin V单染法检测结果表明，下调基因HIST1H2BD表达后，癌细胞的凋亡比例增加。与对照shCtrl相比，慢病毒1降低基因HIST1H2BD的表达导致凋亡细胞数显著增多，表明基因HIST1H2BD沉默会促进食管癌细胞的凋亡。
实施例9侵染慢病毒的肿瘤细胞细胞凋亡水平检测(caspase3/7酶活检测)
实验的癌细胞对象包括人食管癌细胞TE-1、人食管癌细胞EC9706。
慢病毒2侵染复数MOI为TE-1细胞：20，EC9706细胞：10。
实验步骤：
处于对数生长期的癌细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104个/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到3天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。将Caspase-Glo3/7缓冲液和Caspase-Glo3/7冻干粉置于18-22℃(室温)环境下，待温度达到室温。然后将10ml Caspase-Glo3/7缓冲液加入装有Caspase-Glo3/7底物的棕瓶中，涡旋或反复颠倒直至底物完全溶解，形成Caspase-Glo反应液。细胞计数后，在室温中调整细胞悬液浓度至2×104个/孔，并将目的细胞及阴性对照细胞按照每孔100μl、20000个细胞/孔加入新的96孔板中，同时设置一组不含细胞的空对照组(只加入培养基100μl/孔)，每孔中加入100μl Caspase-Glo反应液，加样过程中注意更换枪头，严格避免交叉污染。将加有细胞的培养板置于摇板机上以300-500rpm的转速轻摇30分钟混匀。然后根据细胞状况在18-22℃室温孵育0.5-3小时(以1-2小时为宜)。使用仪器测定信号强度。数据分析。
实验结果：
慢病毒2侵染的人食管癌细胞TE-1的Caspase3/7活性是阴性对照病毒侵染的人食管癌细胞TE-1的Caspase3/7活性的2.5倍；慢病毒2侵染的人食管癌细胞EC9706的Caspase3/7活性是阴性对照病毒侵染的人食管癌细胞EC9706的Caspase3/7活性的3.4倍，如图8中C和D所示。
caspase 3/7酶活检测结果表明，与对照组相比，慢病毒2降低基因HIST1H2BD的表达后，会致使Caspase3/7活性增加，表明凋亡细胞数增多。因此，基因HIST1H2BD沉默促进食管癌细胞的凋亡。
由上述实验可见，本发明靶向HIST1H2BD的siRNA表现出高效抑制HIST1H2BD表达的活性；两种siRNA分子(SEQ ID NO:1-2和SEQ ID NO:3-4)可以有效抑制TE-1和EC9706细胞的增殖、克隆形成、生长，并显著促进TE-1和EC9706食管癌细胞的凋亡，因而具有应用于抗肿瘤、尤其是食管癌治疗的潜力。
序列表
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子
<130> SHPI2010580
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gcaucucuuc caaggcaau 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 2
auugccuugg aagagaugc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ugacuaaggc ucagaagaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 4
uucuucugag ccuuaguca 19
<210> 5
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 5
cggcaucucu uccaaggcaa ucucgagauu gccuuggaag agaugccg 48
<210> 6
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggugacuaag gcucagaaga acucgaguuc uucugagccu uagucacc 48

Claims (4)

1.一种抑制HIST1H2BD基因的siRNA分子、或者一种包含shRNA分子的shRNA病毒表达载体在制备用于抑制HIST1H2BD表达的食管癌治疗药物中的用途，其中，
所述siRNA分子由如下序列的正义链和反义链组成：
正义链：5’- GCAUCUCUUCCAAGGCAAU-3’即SEQ ID NO: 1，
反义链：5’-AUUGCCUUGGAAGAGAUGC-3’即SEQ ID NO: 2；或者
正义链：5’- UGACUAAGGCUCAGAAGAA -3’即SEQ ID NO: 3，
反义链：5’-UUCUUCUGAGCCUUAGUCA -3’即SEQ ID NO: 4，
所述shRNA分子包含上述的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2，其序列为SEQ ID NO: 5：
5’-CGGCAUCUCUUCCAAGGCAAUCUCGAGAUUGCCUUGGAAGAGAUGCCG-3’；或者
包含上述的SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4，其序列为SEQ ID NO: 6：
5’-GGUGACUAAGGCUCAGAAGAACUCGAGUUCUUCUGAGCCUUAGUCACC-3’。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述shRNA病毒表达载体所用的病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食管癌治疗药物中，siRNA分子或者shRNA病毒表达载体用于抑制食管癌细胞TE-1和EC9706的增殖、克隆形成，促进食管癌细胞TE-1和EC9706的凋亡。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述食管癌治疗药物是注射剂或者液体口服剂。
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