CN106591306A

CN106591306A - 靶向干扰肿瘤ptn‑ptprz1通路的小干扰rna在肿瘤免疫治疗中的应用

Info

Publication number: CN106591306A
Application number: CN201610980647.4A
Authority: CN
Inventors: 时雨; 平轶芳; 卞修武; 何志承; 陈聪; 廖嘉明
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-11-08
Also published as: CN106591306B

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及一种靶向干扰肿瘤PTN‑PTPRZ1通路的小干扰RNA在肿瘤免疫治疗中的应用。所述小干扰RNA的靶基因为PTN和/或PTPRZ1；所述PTN的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述PTPRZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过将所述小干扰RNA慢病毒载体感染胶质瘤细胞，抑制胶质瘤细胞增殖和胶质瘤生长，效果显著；采用特异性小干扰RNA干扰肿瘤相关巨噬细胞中PTN表达或干扰胶质瘤细胞中PTPRZ1表达，能够显著抑制胶质瘤生长并延长荷瘤鼠生存时间。本发明基于RNAi技术靶向干扰胶质瘤微环境中PTN‑PTPRZ1通路，为研发靶向胶质瘤的免疫治疗新策略提供依据。

Description

靶向干扰肿瘤PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA在肿瘤免疫治疗中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种靶向干扰肿瘤PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA在肿瘤免疫治疗中的应用，具体为靶向干扰肿瘤中PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA及其在肿瘤免疫治疗中的应用。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)对胶质瘤的分类标准，按照其恶性程度可分为I-IV级，其中恶性胶质瘤(WHO IV级)恶性程度极高，患者生存期短、复发率高、治疗困难。研究表明，肿瘤微环境是胶质瘤肿瘤细胞生存的基础，也是促进胶质瘤演进的重要因素。胶质瘤微环境主要由间质细胞、各类细胞因子、肿瘤血管、细胞外基质和浸润的免疫细胞组成。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是胶质瘤微环境的重要成分，也是介导胶质瘤恶性生物学行为的重要原因。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞的浸润程度与胶质瘤肿瘤级别、复发和患者预后具有明显相关性。新近研究提示，肿瘤相关巨噬细胞主要发挥免疫抑制作用，促进肿瘤细胞增殖、侵袭等恶性行为。因此，以肿瘤相关巨噬细胞作为免疫治疗靶点，或能够有效抑制胶质瘤的肿瘤演进。尽管肿瘤相关巨噬细胞在胶质瘤中的促瘤效应已比较明确，但介导其功能的分子机制尚有待研究。

PTN(Pleiotrophin)是分泌性肝素结合细胞因子，可旁分泌到细胞外，通过与其受体PTPRZ1(The Protein Tyrosine Phosphatase,Receptor-type,Z polypeptide1)结合，调控细胞增殖、迁移运动、血管生成等多种生物学功能和组织损伤修复、胚胎发育、神经发育、肿瘤演进等生物学行为。研究发现，PTN和(或)PTPRZ1在多种实体肿瘤(如乳腺癌、肺癌)中常存在异常表达，PTN-PTPRZ1通路的过度激活能够促进肿瘤的发生和发展。然而，PTN-PTPRZ1作为分子靶点在胶质瘤肿瘤免疫治疗中的价值尚有待研究。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由小干扰RNA(short interfering RNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。利用病毒载体将小干扰RNA导入细胞，经细胞内加工处理后可形成与靶基因mRNA互补结合的短序列RNA分子，进而抑制靶基因蛋白翻译，特异性干扰靶基因的表达。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于恶性肿瘤的治疗。

目前，尚未见针对PTN-PTPRZ1作为分子靶点在胶质瘤肿瘤免疫治疗中的报道，因此，基于RNAi技术靶向干扰胶质瘤中PTN-PTPRZ1通路，将为研发靶向胶质瘤的免疫治疗新策略提供依据，具有重要的临床应用价值和商业价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种靶向干扰肿瘤PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA在肿瘤免疫治疗中的应用，所述小干扰RNA的靶基因为PTN和/或PTPRZ1，基于RNAi技术靶向干扰胶质瘤中PTN-PTPRZ1通路，为研发靶向胶质瘤的免疫治疗新策略提供依据。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

靶向干扰肿瘤中PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA，其特征在于，所述小干扰RNA的靶基因为PTN和/或PTPRZ1；所述PTN的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述PTPRZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

PTN(Pleiotrophin)是分泌性肝素结合细胞因子，可旁分泌到细胞外，通过与其受体PTPRZ1(The Protein Tyrosine Phosphatase,Receptor-type,Z polypeptide1)结合，调控细胞增殖、迁移运动、血管生成等多种生物学功能和组织损伤修复、胚胎发育、神经发育、肿瘤演进等生物学行为。PTN和(或)PTPRZ1在多种实体肿瘤(如乳腺癌、肺癌)中常存在异常表达，PTN-PTPRZ1通路的过度激活能够促进肿瘤的发生和发展，通过干扰PTN-PTPRZ1通路可以抑制肿瘤细胞增殖和细胞自我更新能力。

胶质瘤组织中PTN主要表达于肿瘤相关巨噬细胞，PTN受体PTPRZ1主要表达于胶质瘤干细胞；胶质瘤组织中PTN与PTPRZ1表达量呈正相关关系。Recombinant human PTN(rhPTN)刺激显著促进胶质瘤细胞增殖和自我更新能力；采用特异性小干扰RNA干扰PTPRZ1表达显著抑制rhPTN促胶质瘤细胞增殖、自我更新能力，干扰PTN-PTPRZ1通路对抑制胶质瘤细胞增殖和细胞自我更新能力十分关键。

所述PTN基因序列的NCBI Reference Sequence:NM_002825.5，所述PTPRZ1基因序列的NCBI Reference Sequence:NM_002851.2。

进一步，所述肿瘤包括但不仅限于胶质瘤。

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)对胶质瘤的分类标准，按照其恶性程度可分为I-IV级，其中恶性胶质瘤(WHO IV级)恶性程度极高，患者生存期短、复发率高、治疗困难。研究表明，肿瘤微环境是胶质瘤肿瘤细胞生存的基础，也是促进胶质瘤演进的重要因素。胶质瘤微环境主要由间质细胞、各类细胞因子、肿瘤血管、细胞外基质和浸润的免疫细胞组成。肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是胶质瘤微环境的重要成分，也是介导胶质瘤恶性生物学行为的重要原因。研究表明，肿瘤相关巨噬细胞的浸润程度与胶质瘤肿瘤级别、复发和患者预后具有明显相关性。新近研究提示，肿瘤相关巨噬细胞主要发挥免疫抑制作用，促进肿瘤细胞增殖、侵袭等恶性行为。肿瘤相关巨噬细胞和胶质瘤细胞的存活依赖于关键促癌基因，如PTN、PTPRZ1的表达。因此，以肿瘤相关巨噬细胞和胶质瘤细胞的相关促癌基因作为治疗靶点，或能够有效抑制胶质瘤的肿瘤演进。

进一步，所述小干扰RNA包括如SEQ ID NO:3-6中的一条或多条序列。

小干扰RNA是一个长20-25个核苷酸的RNA序列。通过体外合成针对PTN、PTPRZ1基因序列的小干扰RNA，利用载体将其转入细胞中，可以特异性的封闭目的基因的转录而不影响其他基因的表达。输送小干扰RNA的一种办法是，将小干扰RNA序列作为“短发夹”导入质粒或病毒载体中，当送入肿瘤细胞时，该发夹序列被表达出来，形成双链小发夹RNA(smallhairpin RNA)，在宿主细胞内Dicer酶的作用下进一步被切割为单链小干扰RNA(Shortinterfering RNA,siRNA)，进而抑制癌基因的表达。

进一步，SEQ ID NO:3-4为PTN基因的小干扰RNA序列；SEQ ID NO:5-6所示为PTPRZ1基因的小干扰RNA序列。

本发明的目的之二在于提供一种所述的小干扰RNA在制备用于治疗胶质瘤肿瘤药物中的应用。

借助表达质粒或病毒载体在细胞内导入小干扰RNA表达载体，可达到长期抑制靶基因表达的目的。与临床治疗中常规采用的放疗、化疗方案相比，采用小干扰RNA作为治疗药物，特异性抑制肿瘤相关巨噬细胞和胶质瘤细胞中PTN和PTPRZ1的表达，能够减少临床治疗的副作用并提高肿瘤治疗的靶向性。小干扰RNA与常规放化疗及手术切除治疗方案联合，或能有效提高胶质瘤患者的预后水平，具有更为广阔的应用前景。

进一步，所述应用包括小干扰RNA及其编码基因、用于表达小干扰RNA的重组载体在制备用于治疗胶质瘤肿瘤药物中的应用。

用病毒载体介导RNAi近年来受到人们重点关注，利用病毒载体可以解决质粒转染效率低、效果不稳定且某些类型细胞不能转染等问题，从而扩大RNAi应用范围，常见病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒，可以高效地转导不同类型的哺乳动物组织细胞，但不整合到宿主细胞基因组中。逆转录病毒属于正链RNA病毒，宿主范围广，感染效率高，并能稳定整合到宿主细胞基因组中，但其只能感染分裂细胞。慢病毒是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，与腺病毒和逆转录病毒相比，它有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，且不产生任何有效的细胞免疫应答。因此，慢病毒是一种理想的小干扰RNA运输载体。利用慢病毒载体将针对PTN和PTPRZ1的小干扰RNA导入肿瘤相关巨噬细胞和胶质瘤细胞中，具有良好的生物学反应性和抗肿瘤药物应用价值。

本发明的目的之三在于提供一种抑制胶质瘤细胞增殖和胶质瘤生长的方法，通过将PTN和/或PTPRZ1基因的小干扰RNA慢病毒载体体外感染胶质瘤细胞来抑制胶质瘤细胞增殖和胶质瘤生长。

本发明的目的还在于提供一种治疗胶质瘤肿瘤的药物，所述药物包括上述提到的小干扰RNA和药学上可接受的载体或助剂。

进一步，所述药物通过所述小干扰RNA靶向干扰PTN-PTPRZ1通路来抑制胶质瘤细胞的增殖、自我更新和抑制肿瘤相关巨噬细胞促胶质瘤体内生长。

所述治疗胶质瘤肿瘤的药物可以被配制成合适的药物制剂，以便用于给药，给药途径包括：口服给药、注射给药、直肠给药、吸入给药等。

所述药物施用剂量可以根据具体使用的给药方案、给药途径、被治疗的病症的严重程度和受治疗者个体的差异而改变，可由本领域已知的方法常规决定。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供一种靶向干扰肿瘤中PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA，还公布了所述小干扰RNA的靶基因为PTN和/或PTPRZ1，基于RNAi技术靶向干扰胶质瘤中PTN-PTPRZ1通路，为研发靶向胶质瘤的免疫治疗新策略提供依据。

2)本发明通过将PTN和/或PTPRZ1基因的小干扰RNA慢病毒载体感染胶质瘤细胞，抑制胶质瘤细胞增殖和胶质瘤生长，效果显著。

3)本发明还提供了所述的小干扰RNA以小干扰RNA本身、其编码基因、表达小干扰RNA的重组载体的形式在制备用于治疗胶质瘤肿瘤药物中的应用。

4)本发明还提供的治疗胶质瘤肿瘤的药物，所述药物通过所述小干扰RNA靶向干扰PTN-PTPRZ1通路来抑制胶质瘤细胞的增殖、自我更新和抑制肿瘤相关巨噬细胞促胶质瘤在体内的生长。

附图说明

图1为PTN表达与肿瘤相关巨噬细胞Iba1、CD163的共定位情况；(A-B)图为免疫荧光检测人胶质瘤组织样本中PTN表达与肿瘤相关巨噬细胞标记物Iba1的共定位情况，(C-D)图为免疫荧光检测人胶质瘤组织样本中PTN表达与肿瘤相关巨噬细胞标记物CD163的共定位情况；标尺＝25μm，**,P<0.01。

图2为基于RNAi技术靶向PTN-PTPRZ1在抑制胶质瘤细胞增殖和自我更新中的作用；其中细胞增殖实验(A)和极限稀释实验(B)分析PTN重组蛋白活化对胶质瘤细胞增殖能力(A)和自我更新能力(B)的影响；(C-D)细胞增殖实验(C)和极限稀释实验(D)分析干扰PTPRZ1表达(PTPRZ1-RNAi-1,-2)对拮抗PTN促胶质瘤细胞增殖能力(C)和自我更新能力(D)的影响；*,P<0.05；**,P<0.01。

图3为干扰巨噬细胞分泌的PTN或干扰胶质瘤细胞PTPRZ1表达对胶质瘤体内生长的影响；其中(A)图为活体动物成像检测小干扰RNA干扰PTN表达的巨噬细胞(PTN-RNAi-1，-2)或对照组巨噬细胞(Scramble)对胶质瘤细胞成瘤的影响；(B)图为活体动物成像检测小干扰RNA干扰PTPRZ1表达对胶质瘤成瘤大小的影响。

图4为干扰巨噬细胞分泌的PTN或干扰胶质瘤细胞PTPRZ1表达的效果验证及对对荷瘤鼠生存期的影响。其中(A)图为免疫组化检测移植瘤中PTN的表达，标尺＝25μm；结果表明PTN特异性小干扰RNA能够显著抑制移植瘤中巨噬细胞来源PTN的表达；(B)图为免疫组化检测移植瘤中PTPRZ1的表达，标尺＝25μm；结果表明PTPRZ1特异性小干扰RNA能够抑制肿瘤细胞PTPRZ1的表达；(C)图为Kaplan-Meier生存曲线分析干扰巨噬细胞中PTN表达(PTN-RNAi-1，-2)对荷瘤鼠生存期的影响；(D)图为Kaplan-Meier生存曲线分析干扰胶质瘤细胞PTPRZ1表达对荷瘤鼠生存期的影响。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

在以下具体实施方式中输送小干扰RNA的一种办法是，将小干扰RNA序列作为“短发夹”克隆进质粒或病毒载体中，当送入肿瘤细胞时，该发夹序列被表达出来，形成双链小发夹RNA(Small hairpin RNA)，并被RNAi通道处理。

1.细胞培养

人胶质母细胞瘤及U937单核细胞从美国菌种保藏中心(ATCC)购买。胶质瘤肿瘤干细胞用含B-27(Life technology公司)和EGF、bFGF生长因子(PeproTech公司)的Neurobasal medium培养(Life technology公司)。U937用RPMI-1640培养基(Gibco公司)加10％胎牛血清(Gibco公司)培养，用PMA(5nM，Sigma公司)和IL-4、IL-10和TGF-β(20ng/ml)活化处理。所有细胞均置37℃、5％CO₂孵箱(相对湿度为95％)中，细胞传代时间为2-5天，传代前用胰酶消化液消化1-3分钟。

2.PTN小干扰RNA与PTPRZ1小干扰RNA病毒载体、细胞感染及阳性克隆筛选

2.1PTN小干扰RNA慢病毒载体购买于美国Sigma公司，小干扰RNA序列见表1。

表1 PTN小干扰RNA序列

2.2 PTPRZ1小干扰RNA慢病毒载体购买于上海和元生物公司。PTPRZ1小干扰RNA序列见表2。

表2 PTPRZ1小干扰RNA序列

2.3病毒感染及阳性克隆筛选：将PTN小干扰RNA或PTPRZ1小干扰RNA慢病毒载体分别感染U937单核巨噬细胞或胶质瘤细胞，感染滴度为1MOI，病毒感染24小时后，细胞换液为新鲜培养基，用浓度为1μg/ml的嘌呤霉素(上海生工)筛选阳性细胞克隆，筛选时间为48小时。筛选后的阳性克隆用于细胞功能实验及移植瘤体内实验。

3.免疫荧光检测PTN与肿瘤相关巨噬细胞标记物Iba1、CD163在胶质瘤组织样本中的表达情况

(1)将人胶质瘤组织切片(厚度为6-8μm)浸于4％多聚甲醛溶液，室温固定20分钟；

(2)用PBS水化切片，5分钟×3次；

(3)用10％山羊血清封闭切片，室温孵育30分钟；

(4)一抗孵育：加入稀释后的PTN(Proteintechs,10821-1-AP，1:100)、CD163(Santa Cruz,sc-33715，1:200)、Iba1(Abcam,ab5076，1:200)一抗，4℃孵育过夜。

(5)次日，用PBS漂洗切片，5分钟×3次；

(6)二抗孵育：加入稀释后的Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 568(Lifetechnology公司)荧光二抗，室温孵育2h；

(7)用PBS漂洗切片，5分钟×3次；

(8)DAPI染液室(碧云天公司)温孵育10分钟；

(9)用PBS漂洗切片，5分钟×5次；

(10)用抗荧光淬灭剂封片(碧云天公司)，置于湿盒内4℃避光保存；

(11)Leica SP5激光共聚焦显微镜观察、采集图像(每例样本随机选取5个视野)。

(12)采用Image J软件分析各指标的阳性细胞比例。实验结果见图1。

免疫荧光检测结果表明，胶质瘤组织中PTN表达与肿瘤相关巨噬细胞标记物Iba1、CD163存在共定位，表明PTN主要表达于肿瘤相关巨噬细胞，见图1，(A-B)图为免疫荧光检测人胶质瘤组织样本中PTN表达与肿瘤相关巨噬细胞标记物Iba1的共定位情况：Iba1阳性细胞多的区域，PTN呈高表达，Iba1阳性细胞少的区域，PTN呈低表达(图1，A-B)；(C-D)图为免疫荧光检测人胶质瘤组织样本中PTN表达与肿瘤相关巨噬细胞标记物CD163的共定位情况，CD163阳性细胞多的区域，PTN呈高表达；CD163阳性细胞少的区域，PTN呈低表达(图1，C-D)。

4.细胞增殖实验

(1)收集转染PTPRZ1小干扰RNA(PTPRZ1-RNAi)或对照无义RNA序列(Scramble)慢病毒载体的胶质瘤细胞，细胞计数并调整细胞浓度至1×10⁴个/ml，按实验分组在96孔板每孔加入细胞悬液100μl。重组人源性PTN蛋白(Recombinant human PTN，rhPTN，R&D System公司)处理组中rhPTN浓度为100nM，对照组为PBS溶液。共接种5个96孔板，每种细胞每个孔板设置6个复孔，37℃培养。

(2)自细胞接种的0天、2天、4天、6天，各取一个96孔板，向每孔中加入Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay检测液50μl(Promega公司)，避光静置15分钟，用酶标仪测定450nm吸光度值。实验结果见图2。

5.极限稀释实验

(1)收集转染小干扰RNA(PTPRZ1-RNAi)或对照无义RNA序列(Scramble)慢病毒载体的胶质瘤细胞，细胞计数并梯度稀释细胞，96孔板每孔分别接种1个、5个、10个、20个、40个细胞，细胞悬液量为100μl，每种细胞每个梯度设置10个复孔。

(2)Recombinant human PTN(rhPTN)处理组中rhPTN浓度为100nM(R&D Systems)，对照组为不含rhPTN的PBS溶液。37℃培养6天。

(3)每隔2天，每孔加入新鲜培养基50μl。

(4)自细胞接种的第7天，计数镜下每孔的成球细胞数，并用高倍显微镜在明场条件下采图。

(5)采用极限稀释分析网站(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)对各组胶质瘤细胞的自我更新进行分析。实验结果见图2。

细胞增殖实验和极限稀释实验结果提示，Recombinant human PTN(rhPTN)处理促进胶质瘤细胞增殖和自我更新能力(图2,A-B)。通过特异性小干扰RNA干扰PTPRZ1表达显著抑制rhPTN促胶质瘤细胞增殖、自我更新能力(图2,C-D)。

6.移植瘤成瘤实验

6.1构建U937单核巨噬细胞(表达PTN-RNAi或Scramble无义序列)与胶质瘤细胞共注射的颅内原位移植瘤模型：

(1)收集U937单核巨噬细胞(表达PTN-RNAi或Scramble无义序列)与胶质瘤细胞，调整细胞密度；

(2)取4-6周龄雄性NOD/SCID小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，采用标准无菌条件饲养于第三军医大学西南医院实验动物中心)，用水合氯醛麻醉剂(西南医院药剂科)麻醉，用蛋白微量进样器(宁波镇海三爱仪器厂)将5μl细胞悬液(其中注射表达PTN-RNAi或Scramble无义序列的U937单核巨噬细胞的细胞量为2×10⁴个/只、胶质瘤细胞注射量为5×10³个/只)注射入小鼠颅内，进针位点在小鼠前正中线与外眦连线交接点后右侧旁开0.5cm处，进针深度为0.5cm。实验结果见图3。

6.2构建表达PTPRZ1小干扰RNA胶质瘤细胞颅内原位移植瘤模型：

(1)收集表达PTPRZ1小干扰RNA胶质瘤细胞及表达shNT对照组细胞，调整细胞密度为1×10³个/μl；

(2)取4-6周龄雄性NOD/SCID小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，采用标准无菌条件饲养于第三军医大学西南医院实验动物中心)，用水合氯醛麻醉剂(西南医院药剂科)麻醉，用蛋白微量进样器(宁波镇海三爱仪器厂)将5μl细胞悬液(胶质瘤细胞5×10³个/只)注射入小鼠颅内，进针位点在小鼠前正中线与外眦连线交接点后右侧旁开0.5cm处，进针深度为0.5cm。

6.3分析干扰PTN-PTPRZ1通路对荷瘤鼠成瘤及生存期的影响：

基于所述的在体移植瘤模型，进行活体动物成像检测。方法为：每只小鼠腹腔注射200μl Luciferin底物(BioVision公司)。10分钟后，用IVIS活体动物成像仪(PerkinElmer公司)检测各组小鼠的成瘤情况及Luciferase信号强度。待各组小鼠自然死亡后，采用Kaplan-Meier生存分析比较各组小鼠生存期。实验结果见图3、图4。

活体动物成像检测实验结果提示，用特异性小干扰RNA干扰U937源性巨噬细胞中PTN表达，能够显著抑制胶质瘤生长(图3，A)；特异性小干扰RNA干扰胶质瘤中PTPRZ1表达，能够显著抑制胶质瘤生长(图3，B)。

6.4免疫组化检测移植瘤中PTN、PTPRZ1的表达情况

(1)脱蜡：将移植瘤石蜡切片用烘片灯烘烤30分钟，迅速移入二甲苯缸中，脱蜡20分钟；重复1次；

(2)水化：100％-75％梯度乙醇过缸，依次为：无水乙醇，5分钟×2次；90％乙醇，5分钟；80％乙醇，5分钟；75％乙醇，5分钟；去离子水，5分钟×2次；

(3)阻断内源性过氧化物酶：采用3％H₂O₂阻断液，常温封闭40分钟；PBS漂洗3次，每次5分钟；

(4)抗原修复：采用4.5ml枸橼酸钠缓冲溶液A液+20.5ml枸橼酸钠缓冲溶液B液，加去离子水定容至250ml，流程为：微波炉功率800W处理4分钟，80W处理16分钟；修复结束后，室温自然冷却。

(5)PBS洗涤3次，每次5分钟；孵育PTN抗体(Proteintechs,10821-1-AP，1:100)或PTPRZ1抗体(BD Biosciences,610179,1:200)，4℃孵育过夜；

(6)次日，将切片盒取出于室温放置1h，PBS洗涤3次，每次5分钟；

(7)用DAB通用型二抗(DAKO公司)37℃孵育1h；

(8)显色：按比例配制好DAB显色液(DAKO公司)，40μl/片，镜下显色，用自来水漂洗终止显色；

(9)苏木素复染、盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗反蓝20分钟；

(10)脱水封片：将切片分别置于75％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、无水乙醇、无水乙醇各5分钟；二甲苯，10分钟。脱水结束后风干切片，用树脂溶液小心地进行封片。实验结果见图4。

由上述图中可看出构建U937源性巨噬细胞与胶质瘤细胞共转染移植瘤模型后，采用特异性小干扰RNA干扰U937源性巨噬细胞中PTN表达，能够抑制移植瘤中PTN的表达(图4，A)，能够显著延长荷瘤鼠生存时间(图4，C)；采用特异性小干扰RNA干扰胶质瘤细胞中PTPRZ1表达(图4，B)，能够显著延长荷瘤鼠生存时间(图4，D)，上述结果表明PTN-PTPRZ1通路是胶质瘤免疫治疗的有效分子靶标。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120> 靶向干扰肿瘤PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA在肿瘤免疫治疗中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1558

<212> mRNA

<213> Homo sapiens (human)

<220>

<223>

<400> 1

gagtgcaaag cgctctccct ccctcgccca gccttcgtcc tcctggcccg ctcctctcat 60

ccctcccatt ctccatttcc cttccgttcc ctccctgtca gggcgtaatt gagtcaaagg 120

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gaggaaaaaa atactaggaa aataaatcaa ggtgatgctg aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1558

<210> 2

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<212> mRNA

<213> Homo sapiens (human)

<220>

<223>

<400> 2

acagccgggc tggagcgcgc acccggcact gaggcttcgc tgctctcgga gcgctcagac 60

cgcggccgcc gcagccggcg aaagaggcaa agtcccgcac gccggaggac atgcgcctcg 120

gctagcggcc ccgggcccca ccaccgtgcg gctttctcca gattattcct ctctcgctgt 180

ctctgactgt ctctctctgt ctctgtctct gtctctctct ctctcacaca cacacacaca 240

cacacaaaca cacatacgca cgcacgatct cacttcgatc tatacactgg aggattaaaa 300

caaacaaaca aaaaaaacat ttccttcgct ccccctccct ctccactctg agaagcagag 360

gagccgcacg gcgaggggcc gcagaccgtc tggaaatgcg aatcctaaag cgtttcctcg 420

cttgcattca gctcctctgt gtttgccgcc tggattgggc taatggatac tacagacaac 480

agagaaaact tgttgaagag attggctggt cctatacagg agcactgaat caaaaaaatt 540

ggggaaagaa atatccaaca tgtaatagcc caaaacaatc tcctatcaat attgatgaag 600

atcttacaca agtaaatgtg aatcttaaga aacttaaatt tcagggttgg gataaaacat 660

cattggaaaa cacattcatt cataacactg ggaaaacagt ggaaattaat ctcactaatg 720

actaccgtgt cagcggagga gtttcagaaa tggtgtttaa agcaagcaag ataacttttc 780

actggggaaa atgcaatatg tcatctgatg gatcagagca tagtttagaa ggacaaaaat 840

ttccacttga gatgcaaatc tactgctttg atgcggaccg attttcaagt tttgaggaag 900

cagtcaaagg aaaagggaag ttaagagctt tatccatttt gtttgaggtt gggacagaag 960

aaaatttgga tttcaaagcg attattgatg gagtcgaaag tgttagtcgt tttgggaagc 1020

aggctgcttt agatccattc atactgttga accttctgcc aaactcaact gacaagtatt 1080

acatttacaa tggctcattg acatctcctc cctgcacaga cacagttgac tggattgttt 1140

ttaaagatac agttagcatc tctgaaagcc agttggctgt tttttgtgaa gttcttacaa 1200

tgcaacaatc tggttatgtc atgctgatgg actacttaca aaacaatttt cgagagcaac 1260

agtacaagtt ctctagacag gtgttttcct catacactgg aaaggaagag attcatgaag 1320

cagtttgtag ttcagaacca gaaaatgttc aggctgaccc agagaattat accagccttc 1380

ttgttacatg ggaaagacct cgagtcgttt atgataccat gattgagaag tttgcagttt 1440

tgtaccagca gttggatgga gaggaccaaa ccaagcatga atttttgaca gatggctatc 1500

aagacttggg tgctattctc aataatttgc tacccaatat gagttatgtt cttcagatag 1560

tagccatatg cactaatggc ttatatggaa aatacagcga ccaactgatt gtcgacatgc 1620

ctactgataa tcctgaactt gatcttttcc ctgaattaat tggaactgaa gaaataatca 1680

aggaggagga agagggaaaa gacattgaag aaggcgctat tgtgaatcct ggtagagaca 1740

gtgctacaaa ccaaatcagg aaaaaggaac cccagatttc taccacaaca cactacaatc 1800

gcatagggac gaaatacaat gaagccaaga ctaaccgatc cccaacaaga ggaagtgaat 1860

tctctggaaa gggtgatgtt cccaatacat ctttaaattc cacttcccaa ccagtcacta 1920

aattagccac agaaaaagat atttccttga cttctcagac tgtgactgaa ctgccacctc 1980

acactgtgga aggtacttca gcctctttaa atgatggctc taaaactgtt cttagatctc 2040

cacatatgaa cttgtcgggg actgcagaat ccttaaatac agtttctata acagaatatg 2100

aggaggagag tttattgacc agtttcaagc ttgatactgg agctgaagat tcttcaggct 2160

ccagtcccgc aacttctgct atcccattca tctctgagaa catatcccaa gggtatatat 2220

tttcctccga aaacccagag acaataacat atgatgtcct tataccagaa tctgctagaa 2280

atgcttccga agattcaact tcatcaggtt cagaagaatc actaaaggat ccttctatgg 2340

agggaaatgt gtggtttcct agctctacag acataacagc acagcccgat gttggatcag 2400

gcagagagag ctttctccag actaattaca ctgagatacg tgttgatgaa tctgagaaga 2460

caaccaagtc cttttctgca ggcccagtga tgtcacaggg tccctcagtt acagatctgg 2520

aaatgccaca ttattctacc tttgcctact tcccaactga ggtaacacct catgctttta 2580

ccccatcctc cagacaacag gatttggtct ccacggtcaa cgtggtatac tcgcagacaa 2640

cccaaccggt atacaatggt gagacacctc ttcaaccttc ctacagtagt gaagtctttc 2700

ctctagtcac ccctttgttg cttgacaatc agatcctcaa cactacccct gctgcttcaa 2760

gtagtgattc ggccttgcat gctacgcctg tatttcccag tgtcgatgtg tcatttgaat 2820

ccatcctgtc ttcctatgat ggtgcacctt tgcttccatt ttcctctgct tccttcagta 2880

gtgaattgtt tcgccatctg catacagttt ctcaaatcct tccacaagtt acttcagcta 2940

ccgagagtga taaggtgccc ttgcatgctt ctctgccagt ggctgggggt gatttgctat 3000

tagagcccag ccttgctcag tattctgatg tgctgtccac tactcatgct gcttcagaga 3060

cgctggaatt tggtagtgaa tctggtgttc tttataaaac gcttatgttt tctcaagttg 3120

aaccacccag cagtgatgcc atgatgcatg cacgttcttc agggcctgaa ccttcttatg 3180

ccttgtctga taatgagggc tcccaacaca tcttcactgt ttcttacagt tctgcaatac 3240

ctgtgcatga ttctgtgggt gtaacttatc agggttcctt atttagcggc cctagccata 3300

taccaatacc taagtcttcg ttaataaccc caactgcatc attactgcag cctactcatg 3360

ccctctctgg tgatggggaa tggtctggag cctcttctga tagtgaattt cttttacctg 3420

acacagatgg gctgacagcc cttaacattt cttcacctgt ttctgtagct gaatttacat 3480

atacaacatc tgtgtttggt gatgataata aggcgctttc taaaagtgaa ataatatatg 3540

gaaatgagac tgaactgcaa attccttctt tcaatgagat ggtttaccct tctgaaagca 3600

cagtcatgcc caacatgtat gataatgtaa ataagttgaa tgcgtcttta caagaaacct 3660

ctgtttccat ttctagcacc aagggcatgt ttccagggtc ccttgctcat accaccacta 3720

aggtttttga tcatgagatt agtcaagttc cagaaaataa cttttcagtt caacctacac 3780

atactgtctc tcaagcatct ggtgacactt cgcttaaacc tgtgcttagt gcaaactcag 3840

agccagcatc ctctgaccct gcttctagtg aaatgttatc tccttcaact cagctcttat 3900

tttatgagac ctcagcttct tttagtactg aagtattgct acaaccttcc tttcaggctt 3960

ctgatgttga caccttgctt aaaactgttc ttccagctgt gcccagtgat ccaatattgg 4020

ttgaaacccc caaagttgat aaaattagtt ctacaatgtt gcatctcatt gtatcaaatt 4080

ctgcttcaag tgaaaacatg ctgcactcta catctgtacc agtttttgat gtgtcgccta 4140

cttctcatat gcactctgct tcacttcaag gtttgaccat ttcctatgca agtgagaaat 4200

atgaaccagt tttgttaaaa agtgaaagtt cccaccaagt ggtaccttct ttgtacagta 4260

atgatgagtt gttccaaacg gccaatttgg agattaacca ggcccatccc ccaaaaggaa 4320

ggcatgtatt tgctacacct gttttatcaa ttgatgaacc attaaataca ctaataaata 4380

agcttataca ttccgatgaa attttaacct ccaccaaaag ttctgttact ggtaaggtat 4440

ttgctggtat tccaacagtt gcttctgata catttgtatc tactgatcat tctgttccta 4500

taggaaatgg gcatgttgcc attacagctg tttctcccca cagagatggt tctgtaacct 4560

caacaaagtt gctgtttcct tctaaggcaa cttctgagct gagtcatagt gccaaatctg 4620

atgccggttt agtgggtggt ggtgaagatg gtgacactga tgatgatggt gatgatgatg 4680

atgatgacag aggtagtgat ggcttatcca ttcataagtg tatgtcatgc tcatcctata 4740

gagaatcaca ggaaaaggta atgaatgatt cagacaccca cgaaaacagt cttatggatc 4800

agaataatcc aatctcatac tcactatctg agaattctga agaagataat agagtcacaa 4860

gtgtatcctc agacagtcaa actggtatgg acagaagtcc tggtaaatca ccatcagcaa 4920

atgggctatc ccaaaagcac aatgatggaa aagaggaaaa tgacattcag actggtagtg 4980

ctctgcttcc tctcagccct gaatctaaag catgggcagt tctgacaagt gatgaagaaa 5040

gtggatcagg gcaaggtacc tcagatagcc ttaatgagaa tgagacttcc acagatttca 5100

gttttgcaga cactaatgaa aaagatgctg atgggatcct ggcagcaggt gactcagaaa 5160

taactcctgg attcccacag tccccaacat catctgttac tagcgagaac tcagaagtgt 5220

tccacgtttc agaggcagag gccagtaata gtagccatga gtctcgtatt ggtctagctg 5280

aggggttgga atccgagaag aaggcagtta taccccttgt gatcgtgtca gccctgactt 5340

ttatctgtct agtggttctt gtgggtattc tcatctactg gaggaaatgc ttccagactg 5400

cacactttta cttagaggac agtacatccc ctagagttat atccacacct ccaacaccta 5460

tctttccaat ttcagatgat gtcggagcaa ttccaataaa gcactttcca aagcatgttg 5520

cagatttaca tgcaagtagt gggtttactg aagaatttga gacactgaaa gagttttacc 5580

aggaagtgca gagctgtact gttgacttag gtattacagc agacagctcc aaccacccag 5640

acaacaagca caagaatcga tacataaata tcgttgccta tgatcatagc agggttaagc 5700

tagcacagct tgctgaaaag gatggcaaac tgactgatta tatcaatgcc aattatgttg 5760

atggctacaa cagaccaaaa gcttatattg ctgcccaagg cccactgaaa tccacagctg 5820

aagatttctg gagaatgata tgggaacata atgtggaagt tattgtcatg ataacaaacc 5880

tcgtggagaa aggaaggaga aaatgtgatc agtactggcc tgccgatggg agtgaggagt 5940

acgggaactt tctggtcact cagaagagtg tgcaagtgct tgcctattat actgtgagga 6000

attttactct aagaaacaca aaaataaaaa agggctccca gaaaggaaga cccagtggac 6060

gtgtggtcac acagtatcac tacacgcagt ggcctgacat gggagtacca gagtactccc 6120

tgccagtgct gacctttgtg agaaaggcag cctatgccaa gcgccatgca gtggggcctg 6180

ttgtcgtcca ctgcagtgct ggagttggaa gaacaggcac atatattgtg ctagacagta 6240

tgttgcagca gattcaacac gaaggaactg tcaacatatt tggcttctta aaacacatcc 6300

gttcacaaag aaattatttg gtacaaactg aggagcaata tgtcttcatt catgatacac 6360

tggttgaggc catacttagt aaagaaactg aggtgctgga cagtcatatt catgcctatg 6420

ttaatgcact cctcattcct ggaccagcag gcaaaacaaa gctagagaaa caattccagc 6480

tcctgagcca gtcaaatata cagcagagtg actattctgc agccctaaag caatgcaaca 6540

gggaaaagaa tcgaacttct tctatcatcc ctgtggaaag atcaagggtt ggcatttcat 6600

ccctgagtgg agaaggcaca gactacatca atgcctccta tatcatgggc tattaccaga 6660

gcaatgaatt catcattacc cagcaccctc tccttcatac catcaaggat ttctggagga 6720

tgatatggga ccataatgcc caactggtgg ttatgattcc tgatggccaa aacatggcag 6780

aagatgaatt tgtttactgg ccaaataaag atgagcctat aaattgtgag agctttaagg 6840

tcactcttat ggctgaagaa cacaaatgtc tatctaatga ggaaaaactt ataattcagg 6900

actttatctt agaagctaca caggatgatt atgtacttga agtgaggcac tttcagtgtc 6960

ctaaatggcc aaatccagat agccccatta gtaaaacttt tgaacttata agtgttataa 7020

aagaagaagc tgccaatagg gatgggccta tgattgttca tgatgagcat ggaggagtga 7080

cggcaggaac tttctgtgct ctgacaaccc ttatgcacca actagaaaaa gaaaattccg 7140

tggatgttta ccaggtagcc aagatgatca atctgatgag gccaggagtc tttgctgaca 7200

ttgagcagta tcagtttctc tacaaagtga tcctcagcct tgtgagcaca aggcaggaag 7260

agaatccatc cacctctctg gacagtaatg gtgcagcatt gcctgatgga aatatagctg 7320

agagcttaga gtctttagtt taacacagaa aggggtgggg gaactcacat ctgagcattg 7380

ttttcctctt cctaaaatta ggcaggaaaa tcagtctagt tctgttatct gttgatttcc 7440

catcacctga cagtaacttt catgacatag gattctgccg ccaaatttat atcattaaca 7500

atgtgtgcct ttttgcaaga cttgtaattt acttattatg tttgaactaa aatgattgaa 7560

ttttacagta tttctaagaa tggaattgtg gtattttttt ctgtattgat tttaacagaa 7620

aatttcaatt tatagaggtt aggaattcca aactacagaa aatgtttgtt tttagtgtca 7680

aatttttagc tgtatttgta gcaattatca ggtttgctag aaatataact tttaatacag 7740

tagcctgtaa ataaaacact cttccatatg atattcaaca ttttacaact gcagtattca 7800

cctaaagtag aaataatctg ttacttattg taaatactgc cctagtgtct ccatggacca 7860

aatttatatt tataattgta gatttttata ttttactact gagtcaagtt ttctagttct 7920

gtgtaattgt ttagtttaat gacgtagttc attagctggt cttactctac cagttttctg 7980

acattgtatt gtgttaccta agtcattaac tttgtttcag catgtaattt taacttttgt 8040

ggaaaataga aataccttca ttttgaaaga agtttttatg agaataacac cttaccaaac 8100

attgttcaaa tggtttttat ccaaggaatt gcaaaaataa atataaatat tgccattaaa 8160

aaaaaaaaa 8169

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ccggtcagca aacaggatca gttaactcga gttaactgat cctgtttgct gatttttg 58

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ccggaggcaa gaaacaggag aagatctcga gatcttctcc tgtttcttgc ctttttt 57

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gcacaagaat cgatacata 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

cgaaggaact gtcaacata 19

Claims

1.靶向干扰肿瘤中PTN-PTPRZ1通路的小干扰RNA，其特征在于，所述小干扰RNA的靶基因为PTN和/或PTPRZ1；所述PTN的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述PTPRZ1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述肿瘤包括但不仅限于胶质瘤。

3.根据权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述小干扰RNA包括如SEQ ID NO:3-6中的一条或多条序列。

4.根据权利要求3所述的小干扰RNA，其特征在于，SEQ ID NO:3-4为PTN基因的小干扰RNA序列；SEQ ID NO:5-6所示为PTPRZ1基因的小干扰RNA序列。

5.权利要求1-4任一项所述的小干扰RNA在制备用于治疗胶质瘤抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括小干扰RNA及其编码基因、用于表达小干扰RNA的重组载体在制备用于治疗胶质瘤肿瘤药物中的应用。

7.抑制胶质瘤细胞增殖和胶质瘤生长的方法，其特征在于，通过将PTN和/或PTPRZ1基因的小干扰RNA慢病毒载体体外感染胶质瘤细胞来抑制胶质瘤细胞增殖和胶质瘤生长。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述小干扰RNA包括如SEQ ID NO:3-6中的一条或多条序列。

9.治疗胶质瘤肿瘤的药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的小干扰RNA和药学上可接受的载体或助剂。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述药物通过所述小干扰RNA靶向干扰PTN-PTPRZ1通路来抑制胶质瘤细胞的增殖、自我更新和抑制肿瘤相关巨噬细胞促胶质瘤在体内的生长。