CN106011074A - 一种高表达cxcr5的间充质干细胞及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

一种高表达CXCR5的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)及其制备方法和用途。过表达CXCR5，可以使MSCCXCR5在体内定向迁移至炎症区域发挥免疫调节的能力，而不是随机散乱分布在体内各个部位。用这种间充质干细胞治疗疾病将更有靶向性和有效性，将有效提高MSC的治疗效果。

Description

一种高表达CXCR5的间充质干细胞及其制备和用途
技术领域
本发明涉及一种高表达CXCR5的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)及其制备方法和用途。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)，是最早从骨髓中发现的一种非造血类的干细胞(Friedenstein,A.J.,et al,1974)，参与构成骨髓造血微环境，对造血干细胞的增殖与分化具有明显支持作用(Mendez-Ferrer,S.,et al.,2010)。MSC广泛分布于全身各个组织和器官，除骨髓外，还可以从脐带，脐血，牙龈，骨骼肌等分离得到。MSC还有向成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，心肌细胞等分化的能力。MSC缺乏特异性标志物，主要表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166等间质标志物，不表达CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45等造血相关标志物；不表达或低表达HLA-I类分子，不表达HLA-II类分子。
近年来MSC独特的免疫调节作用引起了越来越多关注。体外实验表明，MSC可抑制特异性刺激的混合淋巴细胞反应(MLR)中或者非特异性的丝裂原植物凝集素(PHA)刺激诱导的T淋巴细胞的增殖(Di Nicola,M.,et al.,2002)。MSC能诱导调节性T细胞(Treg)的扩增，抑制杀伤性T细胞的细胞毒功能(Aggarwal,S.,et al.,2005)。MSC能影响B细胞的活化、增殖、趋化以及其抗体的产生(Corcione,A.,et al.,2006)。MSC能抑制DC的生成，增殖，阻断DC的成熟和分化，从而减弱DC的抗原提成能力(Beyth,S.,et al.,2005)。MSC能强烈抑制IL-2活化的NK细胞的增殖，细胞因子的分泌及其杀伤功能。MSC调控免疫细胞的机制尚不完全清楚，其免疫调节作用不受MHC限制，存在直接接触作用方式以及分泌可溶性因子转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、肝细胞成长因子(hepatocyte growthfactor,HGF)、肿瘤坏死因子α刺激基因-6(tumornecrosis factor-αstimulated gene-6,TSG-6)等发挥作用(Gebler,A.,O.Zabel and B.Seliger,2012)。由于MSC易于分离扩增，免疫原性低，具有旁分泌和免疫调节的功能，所以MSC在细胞治疗方面应用前景广阔。目前间质干细胞的临床试验有600多项(April 2015,clinicaltrials.gov)，适应症包括自身免疫病、移植排斥、骨/软骨疾病、心血管疾病、神经系统疾病等。申请人在前期工作中治疗慢性移植物抗宿主病的有效性证实了MSC对疾病的免疫调节功能(Peng,Y.,et al.,2015)。据报道，MSC还可用于治疗多发性硬化症(Li,J.F.,et al.,2014)，溃疡性结肠炎(Duijvestein,M.,et al.,2010)，糖尿病(Holmes,et al.,2014)等。
然而我们发现，在临床治疗中，效果有时并不理想。有些研究者认为虽然MSC在体外有很好的免疫调节功能，例如能够有效抑制T细胞增殖等，但静脉输注的MSC并不能完全治疗小鼠cGVHD(Sudres M.et al.,2006)；另一些研究者称MSC在治疗肝脏损伤时，发现聚集在损伤部位的MSC数量少，并认为这可能是MSC治疗效果局限的主要原因(Gao J.etc,2001)；还有研究者通过示踪发现MSC进入体内后散乱地分布在各个器官，例如肺、肝、骨髓等等(Paul Lin.et al.,2013)，相当于MSC在体内“被稀释”，真正到达关键部位发挥作用的MSC数量并不可观，那么发挥的免疫调节功能也将大打折扣。所以，MSC在临床治疗中面临的主要问题是MSC输注后在体内无序地分布。
趋化因子在疾病发生发展的过程中至关重要，而MSC表面表达的趋化因子受体有很多，如CCR1，CCR4，CCR6，CCR7，CCR9，CCR10，CXCR4，CXCR5，CXCR6，CX3CR等，不仅本身表达量低，并且在扩增传代之后，MSC几乎不再表达这些受体(Sarkar,D.,et al.,2011)。而骨髓中MSC的含量仅仅占0.001-0.01％，健康捐献者一次捐献的骨髓分离出原代MSC数量有限，一般治疗cGVHD病人一次输注的细胞量为每公斤体重0.4-9×106个，一次治疗所需的细胞量就达约0.2-4.5×108个。所以，MSC体外大量扩增是目前为达到临床应用中所需的细胞量的基本方法。这就可能由于MSC受体表达的丢失，造成治疗的不稳定性。
现在很多研究工作者将提高MSC治疗的靶向性作为研究方向：如用病毒转染的方法过表达CXCR4，促进MSCs向大脑损伤部位趋化(Wang,Z.,et al.,2015)；用IGF-1预处理MSCs，增加MSCs上CXCR4的表达(Xinaris,C.,et al.,2013)；通过增加粘附分子PSGL-1和SLeX，增强MSCs向炎症内皮细胞的黏附能力(Levy,O.,et al.,2013)；将MSC上CD44分子转化为E-selectin/L-selectin，增加MSCs向骨髓的趋化(Sackstein,R.,et al.,2013)等等。
趋化因子CXCL13在炎症反应中起到重要作用，例如在自身免疫性滑膜炎的炎性滑膜液中检测到CXCL13的mRNA高表达(William H,et al.,2013)；在小鼠回肠炎的疾病模型中，也发现了在炎症部位高表达趋化因子CXCL13(A Viejo-Borbolla,et al.,2010)；在神经莱姆病中，脑脊液中的CXCL13含量甚至可以作为急性发作期的高敏感性的一个指标(Katie Kingwell，2011)。我们在小鼠接触性超敏反应(contact hypersensitivity，CHS)模型中也发现了随着局部耳朵炎症的发展，CXCL13呈现逐渐升高的趋势，并且这种模型发病快，炎症反应局限，利于观察结果。于是我们利用这一特点，构建了趋化因子CXCL13相对应的受体CXCR5的质粒，利用慢病毒转染的方法，使MSC表达受体CXCR5，并在疾病高峰期输注过表达CXCR5的MSC，通过观察，我们发现过表达CXCR5的MSC治疗效果显著，在体内时能够定向迁移至病损部位，大大提高MSC在体内发挥免疫调节能力的效率。
发明内容
本发明通过构建表达CXCR5的质粒，利用慢病毒转染的方法，使MSC过表达受体CXCR5，使MSC由静脉输注入体内时能够定向迁移至病损部位，而不是无序地分散在体内各个部位，大大提高MSC在体内发挥免疫调节能力的效率。
本发明所采用的技术方案如下：
提供一种高表达CXCR5的间充质干细胞。
一种所述间充质干细胞在制备治疗下列疾病之一的药物中的用途：自身免疫病、移植排斥、骨/软骨疾病、心血管疾病、神经系统疾病等。
一种包含所述间充质干细胞的药物。
一种制备所述间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
1)收集健康个体外周血中单个核细胞并培养以获得获得外周血单个核细胞；
2)提取外周血单个核细胞RNA；
3)逆转录；
4)PCR反应和回收CXCR5cDNA片段；
5)克隆与转化；
6)构建质粒；
7)病毒包装；
8)病毒转染间充质干细胞。
进一步，步骤4)中引物为：
F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA。
进一步，步骤6)中引物为
F-attB1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGC TAACGCTGG
R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTG AGAGAGGTGGCA。
进一步，步骤6)中质粒结构为：
pFinal/PGK-puro-EF1α-CXCR5-IRES-EGFP。
进一步，步骤7)中病毒为慢病毒。
一种CXCR5引物序列：
F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA；
用于制备所述的间充质干细胞。
一种PCR引物序列：
F-attB1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGC TAACGCTGG
R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTG AGAGAGGTGGCA
用于制备所述的间充质干细胞。
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著地进步，具体地说，在不影响MSC本身表型、分化能力及免疫调节能力的基础上，过表达CXCR5，可以使MSCCXCR5在体内定向迁移至炎症部位。与普通MSC不同的是，MSCCXCR5能够快速有效地迁移至病损部位发挥免疫调节的能力，而不是无目的地随机分布在体内各个部位。
治疗自身免疫性疾病的优化治疗方法，将CXCR5基因修饰MSC治疗疾病将更有靶向性和有效性，显著提高MSC的治疗效果。
附图说明
图1：MSCCXCR5和MSCEGFP表达CXCR5图
图2：致敏后右侧耳朵(致敏)CXCL13的mRNA随时间变化图
图3：致敏后右侧耳朵(致敏)水肿程度随时间变化图
图4：CHS小鼠造模与治疗模式图
图5：治疗后小鼠耳朵水肿程度折线图
图6：切片染色显示结果
图7：MPO活性柱图
图8：ELISA结果
具体实施方式
为了使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
1、MSC培养与表型鉴定：
取健康志愿者骨髓20ml，与1×PBS按1:1稀释，采用Ficoll-Paque淋巴分离液用密度梯度离心法从骨髓中分离出单个核细胞(2000rpm，30min)，收集到的单个核细胞按1×105/cm2密度接种到75cm2培养瓶进行培养。用L-DMEM培养基在37℃、5％CO2条件下培养3天后，去除悬浮细胞，换液继续培养。待细胞长至80％密度后，吸去培养基，用PBS洗涤2次，用0.125％胰酶消化1-2min，传代比例为1:3。MSC由健康供者捐献的骨髓分离得到，临床用MSC的分离、扩增、冻存、复苏等均在符合GMP(good manufacturing practice)标准的条件下进行。在倒置显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，拍片记录。取体外培养的MSCs消化成单细胞悬液，用含0.1％BSA+0.05％NaN3的PBS(pH 7.4)洗涤一遍，弃去上清，调整细胞密度为106/ml于流式管，采用流式抗体CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD166标记MSCs，充分震荡混匀，4℃，避光孵育30min，然后用含0.1％BSA+0.05％NaN3的PBS(pH 7.4)洗涤两遍，以去除多余抗体；弃上清，用200ul 1％PFA重悬细胞，流式检测MSCs细胞表型(CD29+,CD34-,CD44+,CD45-,CD73+,CD90+,CD105+,CD166+)，证明体外培养对MSCs细胞表型无影响。
将P2代细胞传至六孔板，长至60％左右待用。
2、外周血单个核细胞的获取：
取健康志愿者新鲜外周血20ml，用1×PBS按1:1稀释，采用Ficoll-Paque淋巴分离液通过密度梯度离心法分离，收集全部白膜层单个核细胞，用无菌PBS按1:4稀释。2000rpm，离心10min，弃上清。再加足量PBS洗涤两次。用RPMI-1640完全培养基悬浮细胞，即获得人外周血单个核细胞(PBMC)。
3、Trizol法提取外周血单个核细胞RNA：
将获得的人外周血单个核细胞(PBMC)加入1ml Trizol溶液，吹打混匀，使细胞充分裂解，静置5min；加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀20s，使水相和有机相充分接触，室温静置15min；4℃下，12000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，小心移至另一个新的RNase free EP管；加入0.5ml异丙醇，轻柔地充分混匀，于室温静置10min，沉淀RNA；4℃下，12000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；用75％乙醇洗管壁两次，超净台风干；加入50μlDEPC水溶解沉淀，NanoDrop超微量分光光度计测量浓度。
4、逆转录：
去除基因组DNA：RNA(1μg)+DNase I(1μl)+Buffer DNase I with MgCl2(1μl)+DEPC水，10μl体系，37℃孵育30min；加入EDTA(1μl)，65℃孵育10min；加入Oligo(dT)(1μl)，65℃孵育10min；最终，加入5×Reaction Buffer(5μl)，RNase-Ribonuclease Inhibitor(1μl)，10mM dNTP Mix(2μl)，M-MLV RT(1μl)，RNase Free Water共25μl体系，42℃孵育60min，收取cDNA产物。
5、PCR反应和回收CXCR5cDNA片段：
PCR反应：2×Star mix(含Taq DNA Polymerase、dNTPs、Mg2+、反应缓冲液和稳定剂等)10μl，DEPC水7μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA1μl，总体系20ul；CXCR5片段大小1119bp。胶回收：锋利手术刀切割目的片段条带，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收PCR目的产物CXCR5片段。
CXCR5引物序列：
F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA；
6、TA克隆与转化：
TA克隆：体系：pMD19-T Vector*1(1μl)，CXCR5cDNA(4μl)，Solution I(5μl)，16℃，2h，获得TA克隆产物。
转化：-80℃取出感受态细胞DH5α，冰上溶解5min；30μl感受态+5μlTA克隆产物，轻弹，置于冰上30min；42℃热击45s～1min，立即置于冰上2min；加37℃孵育的LB600μl，在37℃，1500rpm的摇床上孵育1h；离心3500rpm，4～5min，倒上清，重悬，将100μl转化物涂在预热的含有50μg/ml Amp的LB平板上，37℃孵育过夜；挑出3～5个菌落进行PCR检测和测序。
7、Gateway法构建CXCR5-IRES-EGFP基因的质粒
①PCR扩增attB-PCR产物
10×LA PCR Buffer(Mg2+plus)3μl；
所用引物序列：
F-attB1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAA CGCTGG
R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAG AGAGGTGGCA
②PCR产物回收
使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒切胶回收PCR产物
③BP重组反应
室温混合以下成分：
CXCR5的attB-PCR产物 7.5-75ng；
pDONR221 质粒 75ng；
补加洗脱缓冲液EB至总体积4.5μl；
冰上溶解BP Clonase II enzyme mix 2分钟，短暂漩涡2次；
加入以上反应样品中加入1μL BP Clonase II enzyme mix，短暂漩涡混匀2次，短暂离心；
25℃孵育1小时；
加入0.5μL蛋白酶K中止反应，37℃孵育10分钟；
-20℃保存或取2μL进行转化。
④BP反应产物的转化
过程同上。
筛选出重组子进行PCR检测和测序。
⑤LR重组反应
小提质粒
测质粒浓度
室温混合以下质粒：
补加1╳TE buffer(pH 8.0)至4.5μL，混匀。
冰上溶解LR ClonaseTM II Plus Enzyme Mix 2分钟，短暂漩涡2次；
加入以上反应样品中加入2μL LR ClonaseTM II Plus Enzyme Mix，短暂漩涡混匀2次，短暂离心；
室温孵育16小时；
加入1μL蛋白酶K中止反应，37℃孵育10分钟；
⑥LR反应产物的转化
转化步骤同上；
构建成功的慢病毒过表达质粒结构如下：
pFinal/PGK-puro-EF1α-CXCR5-IRES-EGFP
对照组质粒：
pFinal/PGK-puro-EF1α-EGFP
8、慢病毒包装
将293T细胞接种在10cm皿中，待其90％满的时候换新鲜不含双抗的293新鲜培养液，放入培养箱中；
2小时后将构建成功的过表达CXCR5基因的载体质粒与慢病毒载体质粒混合加入无血清的OPTI-MEM培养基中，静置5分钟后加入X-treme HP，颠倒混匀后静置15分钟，加入293T细胞；
12-16小时左右换液，继续培养24小时-48小时左右，收集含有病毒的上清培养液；
慢病毒超速离心浓缩，弃上清，溶于1×PBS后，分装保存于-80℃。
9、慢病毒转染MSC
将P2代的MSC传至六孔板，长至60％左右待用；
感染前换新鲜培养液L-DMEM培养基，取出浓缩病毒加入上清并加基因转染增强剂polybrene(聚凝胺)，12-16小时后更换新鲜培养基。
10、检测CXCR5mRNA和蛋白的表达情况：
72小时后收集细胞，通过流式细胞仪分选纯化得到转基因细胞系并扩增；
实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，RT-PCR)检测感染后的MSC表达CXCR5mRNA的含量：
①提取RNA并逆转录：步骤参考本部分3、4；
总体系20μl；
反应条件：95℃10min；3步法，40个循环：95℃15s，60℃30s，72℃15s；融解曲线：55℃-95℃，每分钟读1次。
使用引物
GAPDH：
F:GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
R:GAAGATGGTGATGGGATTTC
CXCR5：
F:CCTTGAAGGAGGCCATGAG
R:TAACGCTGGAAATGGACCTC
Western Blot检测感染后的MSC表达CXCR5的蛋白水平:
①提取蛋白：取培养中的过表达CXCR5的MSC(MSCCXCR5)和对照组MSC(MSCEGFP)，置于冰上，去除培养液，用预冷的PBS洗两遍后，加入含5％DTT的1×SDS上样缓冲液(62.5mMTris-HCl(pH6.8)，2％(w/v)SDS，10％glycerol，50mM DTT，0.1％(w/v)溴酚兰)，迅速用1ml的移液枪来回吹打(约10次)，充分裂解细胞。吹打后吸取液体放入1.5mL的Eppendorf离心管内，4℃超声破碎3次，每次1秒；100℃煮沸5分钟，置4℃冷却并于4℃以15000g离心5分钟，准备电泳或-80℃保存备用。
②凝胶电泳分离样品：变性聚丙烯酰胺凝胶(denatured polyacrylamide gel，SDS-PAGE)：加分离胶4.1mL，用去离子水封层，待出现明显界面后，倾掉水封层，加入已经配制好的浓缩胶至短玻璃块的顶端。插梳，当胶面出现不规则形状时，表明胶已经聚合好，可以拔梳、上样。
按顺序，每泳道加入100℃煮沸5分钟的样本15μL，于SDS电泳缓冲液中以恒压120V电泳约45分钟。
③转膜：在电泳的同时，把转膜所需要的材料，如海绵、滤纸、PVDF膜等浸泡在转膜缓冲液(25mM Tris base，0.2M glycine，20％methanol pH8.5)中。电泳结束后，取下凝胶，去掉上面的浓缩胶部分。把胶放在转膜液中平衡15～30分钟，以去除胶表面附着的SDS。然后开始装转膜夹层盒，从负极到正极按照海绵、一层滤纸、凝胶、PVDF膜、一层滤纸和海绵的顺序装置夹层盒，固定之后放于转移槽内，PVDF膜面朝着正极方向。将夹层盒和冰盒放置于转移槽内，注入600mL转移缓冲液，恒流200mA2小时。
④抗原抗体反应：
转膜结束后，取下PVDF膜，在25mL的TBS(50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl)中洗10分钟，然后转至20mL封闭液[含5％脱脂奶的1×TBST(0.05％Tween-20in TBS)]中，室温下振荡封闭1小时，加入相应的用含5％(w/v)脱脂奶稀释的一抗稀释液。4℃温和振荡过夜。次日用1×TBST洗膜3次，每次5分钟，然后加入用封闭液稀释的由辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗(1:2000)15mL，室温振荡1小时。之后用1×TBST洗膜3次，每次10分钟，于暗房内显影、定影：取ECL试剂盒A、B液配成工作液均匀涂于PVDF膜表面，孵育1分钟后，尽量去除膜表面的反应残液，在X-光感光盒内用塑料保鲜膜固定膜，放入X-光胶片进行适度曝光，取出X-光胶片于显影液中反应1分钟，把显影好的胶片在清水中漂洗几次，再于定影液中反应1分钟，然后清水冲洗，晾片。
结果可见附图1，MSCCXCR5表达蛋白CXCR5，MSCEGFP不表达CXCR5，二者都表达绿色荧光蛋白EGFP。
实施例2
DNFB诱导的小鼠接触性超敏反应
DNFB(2，4-dinitro-1-fluorobenzene，2，4-二硝基-1-氟苯)诱导的小鼠接触性超敏反应模型造模，具体如下：
1.6-8周雄性BALB/c小鼠，16-18g，SPF环境饲养；
2.试剂配制：
①DNFB预致敏溶液：
配制混合液(丙酮：橄榄油4：1)，剧烈震荡混匀；
配制预致敏混合液：用混合液配制0.5％的DNFB混合液，即预致敏混合液。②DNFB致敏溶液：用混合液配制0.2％的DNFB混合液，即致敏混合液。
3.预致敏：第1天，用电动剃刀在小鼠背部近头部皮肤处刮出1.5×1.5cm区域，将20μl0.5％的DNFB预致敏混合液涂抹在被刮皮肤处，处理后常规饲养。
4.致敏：第5天，用0.2％的DNFB混合液涂抹小鼠耳朵，耳朵两面各10μl。
5.将动物分为4组，每组8只：
①空白对照(Control)组；
②模型(CHS)组；
③MSCEGFP治疗(CHS+MSCEGFP)组；
④MSCCXCR5治疗(CHS+MSCCXCR5)组。
造模后第2天，CHS+MSCEGFP组静脉注射MSCEGFP，1×106个cells/只；
CHS+MSCCXCR5组静脉注射MSCCXCR5，1×106个cells/只。
6.记录治疗后第1，2，3，4，5天小鼠耳朵厚度，用千分尺测量。
结果显示：
1、致敏后，小鼠右耳(致敏)在发生炎症后趋化因子CXCL13的mRNA不断升高(附图2)，厚度逐渐增厚，水肿程度加深(附图3)
2、见附图4，Day-4天，用20μl0.5％的DNFB预致敏混合液涂抹在背部，Day 0天，小鼠右侧耳朵致敏，致敏后第2天，即Day 2天，当CXCL13分泌增多，小鼠尾静脉注射MSC进行治疗：
CHS+MSCEGFP组静脉注射MSCEGFP，1×106个cells/只；
CHS+MSCCXCR5组静脉注射MSCCXCR5，1×106个cells/只；
Control组注射PBS。
3、记录治疗后第1，2，3，4，5天小鼠耳朵厚度，用千分尺测量耳朵外缘厚度，每天由同一操作者同一时间测量三次取均值，结果显示在附图5中，CHS+MSCCXCR5组小鼠耳朵厚度下降最快，治疗效果最好，CHS+MSCEGFP组治疗效果在CHS组和CHS+MSCCXCR5组之间。
4、切片染色观察小鼠耳朵MSC的数量：
冰冻切片：将小鼠断颈处死，取各实验组小鼠耳朵，取10倍耳朵体积的多聚甲醛固定6h，转移至30％蔗糖脱水，4℃过夜，OCT固定，冰冻切片机-20℃切片，7μm；免疫荧光染色：烘片，60℃，30分钟，撕去OCT，0.01M的PBS洗脱5分钟×3次，用免疫组化笔划线圈起有组织部分，滴加山羊血清，封闭30分钟，加一抗，4℃孵育过夜，室温放置30分钟，0.01M的PBS洗脱5分钟×3次，加二抗，30分钟，0.01M的PBS洗脱5分钟×3次，加DAPI，10分钟，0.01M的PBS洗脱5分钟×3次，封片。
从附图6可见治疗后MSCCXCR5组耳朵厚度明显低于MSCEGFP组耳朵厚度，更重要的是MSCCXCR5组耳朵中MSC的数量明显多于MSCEGFP组，证明MSCCXCR5能够靶向地迁移至炎症部位。
5、局部炎症细胞的浸润-髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)检测，髓过氧化物酶又称过氧化物酶，是血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。髓过氧化物酶是中性粒细胞所特有，即使在有强吞噬作用的巨噬细胞中也极少或完全没有这种酶。在细胞化学上，一般将这种髓过氧化物酶作为中性粒细胞得到的标志，每个细胞所含的酶的量是一定的，约占细胞干重的5％，该酶具有使过氧化氢还原的能力，利用这一特点可以分析酶的活力，并定量测定中性粒细胞的数目。
MPO检测：准备待测样品-各组小鼠耳朵，称重，以试剂盒中相应试剂为匀浆介质，按重量体积比为1:19加匀浆介质制备成5％的组织匀浆，然后按照试剂盒步骤检测MPO活性，结果如附图7，CHS+MSCCXCR5组MPO活性明显低于CHS+MSCEGFP组和CHS组。
结果显示MSCCXCR5组中性粒细胞的浸润明显低于MSCEGFP组，证明MSCCXCR5能够靶向地迁移至炎症部位，发挥免疫功能，减轻炎性浸润。
6、局部炎症因子的分泌
ELISA检测：96孔ELISA板，用1×washing buffer洗涤2次，加标准品、待测样品，100ul/孔，室温避光孵育2h，弃液体，用1×washing buffer洗涤5次，加检测抗体100ul/孔，室温避光孵育1h，弃液体，用1×washing buffer洗涤5次，去除多余抗体，加酶结合物工作液100ul/孔，室温避光孵育30min，弃液体，用1×washing buffer洗涤5次，加显示底物50ul/孔，避光孵育20min，加终止液50ul/孔，混匀后酶标仪检测450nm OD值。
见附图8，结果显示，显示CHS+MSCCXCR5组局部的炎性因子TNFα和IFNγ的浸润明显低于CHS+MSCEGFP组和CHS组，证明MSCCXCR5能够靶向地迁移至炎症部位，发挥免疫功能，减轻炎性反应。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高表达CXCR5的间充质干细胞。
2.如权利要求1所述间充质干细胞在制备治疗下列疾病之一的药物中的用途：自身免疫病、移植排斥、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、糖尿病。
3.一种包含如权利要求1所述间充质干细胞的药物。
4.一种制备如权利要求1所述间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
1)收集健康个体外周血中单个核细胞并培养以获得外周血单个核细胞；
2)提取外周血单个核细胞RNA；
3)逆转录；
4)PCR反应和回收CXCR5cDNA片段；
5)克隆与转化；
6)构建质粒；
7)病毒包装；
8)病毒转染间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中引物为：
F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中引物为：
F-attB1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAACGCTGG
R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中质粒结构为：
pFinal/PGK-puro-EF1α-CXCR5-IRES-EGFP。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤7)中病毒为慢病毒。
9.一种用于制备如权利要求1所述的间充质干细胞的CXCR5引物序列：
F:ATGAACTACCCGCTAACGCTGG，
R:CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA。
10.一种用于制备如权利要求1所述的间充质干细胞的PCR引物序列：
F-attB1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-ATGAACTACCCGCTAACGCTGG；
R-attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-CTAGAACGTGGTGAGAGAGGTGGCA。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439631A (zh) * 2018-11-09 2019-03-08 中山大学 一种过表达ccr2的间质干细胞用于治疗急性缺血性脑卒中及其制备方法
WO2019056174A1 (zh) * 2017-09-19 2019-03-28 中山大学 一种过表达cxcr5的间质干细胞及其制备方法和用途
CN113502271A (zh) * 2021-07-20 2021-10-15 广州赛隽生物科技有限公司 一种用于治疗炎症性肠病的间充质干细胞及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382801A (zh) * 2011-10-26 2012-03-21 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 蛋白去乙酰化酶sirt1在促进间充质干细胞增殖与延缓衰老中的应用
CN104593421A (zh) * 2015-03-02 2015-05-06 刘爽 一种抑制胶质瘤生长的过表达bdnf的间充质干细胞的制备方法及其临床应用
CN104922153A (zh) * 2015-04-02 2015-09-23 连祺周 Nrg1-erbb4复合体在制备治疗心肌缺血的药物中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102382801A (zh) * 2011-10-26 2012-03-21 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 蛋白去乙酰化酶sirt1在促进间充质干细胞增殖与延缓衰老中的应用
CN104593421A (zh) * 2015-03-02 2015-05-06 刘爽 一种抑制胶质瘤生长的过表达bdnf的间充质干细胞的制备方法及其临床应用
CN104922153A (zh) * 2015-04-02 2015-09-23 连祺周 Nrg1-erbb4复合体在制备治疗心肌缺血的药物中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李莹等: "趋化因子及其受体CXCR5在肿瘤中的研究进展", 《国际耳鼻喉头颈外科杂志》 *
沙明磊等: "CXCR4 慢病毒载体的构建及其在人脐带血间充质干细胞的表达", 《现代生物医学进展》 *
道书艳等: "趋化因子CXCL13及其受体CXCR5研究进展", 《国外医学分子生物学分册》 *
陈伟等: "慢病毒载体介导CXCR4基因过表达对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响", 《中华血液学杂志》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019056174A1 (zh) * 2017-09-19 2019-03-28 中山大学 一种过表达cxcr5的间质干细胞及其制备方法和用途
JP2020533981A (ja) * 2017-09-19 2020-11-26 中山大学 Ｃｘｃｒ５を過剰発現する間葉系幹細胞、その製造方法及び使用
CN109439631A (zh) * 2018-11-09 2019-03-08 中山大学 一种过表达ccr2的间质干细胞用于治疗急性缺血性脑卒中及其制备方法
CN113502271A (zh) * 2021-07-20 2021-10-15 广州赛隽生物科技有限公司 一种用于治疗炎症性肠病的间充质干细胞及其应用
CN113502271B (zh) * 2021-07-20 2023-08-11 广州赛隽生物科技有限公司 一种用于治疗炎症性肠病的间充质干细胞及其应用

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