CN109432119B

CN109432119B - 一种circRNA抑制血管新生领域的应用

Info

Publication number: CN109432119B
Application number: CN201811538901.0A
Authority: CN
Inventors: 肖振
Original assignee: Shanghai Kashu Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Yizhou (Shanghai) biomedical Co.,Ltd.
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: CN109432119A

Abstract

本发明公开了一种circRNA抑制血管新生领域的应用，属于涉及生物化学、分子生物学和医学领域。本发明发现,hsa_circ_0007411可持续作用于眼部血管内皮细胞，改变血管生成的结构，抑制血管新生，其作用于眼部微血管内皮细胞可有效抑制90％血管形成，可有效抑制新生血管相关疾病的血管新生。本发明验证了hsa_circ_0007411对细胞增殖迁移的作用，证明hsa_circ_0007411可明显抑制细胞增殖迁移，对内皮细胞的增殖起到明显的阻遏作用，对于血管内皮细胞增殖的相关疾病有重要的指导意义。

Description

一种circRNA抑制血管新生领域的应用

本发明一种circRNA抑制血管新生领域的应用，属于涉及生物化学、分子生物学和医学领域。

背景技术

血管生成(Angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。血管生成机制复杂，参与并促进血管生成的因子也众多，EMT腹腔液中巨噬细胞数量明显增加，其分泌的TNF-α和IL-8可以促进血管内皮细胞的增殖，转化生长因子-β(TGF-β)，血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)，乙酰肝素酶，血管生成素(angs)，骨生成素(OPN)，环氧化酶(COX-2)，缺氧诱导因子-1，层粘连蛋白(LN)，胎盘生长因子(PLGF)，Survivin，促红细胞生成素(Epo)均参与了EMT血管形成过程(De Palma M.Nat.Rev.Cancer 2017 08；17(8)457-474)。

病理性新生血管的相关疾病包括肿瘤新生血管(Li X.Science 2018 Mar 23；359(6382)1335-1336)、脑缺血新生血管(Chang J.Nat.Med.2017；23(4)450-460)、肾脏新生血管(Amin EM.Cancer Cell 2011；20(6)768-780)、糖尿病新生血管(Hu J.Nature 2017 1214；552(7684))等。新生血管的产生为一复杂的生物学过程，牵涉多种生长因子及其讯息传递受体，且靶向在讯息传递路径(signaling cascade)中的单一分子可能无法对疾病(例如癌症)中不受控的血管新生提供有效的临床治疗。因此，发展可协同结合数种关键的血管新生因子，以有效抑制血管新生及疾病进程的创新疗法的需求将不断的增加。如今治疗血管新生主要利用靶向药物抗VEGF疗法，然而针对靶向药物的个体不敏感性及耐药性临床尚未有有效攻克方法。

PTPN12可抑制EGFR和肿瘤血管新生(Lin Q.Cancer Biother.Radiopharm.201833(2)60-64)。联合抑制PTPN12受体的调节有效控制三阴性乳腺癌(Nair,A.,NatureMedicine,2018 24(4),505–511.)。PTPN12在mRNA形成过程中还有一个形式为circRNA环状形式，circRNAs(Circular RNAs，环状RNA分子)是一类不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴，并以共价键形成环形结构的非编码RNA分子。大量研究显示其可通过作用下游的miRNA影响mRNA的表达影响肿瘤及血管新生(Li,C.-Y.,Biomedicine&Pharmacotherapy,2017 95,1514–1519.)，但具体发生作用的circRNA尚不明确。

发明内容

本发明首先通过设计能扩增环状RNA的特异性引物，PCR扩增出来PTPN12基因的环状RNA，并通过一代测序的方法测定出来了环状RNA circ-PTPN12的准确的环化位点，确定了PTPN12基因表达一种由487个核苷酸组成的，具有闭合环状结构的环状RNA分子。本发明还发现了hsa_circ_0007411在肿瘤新生血管，糖尿病新生血管，眼部新生血管及脑部新生血管的作用，并通过体外实验模型验证了其有效抑制血管新生的作用。

本发明的第一个目的是提供一种circRNA在制备抑制血管新生的药物方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述药物包括药学上可接受的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述circRNA为hsa_circ_0007411，其核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述抑制血管新生是抑制包括肿瘤新生血管、动脉粥样斑块内新生血管、糖尿病新生血管、眼部新生血管、脑部新生血管在内的新生血管。

在本发明的一种实施方式中，所述药物内部包裹所述circRNA hsa_circ_0007411。

本发明的第二个目的是提供一种针对于circ-PTPN12的基因及其表达产物作为靶点在制备或筛选抗新生血管的药物中的用途。

在本发明的一种实施方式中，所述circRNA在CircBase中的circRNA ID为hsa_circ_0007411。

在本发明的一种实施方式中，所述PTPN12基因在NCBI中的序号为NM_002835.4。

本发明还提供所述circRNA在制备抗缺血性脑卒中血管新生、抗肾新生血管、抗糖尿病新生血管及抗眼部新生血管的药物方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述抗眼部新生血管具体包括抗脉络膜新生血管、糖尿病视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、老年性黄斑退化(AMD)、视网膜静脉阻塞、多发息肉性脉络膜血管病变。

本发明还要求包括所述circRNA在制备抑制细胞增殖迁移的药物方面的应用。

本发明的优点和效果：

(1)本发明首次发现了hsa_circ_0007411可持续作用于眼部血管内皮细胞，改变血管生成的结构，作用于眼部微血管内皮细胞可有效抑制90％血管形成，。

(2)本发明验证了hsa_circ_0007411对细胞增殖迁移的作用，证明hsa_circ_0007411可明显抑制细胞增殖迁移，对内皮细胞的增殖起到明显的阻遏作用，对于血管内皮细胞增殖的相关疾病有重要的指导意义。

附图说明

图1为细胞迁移实验结果图，其中，L为正常环境培养(培养基糖浓度5.5nmol/l)；H为给予高糖培养基培养(培养基糖浓度30nmol/l)；NC为对照质粒；7411-1为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-1；7411-2 H为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-2；7411OE为环状RNAcirc_0007411过表达质粒；；

图2为Transwell实验结果图其中，L为正常环境培养(培养基糖浓度5.5nmol/l)；H为给予高糖培养基培养(培养基糖浓度30nmol/l)；NC为对照质粒；7411-1为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-1；7411-2 H为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-2；7411OE为环状RNAcirc_0007411过表达质粒；；

图3为血管形成实验结果图，其中，L为正常环境培养(培养基糖浓度5.5nmol/l)；H为给予高塘培养基培养(培养基糖浓度30nmol/l)；NC为对照质粒；7411-1为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-1；7411-2 H为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-2；7411OE为环状RNAcirc_0007411过表达质粒；。

具体实施方式

实施例1

表1引物序列

circ-0007411干扰片段和过表达质粒构建：circ-0007411干扰片段设计：在苏州吉玛公司合成表1所示的siRNA序列。过表达载体构建：合成circ-0007411线性全序列，序列经过退火成双链DNA片段，通过多克隆位点插入到LV-Circ载体，重组质粒通过测序进行鉴定，Control阴性对照为未插入序列的LV-Circ空载体。取10μl转染试剂Lipofectamine2000，与100μl的无血清无抗生素opti-MEMI培养基混匀配成溶液。将10μl稀释好的siRNA与100μl无血清无抗生素的opti-MEMI培养基混匀配成溶液。将上述两种溶液置于常温中静置5min后，充分混匀，再次静置20min后，加入已经接种好人RPECs的培养皿中。4h后吸弃上清液，并更换培养基为含10％FBS的DMEM培养基培养。同时，设置7411-1和7411-2的实验组，N-Control siRNA的对照组和无siRNA转染的空白组(HG)以及正常的control组(LG)。7411-1和7411-2均为环状RNA circ_0007411的siRNA。如表1所示，沉默了环状RNA circ_0007411可以明显促进细胞增殖，7411OE为环状RNA circ_0007411过表达质粒，表1所示，过表达环状RNA circ_0007411可以明显抑制细胞增殖差异具有统计学意义(t＝18.08，P＜0.0001)。

表2 CCK8实验在不同处理条件下的吸光度值

注：L为正常环境培养(培养基糖浓度5.5nmol/l)；H为给予高糖培养基培养(培养基糖浓度30nmol/L)；NC为对照质粒；7411-1为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-1；7411-2H为环状RNA circ_0007411干扰siRNA-2；7411OE为环状RNA circ_0007411过表达质粒。

实施例2

预先用记号笔在35mm培养皿底面作井字形标记，接种培养人视网膜微血管内皮细胞，待细胞密度近100％时，使用10μl枪头根据井字形标记划痕，PBS冲洗后更换培养基，于0h，24h拍照，用ImageJ测量边缘距离变化。细胞划痕实验结果显示，初始时间各组细胞划痕间距大致相等时，经过24h，图1显示7411OE组划痕愈合距离为(134.4±45.4)μm、和7411-2组划痕愈合距离为(330.0±23.1)μm。7411OE组愈合速度明显低于其他组，差异有统计学意义(t＝8.25，P＜0.01)。7411-2组愈合速度明显高于其他组，差异有统计学意义(t＝10.78，P＜0.01)。可见环状RNA circ_0007411对人视网膜微血管内皮细胞的损伤愈合有促进作用。

实施例3

将实施例1的各组按照条件转染后在24孔板各孔内分别加入DMEM培养基600μl，同时置入孔径为8.0μm的transwell小室，小室内加入200μl含1×10⁴个人视网膜微血管内皮细胞的无FBS培养基培养。48h后吸弃上下室培养基，用棉签擦净上室内细胞，24孔板内加入0.4g/L多聚甲醛600μl室温固定30min，吸弃多聚甲醛，PBS冲洗小室背面两遍，24孔板内加入结晶紫600μl，室温染色20min，吸出后PBS冲洗小室背面两遍，显微镜下观察照相，随机取5视野进行细胞计数。

如图2所示，7411-2组人视网膜微血管内皮细胞向外迁移数为(2227±14)个。两组间细胞向外迁移数比较，7411-2组高于对照组(NC)(325±5)，差异有统计学意义(t＝5.44，P＝0.0006)，7411OE组低于正常组(NC)，差异有统计学意义(t＝7.89，P＝0.0005)。可见环状RNA circ_0007411对人视网膜微血管内皮细胞的迁移有抑制作用。

实施例4

将-20℃保存的Matrigel基质胶置于4℃冰箱中过夜，当其完全融解成红色胶状液体时方可使用。用预冷的枪头向预冷的48孔板中加入Matrigel胶，每孔150μl。在冰上轻轻晃动培养板，使Matrigel胶平铺于板底。随后将48孔板置于37℃培养箱30min，使Matrigel胶凝固。待细胞长至80％～90％融合时，更换无血清培养基饥饿24h。PBS清洗细胞3次，加入0.25％胰酶消化细胞，体积以覆盖瓶底为限，轻轻摇晃瓶身，使胰酶与细胞充分接触，37℃孵育数分钟。在倒置显微镜下观察细胞形态，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大，但细胞尚未漂起时，立即加入完全培养基终止消化。用培养液反复吹打培养瓶底，使细胞完全脱落，收集全部液体至离心管中，细胞计数板计数。

将培养液常温离心，1000rpm，5min。弃去上清，加入新的培养液，吹打成细胞悬液，等体积分装至四个离心管中，再次离心，1000rpm，5min。各管弃去上清，加入等体积的各组条件培养基制成细胞悬液。以3×10⁴个/孔的密度接种于已铺好胶的培养板中，每组设2个复孔，在37℃，5％CO₂培养箱中孵育8h。利用倒置显微镜观察细胞，并用照相系统采集图像，应用ImagePro-Plus软件分析图像，计算形成血管腔的数目。如图3所示，8h时四组人视网膜微血管内皮细胞形成的管腔个数，7411-2管腔数较对照组(NC)显著增加(P＝0.0003，<0.05)，7411OE组比高糖组管腔数显著减少(P＝0.025，<0.05)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海卡序生物医药科技有限公司

<120> 一种circRNA抑制血管新生领域的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ttgatcacag ccgagttaaa ttgacattaa agactccttc acaagattca gactatatca 60

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gcugugauca acugcaaugt t 21

Claims

1.一种circRNA在制备抑制血管新生的药物方面的应用，其特征在于，所述circRNA在CircBase中的circRNA ID为hsa_circ_0007411；所述抑制血管新生是抑制眼部血管新生。

2.如CircBase ID为hsa_circ_0007411的circRNA在制备抑制视网膜内皮细胞增殖迁移的药物方面的应用。