CN104630221B - 抑制肿瘤细胞生长的shRNA及其重组载体与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制AXⅡR基因的表达，进而抑制肿瘤细胞生长的shRNA，及其重组载体，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明设计了针对AXⅡR基因的19‑23个RNAi靶点序列，构建相应的AXⅡR shRNA载体，本发明构建的shRNA载体pFU‑AXⅡR‑shRNA能够显著抑制AXⅡR基因在mRNA水平和蛋白水平的表达，进一步本发明使用慢病毒作为携带shRNA载体，pFU‑AXⅡR‑shRNA能够靶向地将针对AXⅡR基因的shRNA序列导入肿瘤细胞，显著抑制肿瘤细胞的增殖能力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制AXⅡR基因的表达，进而抑制肿瘤细胞生长的shRNA，及其重组载体，以及在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
AXⅡR(Annexin Ⅱ receptor)是2001年在骨髓(BM)间质细胞被分离出含有193个氨基酸，分子量大约为26kDa的蛋白质分子，AXⅡR基因位于5号染色体开放阅读框39，故又称为C5orf39。在人体大多数组织检查检测AXⅡR受体mRNA表达。通过SOSUI和TMPred分析，AXⅡR是含有一个跨膜结构域I型跨膜蛋白。研究表明，MM细胞系和患者CD138+阳性的MM细胞AXⅡR表达升高。在基质细胞/成骨样细胞(OBL)表达的ANXA2和AXⅡR参与MM细胞与基质细胞粘附作用(Lu G,Maeda H,Reddy SV,et al.Cloning and characterization of theannexin II receptor on human marrow stromal cells.J Biol Chem.2006；281(41):30542–30550.Shiozawa Y,Havens AM,Jung Y,Ziegler AM,Pedersen EA,Wang J,Wang J,Lu G,Roodman GD,Loberg RD,Pienta KJ,Taichman RS.Annexin II/annexin IIreceptor axis regulates adhesion,migration,homing,and growth of prostatecancer.J Cell Biochem.2008；105(2):370-80.)。其机制是：ANXA2和AXⅡR通过促进RhoA表达，刺激激活MM细胞的粘附、归巢和生长和通过ERK1/2磷酸化和AKT调节MM细胞的生长。MM的破骨样细胞(OCL)和基质细胞分泌的ANXA2和AXⅡR通过三个途径导致OCL高活性和OBL低活性的不平衡状态：⑴通过黏附MM细胞和激活ERK1/2和AKT通路增强骨髓MM细胞生长；⑵来源于OCL可溶性ANXA2可降解基质细胞，OBL与MM细胞和来源于骨内膜周边血液的MM的ANXA2和AXⅡR相互作用。⑶诱导基质细胞产生RANKL，RANKL刺激OCL的形成，进一步放大MM中的ANXA2作用。其结果是ANXA2和AXⅡR促进MM细胞的生长和骨破坏的恶性循环(D'SouzaS,Kurihara N,Shiozawa Y,Joseph J,Taichman R,Galson DL,Roodman GD.Annexin IIinteractions with the annexin II receptor enhance multiple myeloma celladhesion and growth in the bone marrow microenvironment Blood.2012；119(8):1888–1896.)。因此，BM微环境中ANXA2和AXⅡR为MM细胞与基质细胞粘附，MM细胞归巢和生长提供了一个有利的微环境，在维持OBL与OCL之间平衡、骨髓瘤(MM)细胞分化和归巢、其它恶性肿瘤生长与骨髓转移等方面具有非常重要作用。研究证明，AXⅡR在调节ANXA2促进前列腺癌(Prostate gland，PCa)骨转移过程中起重要作用(Shiozawa Y,Havens AM,Jung Y,et al.Annexin II/annexin II receptor axis regulates adhesion,migration,homing,and growth of prostate cancer.J Cell Biochem.2008；105(2):370–380)。研究显示用抗ANXA2抗体、抗ANXA2抗体和通过shRNA敲除AXⅡR明显抑制PCa细胞与成骨细胞和内皮细胞的粘附性。动物体内实验表明，阻断ANXA2或AXⅡR和shRNA敲除AXⅡR可以抑制PCa细胞的PCa骨转移。其机制是ANXA2或AXⅡR通过趋化因子CXCL12、激活ERK1/2信号、MAPK途径参与PCa细胞的生长和转移。
核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)作为一种基因沉默技术，已被证明可高效和特异地阻断体内特定基因的表达，从而导致细胞特异基因的沉默，使细胞表现某种基因表型的缺失。目前该技术在肿瘤的基因治疗及新药的研发等方面已经显示出广阔前景。主要策略是在体外构建能够表达RNAi的载体，然后转移到细胞内转录RNAi的策略。常用的载体有逆转录病毒、腺病毒和慢病毒。慢病毒表达系统相比于其他表达系统，具有免疫原性低、感染效率高、感染时间长、感染效果稳定、且能感染分裂相细胞和非分裂相细胞等优点。在国外慢病毒载体技术已广泛应用到临床研究阶段，是生物医药研究领域在临床肿瘤的应用技术研究的主要手段。
胰腺导管细胞癌(Pancreatic ductal cell carcinoma，PADC)是胰腺癌最常见和死亡率最高的肿瘤之一，5年生存率低于10％。PADC临床表现缺乏特异性，早期易发生血液转移，确诊时常已发生转移，临床预后极差。
目前尚无文献表明AXⅡR基因与PADC相关，也尚无文献表明抑制AXⅡR基因的表达可以抑制PADC细胞的生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以抑制AXⅡR基因的表达，进而抑制肿瘤细胞生长的shRNA及其重组载体，本发明的另一目的在于提供所述的shRNA 在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第一方面，是提供了一种抑制肿瘤细胞生长的shRNA。
本发明所涉及的肿瘤细胞的生长与AXⅡR基因的表达密切相关，所述的shRNA是通过抑制AXⅡR基因的表达进而抑制肿瘤细胞的生长。
本发明提供了一种抑制肿瘤细胞生长的shRNA，所述ShRNA以选自SEQ ID NO:1-9之任一的序列作为特异性沉默人AXⅡR基因表达的靶点序列：
所述小分子干扰RNA以选自SEQ ID NO:1-9之任一的序列作为特异性沉默人AXⅡR基因，表达的靶点序列是指：该小分子干扰RNA能与SEQ ID NO:1-9中的任一种序列所编码的mRNA片段特异性结合，并特异性沉默人AXⅡR基因的表达。
进一步的，所述AXⅡR基因小分子干扰RNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段和所述反义RNA片段互补，所述正义RNA片段含有SEQ ID NO:1-9中任一序列编码的RNA。
所述正义RNA片段和反义RNA片段存在于两条不同的RNA链上或者存在于同一条RNA链上。
所述正义RNA片段和反义RNA片段的长度均为15—27个核苷酸；较理想的长度均为19-23个核苷酸；最佳的长度均为19、20或者21个核苷酸。
进一步的，所述AXⅡR基因小分子干扰RNA为发夹型单链RNA，包括正义RNA片段、茎环片段(LOOP)和反义RNA片段，正义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔；其中，正义RNA片段和反义RNA片段互补，正义RNA片段的序列选自SEQ ID NO:1-9任一序列编码的RNA。
所述茎环片段结构包括6个或9个碱基。进一步的所述茎环片段的序列选自以下任一：TTCAAGAGA、UUCGCCACC、CTCGAG、CCACACC、AAGCUU。
本发明设计了如下的shRNA 1-4，如表2所示。
shRNA 1：以SEQ ID NO:1的序列作为特异性沉默人AXⅡR基因表达的靶点序列，正义链模板序列SEQ ID NO.10，反义链模板序列SEQ ID NO.11。
shRNA 2：以SEQ ID NO:2的序列作为特异性沉默人AXⅡR基因表达的靶点序列，正义链模板序列SEQ ID NO.12，反义链模板序列SEQ ID NO.13。
shRNA 3：以SEQ ID NO:3的序列作为特异性沉默人AXⅡR基因表达的靶点序列，正义链模板序列SEQ ID NO.14，反义链模板序列SEQ ID NO.15。
shRNA 4：以SEQ ID NO:4的序列作为特异性沉默人AXⅡR基因表达的靶点序列，正义链模板序列SEQ ID NO.16，反义链模板序列SEQ ID NO.17。
作为本发明的优选实施例，本发明提供了一种抑制肿瘤细胞生长的shRNA，所述ShRNA1-4选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的序列作为特异性沉默人AXⅡR基因表达的靶点序列，shRNA1-4的正义链和反义链模板序列见表3，LOOP为TTCAAGAGA。
本发明所述的一种抑制肿瘤细胞生长的shRNA(shRNA1)的序列如下：
TATACTCAGGCTGATGGTAGTTCAAGAGACTACCATCAGCCTGAGTATTTTTTTC(SEQ ID NO:18)；
TCGAGAAAAAAATACTCAGGCTGATGGTAGTCTCTTGAACTACCATCAGCCTGAGTATA(SEQ IDNO:19)。
本发明的第二方面，是提供了一种含上述shRNA的重组表达载体，所述的重组表达载体是将上述的shRNA与慢病毒载体构建而成。
所述的慢病毒载体可选自：pFU-GW，pSicoR，pSicoR，pGK puro，pLentilox3.7，pLKO.1puro，pLKO.3G,pPRIME-TET-GFP-FF3，pPRIME-TREX-GFP-FF3或pRNAT-U6.3慢病毒载体一种。
进一步的，所述能够特异性沉默AXⅡR基因表达的ShRNA1经由慢病毒载体表达。具体而言，这个过程包括：将编码所述AXⅡR基因小分子干扰RNA的DNA片段克隆入慢病毒载体获得AXⅡR基因干扰慢病毒载体，进而利用该AXⅡR基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染PADC细胞并最终表达所述shRNA1。
作为本发明的优选实施例，本发明提供了一种含上述shRNA1的重组表达载体，所述的重组表达载体是将上述的shRNA1与慢病毒载体pFU-GW构建而成。
本发明构建的AXⅡR基因干扰核酸构建体，命名为pFU-AXⅡR-shRNA。构建方法可参考Tai A,Froelich S,Joo KI,Wang P.Production of lentiviral vectors withenhanced efficiency to target dendritic cells by attenuating mannosidaseactivity of mammalian cells.J Biol Eng.2011；5(1):1611-21；Torres V1,Barra L,Garcés F,Ordenes K,Leal-Ortiz S,Garner CC,Fernandez F,Zamorano P.Abicistronic lentiviral vector based on the 1D/2A sequence of foot-and-mouthdisease virus expresses proteins stoichiometrically.J Biotechnol.2010；146(3):138-42.
本发明的第三方面，是提供了上述的shRNA1-4在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，本发明提供了含上述shRNA1的重组表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的肿瘤是AXⅡR基因高表达的肿瘤，例如肺癌、骨髓瘤、乳腺癌、肝癌、胰腺癌等。
特别是，本发明提供了上述的shRNA1-4和含上述shRNA1的重组表达载体在制备预防或治疗胰腺导管细胞癌(PADC)药物中的应用。
本发明所述的shRNA1-4和含上述shRNA1的重组表达载体作为抗肿瘤药物，特别是在制备预防或治疗胰腺导管细胞癌(PADC)药物中的应用，该应用具体为：
将AXⅡR基因作为药物针对PDAC细胞产生RNA干扰作用的靶标，设计siRNA进而合成shRNA，并制备得到含shRNA1-4的重组表达载体，靶向PDAC细胞，通过降低PDAC细胞人AXⅡR基因的表达水平，进而抑制PDAC细胞的生长和侵润。
所述的PADC，具体为人胰腺癌Panc-I、SW-1990和PATU-8988细胞株。
本发明采用的是基因治疗方法，主要是通过降低AXⅡR基因的表达水平抑制PADC细胞的增殖来达到治疗目的的。
具体的，治疗时，将能有效降低AXⅡR基因表达水平的物质给药于患者。进一步的，所述的能有效降低AXⅡR基因表达水平的物质，包括能够特异性沉默人AXⅡR基因表达的小分子干扰RNA(ShRNA)。该ShRNA可以特异抑 制PADC细胞中内源AXⅡR基因的表达的作用。
本发明的AXⅡR基因小分子干扰RNA可用于抑制PADC细胞的增殖，进一步地可以用作治疗或诊断PADC的药物或制剂。AXⅡR基因核酸干扰构建体则可用于制备所述AXⅡR基因小分子干扰RNA。
用作治疗PADC的药物是将安全有效量的AXⅡR基因小分子干扰RNA施用于哺乳动物。具体剂量与给药途径、肿瘤组织病理分期、病人健康状况等因素有关。
本发明提供的ShRNA1或者包含该ShRNA1序列的核酸构建体、AXⅡR-shRNA-LV慢病毒能够特异性抑制AXⅡR基因的表达，尤其是AXⅡR-shRNA-LV慢病毒，能够高效侵染靶细胞和抑制靶细胞AXⅡR基因的表达，进而抑制PADC细胞的生长，促进PADC细胞凋亡，在PADC治疗中具有重要意义。
作为本发明的优选实施例，pFU-AXⅡR-shRNA 1特异性抑制AXⅡR基因的表达最明显。
综上所述，本发明设计了针对AXⅡR基因的19-23个RNAi靶点序列，构建相应的AXⅡR shRNA载体，其中编码序列如SEQ ID NO：18和19的shRNA载体pFU-AXⅡR-shRNA能够显著抑制AXⅡR基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。
本发明使用慢病毒作为携带shRNA载体，pFU-AXⅡR-shRNA能够靶向地将针对AXⅡR基因的shRNA序列导入肿瘤细胞，抑制AXⅡR基因的表达水平，显著抑制肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的AXⅡR基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床治疗方式。
附图说明
图1是shRNA 1、shRNA 2、shRNA 3和shRNA 4抑制Panc-I细胞AXⅡR的mRNA和蛋白表达结果，其中A为在Panc-1细胞，shRNA 1、shRNA 2、shRNA 3和shRNA 4对AXⅡR mRNA表达作用，B为Western Blot方法检测在Panc-1细胞，shRNA 1、shRNA 2、shRNA 3和shRNA 4对AXⅡR蛋白表达作用。
图2是pFU-GW-RNAi质粒DNA图谱示意图。
图3是shRNA结构图。
图4是AXⅡR-shRNA-LV慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I、SW-1990和PATU-8988细胞系4天后，AXⅡR mRNA的表达水平示意图。
图5是检测AXⅡR-shRNA-LV慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I细胞系(图5A)、SW-1990细胞系(图5B)和PATU-8988细胞系(图5C)4天，细胞增殖能力结果示意图。
图6是AXⅡR-shRNA-LV抑制裸鼠成瘤实验。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
下面用实施例进一步阐述本发明。实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2008中所述的条件。
实施例1：AXⅡR基因高效干扰慢病毒的筛选与制备。
1.1 试剂
限制性内切酶Bam H1和Age I及相应Buffer、T4连接酶及其缓冲液、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购于TaKaRa公司。真核表达载体选择常规RNAi载体pFU-GW-RNAi(Addgene公司)。
1.2 对AXⅡR基因的有效的shRNA靶点的筛选
从Genbank调取人AXⅡR(NM_001014279.2)基因信息；武汉淅玛生物技术有限公司设计软件genesilRNAi设计针对AXⅡR基因的有效的shRNA靶点。在AXⅡR基因的编码序列(CD)区域内，获得9个碱基的序列，表1列出了其中9条针对AXⅡR基因的有效shRNA靶点序列。
表1.靶向于AXⅡR基因的shRNA靶点序列
根据表1序列设计并合成特异性siRNA1-4(均由上海Invitrogen公司完成)：
表2.siRNA1-4正义链和反义链序列
图1结果显示，siRNA1,siRNA2,siRNA3和siRNA4在Panc-1细胞对AXⅡR的mRNA表达抑制率分别为76.5％；35.2％，43％和65％左右。表明siRNA1抑制AXⅡR的mRNA效果最好。Western Blot检测结果也表明siRNA1抑制AXⅡR的蛋白表达效果最好。
因此本发明从中筛选出干扰效果最好，即抑制AXⅡR表达效果最显著的是siRNA1。
1.3根据siRNA1序列和选择的酶切位点，设计并合成用于构建真核质粒的pFU-AXⅡR-shRNA 1序列，如图2和图3所示。
1.4.pFU-AXⅡR-shRNA 1构建。
首先双链DNA Oligo制备。根据设计的pFU-AXⅡR-shRNA 1病毒载体构建框架(表3)合成单链DNA oligo片段。然后引物退火形成带双链DNA oligo。
表3.AXⅡR-shRNA 1的病毒载体构建框架
操作流程：把合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却到室温。
配对结果分别如下:
TATACTCAGGCTGATGGTAGTTCAAGAGACTACCATCAGCCTGAGTATTTTTTTC(SEQ ID NO:18)；
TCGAGAAAAAAATACTCAGGCTGATGGTAGTCTCTTGAACTACCATCAGCCTGAGTATA(SEQ IDNO:19)。
1.5AXⅡR-shRNA 1的酶切、连接、转化和PCR鉴定
通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系见表4)，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNAOligo连接，在缓冲体系中于16℃过夜，回收连接产物(表5)。将连接产物转化CaCl2制备的大肠杆菌感受态细胞(转化操作过程见分子克隆实验指南第三版)。在将转化产物溶于10μ1LB培养基，混勻取1μ1作为模板；在以慢病毒载体中shRNA序列的上下游，设计通用PCR引物(上游引物序列:5’-CACGGGCTCTGCAGAGCAT-3’)；下游引物序列：5’-AGGAGGGAGAGTCACTG-3’进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6，反应条件如表7)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建含有SEQ ID NO：18和19的shRNA1载体，命名为pFU-AXⅡR-shRNA 1。
1.6pFU-AXⅡR-shRNA 1制备。
通过限制性内切酶Bam H1(5’-CGGGATCCCG-3’，3’-GCGGATCCGC-5’)和Age I(5’-A/CCGGT-3’，3’-TGGCC/A-5’)使pFU-GW-shRNA1载体线性化。酶切体系如表4所示，37℃，反应1h。通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在缓冲体系(表5)中16℃过夜，回收连接产物。
构建pFU-GW-ShRNA1阴性对照质粒pFU-GW-shRNA-N，阴性对照shRNA靶序列为5’-CTTAGCGATCCGGCTACTT-3’。构建pFU-GW-shRNA1阴性对照质粒时，shRNA靶点合成两端含BamH1和Age I，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pFU-GW-shRNA1。
表4.pFU-GW-shRNA1质粒酶切反应体系
| 试剂 | 体积 |
| DNA质粒1μg/μl | 2μl |
| 100×BSA | 0.5μl |
| 10×buffer1 | 5μl |
| Bam H1(10U/μl) | 1μl |
| Age I(10U/μl) | 1μl |
| H2O | 40.5μl |
| Total | 50μl |
表5.载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系
表6.PCR反应体系
| 试剂 | 体积 |
| 10×buffer | 4μl |
| dNTPs(2.5mM) | 1.6μl |
| 上游引物 | 0.5μl |
| 下游引物 | 0.5μl |
| Taq polymerase | 0.4μl |
| ddH2O | 补足40μl |
表7.PCR反应体系程序设定
2.AXⅡR-shRNA-LV慢病毒构建
美国Axygen公司的质粒抽屉试剂盒提取RNAi质粒。pFU-AXⅡR-shRNA1的DNA,配制100ng/μl质粒DNA储存液。病毒质粒转染前1小时,293T细胞换为无血清培养基。加病毒载体质粒20μg，加入Opti-MEM溶液至总液体量为2.5ml，轻轻的混匀。37℃温育5min。加入2.4mlOpti-MEM溶液和脂质体2000100μl混匀，37℃温育5min。将EP管内的DNA溶液与EP管内的脂质体溶液混匀，37℃温育20min，将混合液加入到293T细胞的培养液中混匀，293T细胞培养12小时后，更换含有10％FBS的常规培养基继续培养。72h后，收集细胞上清液，通过Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，具体步骤：4℃，5000g离心10min,弃细胞碎片；0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；4℃5000g离心10～15min；离心后，将过滤杯与下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，1000g离心3分钟；把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液(AXⅡR-RNAi-LV)。病毒浓缩液分装后于-80℃保存。病毒浓缩液中含有的shRNA序列为SEQ ID NO:18或19。对照慢病毒(N-AXⅡR-RNAi-LV)包装和纯化方 法同pFU-AXⅡR-shRN1A慢病毒，以pFU-AXⅡR-shRNA-N载体代替pFU-AXⅡR-shRNA载体。
实施例2：实时荧光定量RT-PCR检测AXⅡR基因沉默效率
将人胰腺癌Panc-I、SW-1990和PATU-8988细胞进行胰酶消化，细胞数约为5X 105/ml的细胞悬液接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约40％。加入适宜量的AXⅡR-shRNA-N慢病毒，24h后更换培养基，培养5天收集细胞。按Trizol操作程序(Invitrogen公司)抽提总RNA和Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA。反应体系10μ1，各管分别含逆转录缓冲液(5×)3.0μl，dNTPs(10mM)2μ1，RNasin 0.5μ1,M-MLV-RTase 1.0μ1，DEPCH2O 3.5μ1，42℃1h，70℃水浴l0min，使逆转录酶失活。
用Bio-RAD-IQ5Multicolor-Real-Time荧光定量PCR仪定量检测。AXⅡR基因引物序列：上游引物5’-CACGGGCTCTGCAGAGCAT-3’，和下游引物5’-AGGAGGGAGAGTCACTG-3’；以GAPDH为内参，引物序列：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCC-3’，和下游引物5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’。反应体系20μ1，含cDNA 1.0μ1，AXⅡR(或GAPDH)上游、下游引物各0.5μ1，SYBR premix ex taq TM l0μ1，ddH208.0μ1。反应参数：95℃预变性15秒，之后95℃变性5秒，60℃退火延伸30秒，共45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃l min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4秒，记录吸光值和制作熔解曲线。采用2-ΔACt分析法计算侵染了KLFSmRNA的表达丰度。对照组N-AXⅡR-shRNA-LV慢病毒的侵染、培养和检测方法同AXⅡR-shRNA-LV慢病毒。
实验结果如图4所示，人AXⅡR-shRNA-LV慢病毒侵染人胰腺癌Panc-I、SW-1990和PATU-8988细胞系中，AXⅡR-shRNA-LV慢病毒侵染组中AXⅡR mRNA表达水平与对照组相N-AXⅡR-shRNA-LV比分别下降了76.5％、83.8％和73.3％。
实施例3：检测侵染AXⅡR-shRNA-LV慢病毒的PADC细胞的增殖能力
将人胰腺癌Panc-I、SW-1990和PATU-8988细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5X105/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约40％。 加入适宜量的AXⅡR-shRNA-LV病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。完全培养基重悬成细胞悬液10X 105/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μ1。铺好板后，置37℃、5％C02培养箱培养。每天用Cellomics Array Scan筛选分析仪检测次，连续读板4天。对照组N-AXⅡR-shRNA-LV慢病毒的侵染、培养和检测方法同AXⅡR-shRNA-LV慢病毒。
通过调整Cellomics仪的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，分别绘出胰腺癌Panc-I、SW-1990和PATU-8988细胞的增殖曲线对比图，如图5-A、图5-B和图5-C所示。
结果表明，AXⅡR-shRNA_N慢病毒侵染组PADC在细胞体外培养4天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组PADC细胞的增殖速度，活力细胞数目分别下降了61％、90.和78.7％，表明AXⅡR基因沉默导致PADC细胞增殖能力被抑制。
实施例4:AXⅡR-RNAi-LV抑制裸鼠成瘤实验
制备人胰腺癌SW-1990细胞悬液用以注射裸鼠皮下,培养SW-1990细胞的培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM。SW-1990经AXⅡR-RNAi-LV或N-AXⅡR-RNAi-LV干扰慢病毒颗粒转染后置于二氧化碳培养箱中培养。4天后，荧光显微镜下观察GFP表达以明确转染成功。注射前夜换液，注射前PBS洗净，用PBS调节细胞浓度，置于冰上。
按体重将实验裸鼠分为3组每组9只，阴性对照组(SW-1990组)、无关干扰组(N-AXⅡR-RNAi-LV)、实验组(AXⅡR-RNAi-LV)，适应性喂养5天后开始实验；
实验接种前2小时，将实验所需细胞制成细胞悬液，密度调为1×107个/0.2mL；在裸鼠背部靠近右前肢皮下注射0.2mL细胞悬液，SPF级饲养环境下继续饲养裸鼠。每隔一天检测裸鼠体重和肿瘤细胞移植位置变化、皮下结节形成以及直径变化。采用颈椎脱臼法分三批次处死每组裸鼠。分别于肿瘤细胞接种后10天、20天、30天，每批在每组中随机取3只裸鼠，称重处死小鼠，随后剥离肿瘤和称重，采用钝性分离法，保证移植瘤包膜完整；用相机拍照存证后，将肿瘤放入固定液中。
实验结果表明可见，AXⅡR-RNAi-LV可以抑制移植瘤生长，与对照组和 N-AXⅡR-RNAi-LV比较，实验组移植瘤体积从第10天即表现出差异(P＜0.001)；至植瘤后30天结束，AXⅡR-RNAi-LV实验组较对照组对移植瘤生长均保持抑制，移植瘤体积有差异(P<0.001)。组内比较：没有明显差异P≥0.05).这种抑制作用一直到实验结束。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (8)
1.一种抑制肿瘤细胞生长的小分子干扰RNA，所述的小分子干扰RNA的靶点序列为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的一种抑制肿瘤细胞生长的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA特异性沉默人AXⅡR基因的表达。
3.根据权利要求1所述的一种抑制肿瘤细胞生长的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA的序列如下：
正义链序列如SEQ ID NO.10所示，
反义链序列如SEQ ID NO.11所示。
4.根据权利要求1所述的一种抑制肿瘤细胞生长的小分子干扰RNA，其特征在于，所述的小分子干扰RNA为shRNA，表达该shRNA的双链DNA Oligo的序列如SEQ ID NO:18和19所示。
5.一种重组表达载体，所述的重组表达载体是由序列如SEQ ID NO:18和19所示的双链DNA Oligo表达的shRNA与慢病毒载体构建而成。
6.根据权利要求5所述的一种重组表达载体，其特征在于，所述的慢病毒载体选自以下任一：pFU-GW、pSicoR、pSicoR、pGK puro、pLentilox 3.7、pLKO.1puro、pLKO.3G、pPRIME-TET-GFP-FF3、pPRIME-TREX-GFP-FF3、pRNAT-U6.3。
7.一种如权利要求1至4任一项所述的抑制肿瘤细胞生长的小分子干扰RNA在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是胰腺癌。
8.一种如权利要求5或6所述的重组表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是胰腺癌。
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