CN104593421A - 一种抑制胶质瘤生长的过表达bdnf的间充质干细胞的制备方法及其临床应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞；体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124表达，抑制了其靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力，体内实验中抑制胶质瘤的生长和转移复发；本发明还提供了过表达BDNF的间充质干细胞及其治疗胶质瘤的临床应用，该间充质干细胞将能抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的方法以及通过所述方法获得过表达BDNF的间充质干细胞，特别地，本发明涉及的过表达BDNF的间充质干细胞体外实验中启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124的表达，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力，体内实验中抑制了胶质瘤的生长和转移；本发明的过表达BDNF的间充质干细胞可以用于临床治疗胶质瘤，针对性地抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。
背景技术
胶质瘤的发病是一个多因素、多步骤的、多种癌基因和/或抑癌基因参与的协同积累的过程。迄今为止，传统的手术、放疗、化疗等治疗方法治愈率仍然很低，肿瘤复发率高，预后极差。传统的胶质瘤治疗主要作用于肿瘤的实体，其疗效有限，胶质瘤本身的复发转移的能力使得手术后肿瘤再次生长和转移。原因是肿瘤本质上具有抵抗化学疗法和放射治疗的能力或在治疗过程中获得此种能力。而执行这一能力的可能是胶质瘤干细胞(Glioma stem cells，GSC)，其中的机制包括自噬作用、环氧化酶-2依赖的炎症反应、抑制凋亡、ATP结合转运蛋白的外排功能、Notch信号通路介导作用、DNA损伤修复反应。
针对胶质瘤干细胞靶向治疗目前研发一些治疗手段，如通过靶向GSC杀伤可以逆转肿瘤放化疗抵抗，提高放化疗的敏感性；针对血管或内皮细胞的抗血管微环境的治疗，均能干扰肿瘤干细胞微环境的功能，在抑制肿瘤生长的同时还消弱了肿瘤的根本；可以识别和清除GSCs的免疫细胞治疗，也为抗胶质瘤治疗提供新的思路。
本发明提供了一种在胶质瘤中低表达的微小核糖核酸124(microRNA-124，miR-124)，造成胶质瘤干细胞增殖和成球生长，使得胶质瘤生长和转移复发。然而，提高miR-124在胶质瘤中的表达，抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，引起胶质瘤缩小和抑制转移与复发。本发明以人间充质干细胞作为载体过表达脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，能有效地启动胶质瘤干细胞中miR-124的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞的增殖与成球生长，抑制胶质瘤的生长与转移复发。人间充质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以作为异体规模化生产，是基因表达理想的载体，因而，本发明抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞制备简单，能个体化临床治疗胶质瘤患者，也能作为规模化生产的产品应用于临床治疗胶质瘤。
发明内容
胶质母细胞瘤高度不均一性，分为三个等级，最高级的是肿瘤干细胞，位于塔顶，接下来是分化阶段的肿瘤祖细胞，位于塔底的是已分化的大量肿瘤细胞。现在的治疗往往针对的是肿瘤实体中的分化细胞，而忽视了前两种细胞，虽然这些干细胞只占胶质母细胞瘤的很小一部分，但很可能负责肿瘤的起源和生长，侵袭和复发及远处播散。胶质瘤干细胞具有下列特性：自我更新、无限增殖、多向分化潜能、表达神经干细胞的标志物、培养于干细胞培养基中能形成细胞球、极小数量接种于免疫缺陷小鼠颅内能独立成瘤。GSCs的起源至今未明，可能来源于遗传或表观遗传突变的神经干细胞或祖细胞，或者星形胶质细胞经过一系列的突变或重新编程而来。GSCs比一般细胞对放射治疗和化学治疗更加耐受。GSCs的这些特性被视为是胶质母细胞瘤恶性表型和术后复发的根源，GSCs是胶质母细胞瘤的“种子细胞”，针对GSCs的研究或治疗更能模拟胶质母细胞瘤的真实情况，可见GSCs已成为研究治疗脑胶质母细胞瘤的新工具。
本发明是我们长期通过基础研究的科研成果，发现miR-124在胶质瘤发生发展中发挥着重要作用，是胶质瘤干细胞赖以生存的抑制分子。我们研究发现miR-124可通过靶向多个基因，包括白介素6(interleukin 6，IL-6)信号通路中的一个已知元件信号传导与转录激活因子3(Signal transducer and activator oftranscription 3，STAT3)，白介素1(IL-1)信号通路中的一个已知元件核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，以及白介素8(IL-8)信号调控因子蛋白激酶B((serine/threonrine kinase，Akt)等，IL-6、IL-1和IL-8信号可能刺激GSCs的生长和生存，其受体和糖蛋白优先表达于GSCs，阻断其受体或干扰炎性分子的表达能抑制GSCs的增殖达到阻碍肿瘤的生长及延长荷GSCs来源的胶质瘤鼠的生存期及明显消弱了GSCs的增殖能力。在人类胶质瘤细胞中缺氧可导致miR-124下调，从而使得STAT3、NF-κB和Akt激活，促使人类胶质瘤干细胞的自我更新、增殖和侵袭能力。
本发明通过研究发现了BDNF可以与胶质瘤干细胞膜上BDNF受体结合激活环腺苷酸反应元件结合蛋白1(cyclic AMP-response element bindingproteinl，CREB1)的表达，miR-124启动子中存在着CREB1结合域，通过CREB1与miR-124启动子域结合活化miR-124表达，高表达的miR-124可以靶向作用于STAT3、NF-κB和Akt，抑制其的激活，从而影响炎性分子IL-6、IL-1和IL-8信号刺激的GSCs生长和生存，同时也干扰了IL-6、IL-1和IL-8等炎性分子的分泌，阻断了GSCs自分泌刺激机制，抑制了GSCs的增殖和自我更新能力，导致阻止了胶质瘤生长与转移复发。
本发明提供了一种抑制胶质瘤生长的BDNF4过表达间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞。BDNF基因片段通过正常组织中DNA聚合酶链式反应(DNA polymerase chain reaction，PCR)扩增或者化学合成法获得，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到病毒表达系统上后转染人间充质干细胞，获得过表达BDNF的间充质干细胞。
人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSC)具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、神经、内皮等多种组织细胞。本发明利用其干细胞归巢趋化功能，可以定向迁移到脑部受损的部位，发挥着神经细胞修复和免疫调控的作用，是目的基因过表达理想的载体，能定位到治疗部位过表达BDNF，激活胶质瘤表达miR-124从而达到治疗癌症的作用。
由于人间充质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人间充质干细胞来源人废弃脐带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织等，优选地，来源于人自体骨髓。
本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。
本发明提供所述的过表达BDNF的间充质干细胞，体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中miR-124表达，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力；体内实验中抑制胶质瘤的生长和转移复发。在胶质瘤动物模型体内杀瘤试验中，该过表达BDNF的间充质干细胞，启动了胶质瘤中miR-124表达并作用于其靶基因STAT3、Akt和RelA，靶基因激活受阻而且表达显著下降，炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌也明显降低，使得胶质瘤大小显著缩小，并且转移明显得到抑制。
本发明还提供一种制备过表达BDNF的间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
1)人间充质干细胞基础培养基；
2)包装好的BDNF过表达病毒载体；
3)消化细胞的酶；
4)细胞因子以及；
5)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得人间充质干细胞的来源为人废弃脐带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织等，优选地，来源于人自体骨髓。
所述的BDNF过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。
本发明还提供所述过表达BDNF的间充质干细胞的应用，能用于抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。
附图说明
图1表示荧光显微镜下实施例1中GFP阳性间充质干细胞的绿色荧光图片
图2表示与实施例1中制备的BDNF过表达人间充质干细胞共培养后胶质瘤干细胞MTT法检测增殖曲线
图3表示与实施例1中制备的pGC-BDNF-MSC共培养的GSC细胞检测CD133阳性经流式细胞图
图4表示与实施例1中制备的pGC-BDNF-MSC共培养的GSC细胞荧光定量PCR检测miR-124及其靶基因STAT3、Akt和RelA表达结果图以及ELISA检测炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌结果图
图5表示动物模型体内实验实施例1中制备的pGC-BDNF-MSC治疗后荧光定量PCR检测miR-124及其靶基因STAT3、Akt和RelA表达结果图以及ELISA检测炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌结果图
具体实施方式
本发明提供了一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法，其中，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞。
BDNF基因片段通过正常组织中PCR扩增或者化学合成法获得，引入双酶切位点连接到病毒载体上，取对数生长期的293T细胞，以(2～2.5)×106细胞数接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，细胞融合度为60％～80％时利用LipofectamineTM 2000转染进行病毒包装。转染分为2组：阳性组和对照组。48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5分钟后，用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染。将两组病毒上清分别感染人间充质干细胞，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培养基，更换为DMEM/F12(1∶1)完全培养基，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带BDNF目的基因病毒转染人间充质干细胞成功，获得过表达BDNF的间充质干细胞。
人间充质干细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，这样一来制备抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞简单，能做到个体化应用，也能作为规模化生产的产品。人间充质干细胞来源人废弃脐带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织等，优选地，来源于人自体骨髓。
本发明所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统，例如pLVTHM、psPAX2、pMD2.G；pGC-LV、pHelper 1.0和pHelper 2.0以及PLVX-ZsGreen-miRNA-Puro、pHelper 1.0和pHelper 2.0等，均为商业化产品，从商业公司可以购买到。
本发明提供所述的过表达BDNF的间充质干细胞，在体外实验中与胶质瘤干细胞共培养24-72小时后，通过荧光定量PCR检测miR-124表达显著提高，同时检测miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA表达明显下降，ELISA定量检测IL-6、IL-1和IL-8分泌量也明显下降。通过细胞增殖实验MTT法检测胶质瘤干细胞增殖能力下降，CD133阳性细胞明显减少，表明胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力受到显著的抑制。
本发明提供所述的过表达BDNF的间充质干细胞移植到胶质瘤SCID裸鼠模型体内进行抗肿瘤试验，该过表达BDNF的间充质干细胞，通过荧光定量PCR检测miR-124表达显著提高，而检测miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA表达明显下降，ELISA定量检测IL-6、IL-1和IL-8分泌量也明显下降。与对照组对比，过表达BDNF的间充质干细胞移植组中胶质瘤大小显著缩小，并且转移得到明显抑制。
本发明还提供一种制备过表达BDNF的间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
1)人间充质干细胞基础培养基；
2)包装好的BDNF过表达病毒载体；
3)消化细胞的酶；
4)细胞因子以及；
5)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括本发明中所述的方法。培养获得人间充质干细胞的来源为人废弃脐带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织等，优选地，来源于人自体骨髓。
所述的BDNF过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。
通过本发明提供的试剂盒制备的过表达BDNF的间充质干细胞，同样在体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中miR-124表达，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力；在胶质瘤动物模型体内杀瘤试验中，该过表达BDNF的间充质干细胞，也启动了胶质瘤中miR-124表达并作用于其靶基因STAT3、Akt和RelA，靶基因激活受阻而且表达显著下降，炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌也明显降低，使得胶质瘤大小显著缩小，并且转移明显得到抑制。
本发明还提供所述过表达BDNF的间充质干细胞的应用，能用于抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。
以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。
实施例1 BDNF过表达人间充质干细胞的制备
以基因组DNA为模板PCR扩增BDNF，将pFU-GW载体Xba I和Hpa I双酶切后，在T4DNA连接酶(日本TAKARA公司)作用下，与双链BDNF于4℃12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞后进行阳性克隆PCR鉴定。测序鉴定正确后进行慢病毒包装，感染前24小时，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿。待细胞密度达70％-80％时，DNA溶液(pGC-LV-BDNF载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg，购自美国Invitrogen公司)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5mL，加入离心管中，室温下温育5分钟。取100μLLipofectamineTM 2000(购自美国Life公司)试剂在另一离心管中与2.4mLOpti-MEM(购自美国Life公司)混合，室温下温育5分钟。然后将分别含有DNA和脂质体溶液混合，轻柔混匀，室温下温育20分钟。将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。培养8h后倒去含有感染混合物的培养基，每瓶细胞加入20mL的PBS液，轻轻左右晃动培养瓶以洗涤残余的感染混合物，然后倒去。每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25mL，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时。收集感染后48小时的293T细胞上清液，于4℃、4000×g离心10分钟，除去细胞碎片。0.45μm滤器(购自美国BD公司)过滤上清液于40mL超速离心管中，再离心浓缩病毒液至所需浓度。收集病毒液，分装后-80℃长期保存。取其中1支用孔稀释法进行病毒滴度测定。
采用DMEM/F12(1∶1)(含5％胎牛血清，购自美国Gibco公司)培养液从废弃脐带中培养获得间充质干细胞，取培养5代以上的脐带MSCs，以2×109cells/L的密度接种至24孔板2mL，培养2天至细胞融合度达到30％-50％。在完全培养基中加入含有BDNF和GFP(绿色荧光报告基因)的慢病毒载体上清，加上终浓度为5mg/L的聚凝胺(polybrene)。共感染24小时，换新鲜培养基。感染后每天倒置荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并计数GFP阳性细胞的百分比，图1中A为明场下MSC图片，B为暗场下GFP荧光显色的MSC图片，结果显示荧光显微镜下GFP阳性间充质干细胞可以达到92％，表明BDNF基因通过慢病毒系统转染成功了人间充质干细胞(pGC-BDNF-MSC)，并在人间充质干细胞中过表达。
实施例2 BDNF过表达人间充质干细胞体外共培养抑制胶质瘤干细胞的作用
将上述实施例1中制备的BDNF过表达人间充质干细胞培养于DMEM/F12(1∶1)(含5％胎牛血清)培养液中，胶质瘤干细胞(来自临床胶质瘤母细胞瘤手术组织，经体外培养获得的)培养于DMEM/F12(1∶1)(含1倍B27，购自美国Gibco公司；20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子，购自美国peprotech公司)培养液中。采用Transwell(美国corning公司)共培养体系，取pGC-BDNF-MSC悬液(细胞数约为6×105)接种到PBS浸润的上层小室中，先放置有DMEM/F12(1∶1)(含5％胎牛血清)培养液的孔板中，放置37℃、5％CO2培养箱中贴壁4小、时后，用镊子将小室转移放于培养胶质瘤干细胞的孔板中，避免底部产生气泡，放回37℃、5％CO2培养箱中培养，共培养进行下述实验。对照组为单独于DMEM/F12(1∶1)(含1倍B27、20ng/mL表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维生长因子)培养的胶质瘤干细胞。
MTT法检测胶质瘤干细胞增殖：在共培养1天后开始，取出培养pGC-BDNF-MSC的小室，向培养胶质瘤干细胞的孔板中每孔加入10μl 5mg/ml的MTT(美国Sigma公司)，无需换液；4h后，吸弃培养液，每孔加入100μl DMSO终止反应，振荡器振荡5-10min，酶标仪490nm检测OD值，对数据进行统计和细胞增殖曲线分析。图2为胶质瘤干细胞MTT法检测增殖曲线，结果显示与实施例1中制备的BDNF过表达人间充质干细胞共培养后胶质瘤干细胞增殖能力明显低于正常对照的胶质瘤干细胞，增殖能力显著抑制。
分别取1份50μL(1×106个)与pGC-BDNF-MSC共培养36小时后的GSC和正常培养的GSC细胞悬液分别添加到一支含有20μL PE-CD133(美国BD公司)，另一支含有20μL PE-IgG1(美国BD公司)的1ml离心管中。混匀后置于4℃冰箱染色30分钟，然后用1mL的1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次，最后用0.5mL的1×PBS重悬洗涤后的细胞，所得流式抗体染色后的细胞用FACSCalibur基本型流式细胞仪检测(美国BD公司)。图3中A为正常培养的GSC细胞经流式细胞仪检测的CD133阳性结果为35.45％，B为与pGC-BDNF-MSC共培养的GSC细胞经流式细胞仪检测的CD133阳性结果仅为3.79％，表明与pGC-BDNF-MSC共培养36小时后的GSC标志物CD133明显下降，干细胞逐渐分化，干细胞特征逐渐削减。
分别取1份50μL(1×106个)与pGC-BDNF-MSC共培养36小时后的GSC和正常培养的GSC细胞悬液经Trizol试剂(美国Invitrogen公司)根据使用说明书提取RNA，逆转录PCR成cDNA后荧光定量PCR检测miR-124及其靶基因STAT3、Akt和RelA表达水平。图4A为荧光定量PCR检测miR-124及其靶基因STAT3、Akt和RelA表达结果图，与正常培养GSC比较，与pGC-BDNF-MSC共培养后GSC显著表达miR-124提高，其靶基因STAT3、Akt和RelA表达均明显下降，表明MSC过表达BDNF后刺激了GSC中miR-124表达上调，而miR-124抑制了其靶基因STAT3、Akt和RelA的表达。
分别取1份与pGC-BDNF-MSC共培养36小时后的GSC和正常培养的GSC的培养上清，各200μl，使用ELISA试剂盒(美国R&D公司)根据使用说明书检测炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌水平。图4B为ELISA检测炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌结果图，与正常培养GSC比较，与pGC-BDNF-MSC共培养后GSC中IL-6、IL-1和IL-8分泌均明显下降，表明MSC过表达BDNF后刺激了GSC中miR-124表达上调，其靶基因STAT3、Akt和RelA表达下调，从而分别影响了各自信号通路中炎性分子IL-6、IL-1和IL-8的分泌。
实施例3BDNF过表达人间充质干细胞在动物体内抗瘤实验中的作用
胶质瘤干细胞建立荷胶质瘤SCID裸鼠模型(参见“靶向人肿瘤血管和人癌症干细胞治疗的评估新模型”，Burgos-Ojeda D等人，癌症研究杂志，第445卷，第3555-3565页，2013年7月15日；A novel model for evaluating therapiestargeting human tumor vasculature and human cancer stem-like cells.Cancer Res.2013；73(12)：3555-3565.)，随机分为A、B和C 3组，每组6只：A组为上述实施例1中制备的BDNF过表达人间充质干细胞治疗组；B组为人间充质干细胞治疗组；C组为同体积生理盐水空白组。A组在第0天荷瘤鼠模型尾静脉注射2×106个/mL BDNF过表达人间充质干细胞，B组在第0天荷瘤鼠模型尾静脉注射2×106个/mL人间充质干细胞，各1mL，7天后再同样剂量治疗1次。治疗后分别于7、14、21和28d拉颈处死，取荷胶质瘤SCID裸鼠模型肿瘤组织和眼眶静脉采血，计算鼠模型荷瘤大小。
经BDNF过表达人间充质干细胞对荷瘤鼠模型的抑制生长情况(mm3，)见表1。
表1
注：*空白组和治疗组A和B相比P远小于0.01；#治疗组A与治疗组B相比P＜0.01。此外，有关实施例1所得BDNF过表达人间充质干细胞引发的体内杀瘤活性，远远好于人间充质干细胞的体内杀瘤活性。
分别取1份治疗组A、治疗组B和空白组C 28天的肿瘤组织，各1克，经Trizol试剂(美国Invitrogen公司)根据使用说明书提取RNA，逆转录PCR成cDNA后荧光定量PCR检测miR-124及其靶基因STAT3、Akt和RelA表达水平。图5A为动物模型治疗后荧光定量PCR检测miR-124及其靶基因STAT3、Akt和RelA表达结果图，与MSC治疗组B和空白组C比较，BDNF过表达人间充质干细胞治疗组A显著表达miR-124提高，其靶基因STAT3、Akt和RelA表达均明显下降，表明动物体内MSC过表达BDNF后刺激了胶质瘤中miR-124表达上调，而miR-124抑制了其靶基因STAT3、Akt和RelA的表达。
分别取28天1份治疗组A、治疗组B和空白组C，各100μl，使用ELISA试剂盒(美国R&D公司)根据使用说明书检测炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌水平。图5A为ELISA检测动物模型治疗后炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌结果图，与MSC治疗组B和空白组C比较，BDNF过表达人间充质干细胞治疗组A中IL-6、IL-1和IL-8分泌均明显下降，表明动物体内MSC过表达BDNF后刺激了胶质瘤中miR-124表达上调，其靶基因STAT3、Akt和RelA表达下调，从而分别影响了各自信号通路中炎性分子IL-6、IL-1和IL-8的分泌。
Claims (10)
1.一种抑制胶质瘤生长的过表达BDNF的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括通过获取BDNF基因片段，构建到病毒载体上，转染人间充质干细胞制备成过表达BDNF的间充质干细胞；体外实验中与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124表达，抑制miR-124靶基因STAT3、Akt和RelA的表达，从而抑制了胶质瘤干细胞增殖和成球生长能力；体内实验中抑制胶质瘤的生长和转移复发。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过正常组织中PCR扩增或者化学合成BDNF基因片段，经酶切位点连接到病毒载体上，包装到病毒表达系统上后转染人间充质干细胞，获得过表达BDNF的间充质干细胞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源人废弃脐带、胎盘、自体骨髓或自体脂肪组织；优选地，来源于人自体骨髓。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述病毒表达系统为慢病毒系统、腺病毒系统、逆转录病毒系统；优选地，选择慢病毒表达系统。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达BDNF的间充质干细胞，体外与胶质瘤干细胞共培养，启动了胶质瘤干细胞中microRNA-124的表达，其靶基因STAT3、Akt和RelA表达显著下降，使得胶质瘤干细胞增殖能力和成球生长能力明显地降低。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述过表达BDNF的间充质干细胞，在动物体内杀瘤试验中促使了胶质瘤中microRNA-124的表达，使得其靶基因STAT3、Akt和RelA表达显著下降，炎性分子IL-6、IL-1和IL-8分泌也明显降低，使得胶质瘤大小显著缩小并且转移明显得到抑制。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，BDNF基因片段通过正常组织中PCR扩增或者化学合成法获得，引入双酶切位点连接到病毒载体上，取对数生长期的293T细胞，以(2～2.5)×106细胞数接种于10cm的细胞培养皿中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时，细胞融合度为60％～80％时利用LipofectamineTM2000转染进行病毒包装；转染分为2组：阳性组和对照组；48～72小时后收集病毒上清液，4℃、3000r/min离心5分钟后，用直径为0.45μm的滤膜过滤分装，用于细胞感染；将两组病毒上清分别感染人间充质干细胞，同时加入工作液浓度为5μg/ml的聚凝胺以增加感染效率，次日去除含病毒的培养基，更换为DMEM/F12完全培养基，感染后72小时荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的发光情况，GFP显色超过90％以上，表明携带BDNF目的基因病毒转染人间充质干细胞成功，获得过表达BDNF的间充质干细胞。
8.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，
以基因组DNA为模板PCR扩增BDNF，将pFU-GW载体Xba I和Hpa I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，与双链BDNF于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞后进行阳性克隆PCR鉴定；测序鉴定正确后进行慢病毒包装，感染前24小时，以含10％血清的培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，重新接种于15cm细胞培养皿；待细胞密度达70％-80％时，DNA溶液(pGC-LV-BDNF载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg，购自美国Invitrogen公司)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5mL，加入离心管中，室温下温育5分钟；取100μL LipofectamineTM 2000试剂在另一离心管中与2.4mL Opti-MEM混合，室温下温育5分钟；然后将分别含有DNA和脂质体溶液混合，轻柔混匀，室温下温育20分钟；将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养8h后倒去含有感染混合物的培养基，每瓶细胞加入20mL的PBS液，轻轻左右晃动培养瓶以洗涤残余的感染混合物，然后倒去；每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基25mL，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时；收集感染后48小时的293T细胞上清液，于4℃、4000×g离心10分钟，除去细胞碎片；0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中，再离心浓缩病毒液至所需浓度；收集病毒液，分装后-80℃长期保存；取其中1支用孔稀释法进行病毒滴度测定；其中，所述DNA溶液含：pGC-LV-BDNF载体20μg、pHelper 1.0载体15μg和pHelper 2.0载体10μg；
采用DMEM/F12培养液从废弃脐带中培养获得间充质干细胞，取培养5代以上的脐带MSCs，以2×109cells/L的密度接种至24孔板2mL，培养2天至细胞融合度达到30％-50％；在完全培养基中加入含有BDNF和绿色荧光报告基因GFP的慢病毒载体上清，加上终浓度为5mg/L的凝聚胺(polybrene)；共感染24小时，换新鲜培养基；感染后每天倒置荧光显微镜下观察细胞GFP表达情况，并计数GFP阳性细胞的百分比；荧光显微镜下GFP阳性间充质干细胞达到92％，表明BDNF基因通过慢病毒系统转染成功了人间充质干细胞(pGC-BDNF-MSC)，并在人间充质干细胞中过表达。
9.一种制备权利要求1-8任一项所述过表达BDNF的间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)人间充质干细胞基础培养基；
2)包装好的BDNF过表达病毒载体；
3)消化细胞的酶；
4)细胞因子以及；
5)使用说明书；
其中，所述使用说明书包括权利要求1-8所述的方法；优选，所述BDNF过表达病毒载体包括病毒、腺病毒、逆转录病毒；更优选地，选择慢病毒表达系统。
10.权利要求1-9任一项所述过表达BDNF的间充质干细胞的应用；优选，其用于抑制胶质瘤生长，诱导胶质瘤干细胞分化治疗，从而达到靶向清除胶质瘤干细胞的目的。
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