CN115896107A - 一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰rna及其dna四面体复合物 - Google Patents
一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰rna及其dna四面体复合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115896107A CN115896107A CN202211066294.9A CN202211066294A CN115896107A CN 115896107 A CN115896107 A CN 115896107A CN 202211066294 A CN202211066294 A CN 202211066294A CN 115896107 A CN115896107 A CN 115896107A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sirna
- seq
- interfering rna
- small interfering
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 127
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 title claims abstract description 121
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 title claims description 10
- 108010043471 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Proteins 0.000 claims abstract description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 34
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 31
- 102100025373 Runt-related transcription factor 1 Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 58
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 32
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 25
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 20
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims description 8
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims description 7
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims description 6
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 claims description 6
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 5
- 230000004402 high myopia Effects 0.000 claims description 4
- 208000001297 phlebitis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 2
- 206010057267 Periphlebitis Diseases 0.000 claims 2
- 208000033825 Chorioretinal atrophy Diseases 0.000 claims 1
- 208000008515 Choroidal sclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 abstract description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 19
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 16
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 14
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 description 10
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 10
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 9
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 102000002664 Core Binding Factor Alpha 2 Subunit Human genes 0.000 description 8
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 8
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012098 Lipofectamine RNAiMAX Substances 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 4
- 208000007135 Retinal Neovascularization Diseases 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 4
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 description 3
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 description 3
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 3
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 3
- 238000013355 OIR mouse model Methods 0.000 description 3
- 102000000574 RNA-Induced Silencing Complex Human genes 0.000 description 3
- 108010016790 RNA-Induced Silencing Complex Proteins 0.000 description 3
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 3
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 3
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- -1 Ro5-3335 benzodiazepine derivative Chemical class 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 208000000208 Wet Macular Degeneration Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 2
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004263 retinal angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000001743 silencing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000719121 Arabidopsis thaliana Protein MEI2-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000028006 Corneal injury Diseases 0.000 description 1
- 206010055665 Corneal neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000857677 Homo sapiens Runt-related transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 description 1
- 206010025415 Macular oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 208000035719 Maculopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000030768 Optic nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037111 Retinal Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010038923 Retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010038934 Retinopathy proliferative Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 208000034698 Vitreous haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229940027545 aflibercept injection Drugs 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 1
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 1
- 229960002233 benzalkonium bromide Drugs 0.000 description 1
- KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M benzododecinium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 KHSLHYAUZSPBIU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000009699 differential effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005553 drilling Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 208000011325 dry age related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001497 fibrovascular Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940090044 injection Drugs 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000554 iris Anatomy 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 201000010230 macular retinal edema Diseases 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Zoology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及一种小干扰RNA及其用途,所述小干扰RNA特异性靶向Runt相关转录因子1基因及其同型mRNA,通过沉默其互补基因的表达,下调RUNX1表达量。将本发明的siRNA用于制备治疗新血管生成性眼科疾病的药物,具有十分良好的应用前景。本发明还将siRNA与TDNs设计成具有空间四面体结构的TDNs‑siRNA核酸分子,增加了稳定性,帮助siRNA高效入胞,提高siRNA对RUNX1mRNA的降解效力,从而减少RUNX1的表达,阻止新生血管的生成。
Description
技术领域
本发明涉及针对新生血管性视网膜疾病的药物领域,具体而言,其涉及沉默Runt相关转录因子1(RUNX1)基因的基因药物领域。
背景技术
新生血管形成(新血管生成)是很多眼部疾病的共同病理改变,常发生于角膜、虹膜、脉络膜和视网膜,导致的疾病包括角膜新生血管、脉络膜新生血管、视网膜新生血管等病变,常见的由此导致的眼部疾患包括例如:糖尿病性视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)(包括湿性AMD和干性AMD,湿性AMD的病理改变为脉络膜新生血管)、新生血管性青光眼等。新生血管可以在角膜、虹膜睫状体、脉络膜、视网膜、黄斑及视盘等几乎眼内所有组织中出现,它能够引起这些部位的组织出血、渗出及增生等一系列病理改变,因而造成眼球结构和功能的破坏,严重损害视功能。眼底新生血管性疾病患者人数在4000万以上,且随着人口老龄化程度加重,患者人数还在不断上升。眼底新生血管性疾病的患者几乎每月都要复诊或注射相关药物,否则视力的受损会严重影响生活。已有研究对于上述疾病的病因探究主要集中于因缺血、缺氧等因素触发炎性反应并刺激该区域促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)等产生,诱导脉络膜、视网膜新生血管形成,并迅速增加微血管的通透性,从而导致黄斑水肿、视网膜出血、玻璃体积血等严重危害视力的并发症。
RUNX1又称为AML1,是人类白血病中染色体易位最常见的靶位点。RUNX1是十分重要的转录因子,在多种造血细胞系中广泛表达,在造血细胞的分化中起着关键作用,亦可调节造血相关基因的表达。RUNX1基因异常表达和突变常与人类白血病的发生相关。许多研究表明RUNX1是造血细胞生成过程中重要的调节因子,RUNX1蛋白可接受多种翻译后修饰,包括磷酸化、乙酰化等,其活性可受这些翻译后修饰的影响,从而调节造血细胞的分化、凋亡及自我更新。
近年来,相关研究挖掘出RUNX1靶点与眼新生血管之间的关系,如文献Identification of RUNX1 as a Mediator of Aberrant Retinal Angiogenesis[J].Diabetes,2017:1950-1956.中将Runt相关转录因子1(RUNX1)鉴定为通过转录组学分析从人PDR纤维血管膜(FVM)获得的CD31(+)血管内皮细胞中上调的基因。使用人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)的体外研究表明,在高葡萄糖反应中,RUNX1RNA和蛋白质表达增加,而RUNX1抑制降低了HRMEC的迁移,增殖和管形成。RUNX1的免疫组织化学染色显示,氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中患者来源的FVM血管和血管生成簇的血管生成血管具有反应性,这表明RUNX1上调是视网膜血管生成异常的标志。文献Inhibition of Runx1 by the Ro5-3335 benzodiazepine derivative reduces aberrant retinal angiogenesis[.Investigative Ophthalmology&Visual Science,2017中通过RUNX1染色定位为新生血管簇表明,它是视网膜血管生成异常中内皮细胞功能的新型特异性调节因子。玻璃体内注射Ro5-3335(RUNX1-CBFβ相互作用抑制剂)与载体处理的幼崽相比,新生血管簇面积显着减少有关。这与缺血区域的显著变化无关,这表明视网膜的正常和异常血管形成之间存在独立调节,用Ro5-3335抑制RUNX1功能可有效减少病理性视网膜新生血管形成。
发明内容
本发明的一个目的是提供靶向Runt相关转录因子1(RUNX1)基因及其同型mRNA降解的小干扰RNA(siRNA);
本发明的另一个目的是提供含有所述siRNA的药物组合物;
本发明的再一个目的是提供所述siRNA或所述含有siRNA的药物组合物的用途;
本发明的再一个目的是提供一种DNA四面体-siRNA复合物及其用途。
根据本发明的一方面,一种针对特异性靶向并引起RNAi诱导的Runt相关转录因子1(RUNX1)及其同种型的mRNA降解的小干扰RNA(siRNA)。该siRNA双链可与RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)连接在一起,并在与RISC结合后,靶向切割特定mRNA为10~11个碱基的小片段,从而中断RUNX1 mRNA的翻译过程,沉默其互补基因的表达,下调RUNX1表达量,从而抑制新血管生成。
因此,本发明所述的小干扰RNA特异性靶向Runt相关转录因子1基因及其同型mRNA,通过沉默其互补基因的表达,下调RUNX1表达量,所述的小干扰RNA选自:
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸组成的反义链;
(b)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸组成的反义链;和
(c)如SEQ ID NO.5所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸组成的反义链。
本发明所述的药物组合物,含有治疗有效量的所述的小干扰RNA。
在某些实施方式中,所述siRNA包含形成RNA双链体的正义RNA链和反义RNA链。正义RNA链包含与靶mRNA中约19至约25个连续核苷酸的靶序列相同的核苷酸序列。
在某些实施方式中,所述siRNA序列,虽然可能与非靶序列共有一定的序列同源性,但仍然充分不同以致对于非靶序列不发生RNA沉默。包括与非靶序列具有90%同源性、85%同源性、80%同源性、75%同源性、70%同源性、65%同源性、60%同源性、55%同源性、50%同源性、45%同源性、40%同源性、35%同源性、30%同源性、25%同源性、20%同源性、15%同源性、10%同源性、5%同源性、2%同源性和1%同源性的序列。与非靶序列完全不同源的序列被认为是与序列不互补的。
在某些实施方式中,所述siRNA可包含部分纯化的RNA、大体上纯的RNA、合成的RNA或重组产生的RNA以及与天然存在的RNA相异在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的RNA。此类改变可包括非核苷酸材料例如至siRNA的末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸的添加,包括使siRNA抗核酸酶降解的修饰。
在某些实施方式中,siRNA核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的正义链,如SEQ IDNO:2所示的反义链;或如SEQ ID NO:3所示的正义链、如SEQ ID NO:4所示的反义链;或如SEQ ID NO:5所示的正义链、如SEQ ID NO:6所示的反义链。
本发明的siRNA可使用本领域技术人员已知的常规技术获得,包括但不限于化学合成或重组产生。在某些实施方式中,siRNA可使用适当地保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪来化学合成,或者还可使用任何适当的启动子从重组环状或线性DNA质粒表达siRNA。在某些实施方式中,可利用标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的siRNA,或可在体内在新血管形成的区域或附近细胞内表达siRNA。
本发明第二方面是提供本发明的siRNA或含有其的药物组合物在制备预防和/或治疗新生血管性眼科疾病的药物中的应用。所述新生血管性眼科疾病包括但不限于:糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、年龄相关性黄斑变性、高度近视黄斑出血、中心性渗出性视网膜脉络膜病变和其他血管生成性疾病。
本发明第三方面提供了一种治疗新血管生成性眼科疾病(新生血管性眼科疾病)的药物组合物,包括治疗有效量的siRNA化合物和药学上可接受的辅料(媒介、载体),所述siRNA核苷酸序列包含如SEQ ID NO:1所示的RNA正义链,如SEQ ID NO:2所示的RNA反义链(对应表1中siRNA-3);或如SEQ ID NO:3所示的RNA正义链、如SEQ ID NO:4所示的RNA反义链(对应表1中siRNA-4);或如SEQ ID NO:5所示的RNA正义链、如SEQ ID NO:6所示的RNA反义链(对应表1中siRNA-6)。
在某些实施方式中,通过考虑诸如受试者的大小和体重等因素,本领域技术人员可以容易地确定要给予给定受试者的siRNA的有效量。所述有效量的siRNA是足以引起细胞中的靶mRNA的RNAi介导的降解的量。临床上有效量是,当给受试者施用时,将通过RNA沉默抑制受试者的血管生成的进展的量。
根据本发明的再一方面,本发明也提供新血管生成性眼科疾病的治疗方法,特别是视网膜新血管性眼科疾病(新生血管性视网膜疾病)的治疗方法,包括将预防和/或治疗有效量的siRNA或含有siRNA的药物组合物施用于有需要的个体。
在某些实施方式中,可以将siRNA或含有siRNA的药物组合以预防和/或治疗的有效剂量施用于患眼的整体、局部,特别是玻璃体。制剂方式可以是任何适于眼部局部施用的剂型,包括但不限于注射剂、滴眼剂等。
施用所述药物组合物能够降低RUNX1的基因表达,进而抑制患眼相关部位新血管生成,并促进患眼血管的正常化。
DNA四面体-siRNA复合物
目前已有研究的针对AMD、DME等眼底新生血管疾病的siRNA药物有3款,针对的靶点均为VEGF。然而,siRNA药物用于治疗有两大挑战:一个是siRNA暴露血液会有稳定性问题并造成免疫原性,一个是大分子量负电的siRNA无法自己跨膜进入胞内。因此,siRNA往往需要通过载体递送入胞来发挥功能,其中使用最丰富的是腺相关病毒载体(AAV)递送平台,然而,不断有权威研究表明AAV可将外源基因片段插入到染色体上,其是否会影响细胞增殖凋亡等功能甚至最终导致癌变,成为其作为载体平台使用中的隐患。又如非病毒载体质纳米粒(LNP)在目前的药物开发中也有较多使用,但由于存在较严重的过敏反应,因而在注射使用LNP递送系统的药物之前,患者需要使用抗组胺和激素药物控制,因此只适用于罕见病和癌症等严重疾病,对于慢性病使用限制较大。
DNA四面体(Tetrahedral DNA Nanostructures,TDN)是一种由4条单链DNA通过变性和复性进而通过链间碱基互补配对形成的一种四面体结构,它易于合成,生物相容性高,在先的专利对于TDNs在眼科疾病中的用途进行了公开,如专利CN109646450B中披露了TDNs在制备治疗角膜损伤的药物中的用途,专利CN112007044B中公开了TDNs-miR155复合物及其在制备预防或治疗湿性黄斑病变的药物中的用途,专利CN112843085B中公开了TDNs-miR22复合物及其在制备治疗视神经损伤的药物中用途。目前尚未见TDNs携载siRNA进行眼科疾病的治疗。
本发明采用DNA四面体作为携带靶向RUNX1 mRNA的siRNA的载体系统,其稳定性和安全性优异,不易被核酸酶溶解;无需转染,易于穿过细胞膜,能够增强药物的细胞摄取效果,进而提高siRNA对mRNA的降解效力,阻止新生血管的生成。在使用浓度下,各种类型的活细胞(如RAW264.7细胞和L929成纤维细胞样细胞)均未显示出明显的细胞毒性或不良反应。
因此,本发明提供用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物,所述DNA四面体药物复合物包括:
(1)小干扰RNA,所述小干扰RNA特异性靶向Runt相关转录因子1基因及其同型mRNA,沉默RUNX1互补基因的表达,下调RUNX1表达量,所述的小干扰RNA选自:
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸组成的反义链;
(b)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸组成的反义链;和
(c)如SEQ ID NO.5所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸组成的反义链;以及
(2)一DNA四面体,所述DNA四面体由四条单链DNA经碱基互补配对形成;所述四条单链DNA的核苷酸序列分别一对一地选自如SEQ ID NO.7~10的所示序列;
其中所述小干扰RNA与DNA四面体的至少一条单链连接。
优选地,其中将所述小干扰RNA的有义链通过化学键与所述DNA四面体的至少一条单链连接。
优选地,其中在所述小干扰RNA的有义链与所述DNA四面体的至少一条单链之间还包含一接头。
更优选地,其中所述接头为连接序列-TTTTT-。
本发明所述的的DNA四面体药物复合物的制备中,将形成所述DNA四面体的四条单链DNA以等摩尔比置于足以使其变性的温度下使其变性,然后将温度降低至使其退火进而通过链间碱基互补配对形成DNA四面体结构;将所述四条单链DNA的至少一条连接所述小干扰RNA。
在一个较佳实施方案中,本发明所述的DNA四面体,也即TDNs,是4条单链DNA经碱基互补配对形成;所述4条单链DNA的序列依次对应SEQ ID NO.7-10的所述序列,其可通过变性、退火过程组装形成目标产物TDNs。具体而言,将TDNs的4条单链DNA置于足以使其变性的温度下维持10min,再将温度降低至2-8℃维持20min以上。
在某些实施方式中,DNA四面体和siRNA按照1:(1-4)的摩尔比构成。所述DNA四面体中的至少任意一条DNA单链的末端与所连接siRNA的正义链连接。
在某些实施方式中,所述DNA四面体的单链DNA与siRNA正义链之间还含有连接序列,所述连接序列为核苷酸序列,优选为脱氧核糖核苷酸序列,更优选为-TTTTT-,所述-TTTTT-序列即连续5个胸腺嘧啶脱氧核苷酸序列。
在本发明的一个较佳实施方案中,还提供了一种TDNs-siRNA核酸分子的制备方法,它是将DNA四面体的4条DNA单链置于足以使其变性的温度下维持10min以上,再将温度降低到2~8℃维持20min以上,其中所述4条单链的至少1条连接有靶向沉默RUNX1的siRNA。
优选地,所述DNA四面体是由所述4条DNA单链经90~98℃变性10~15min、2~8℃退火20~30min制备而成,其中1条连接有靶向沉默RUNX1的siRNA。
更优选地,所述DNA四面体是由所述4条DNA单链经95℃变性10min、4℃退火20min制备而成,其中1条连接有靶向沉默RUNX1的siRNA。
本发明的又一方面,还提供了上述的TDNs-siRNA核酸分子在制备预防和/或治疗新血管生成性眼科疾病的药物中的用途,特别是在制备预防和/或治疗视网膜新血管生成性疾病的药物中的用途。
在某些实施方式中,所述新血管生成性眼科疾病包括但不限于:糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、年龄相关性黄斑变性、高度近视黄斑出血、中心性渗出性视网膜脉络膜病变和其他血管生成性疾病。
本发明还提供了一种治疗新血管生成性眼科疾病的药物组合物,所述药物组合物含有上述预防和/或治疗新血管生成性眼科疾病的TDNs-siRNA核酸分子和药学上可接受的辅料(媒介、载体)。
在某些实施方式中,通过考虑诸如受试者的大小和体重等因素,本领域技术人员可以容易地确定要给予给定受试者的TDNs-siRNA的有效量。所述有效量是足以引起细胞中的靶mRNA的RNAi介导的降解的量。临床上有效量是,当给受试者施用时,将通过RNA沉默抑制受试者的血管生成的进展的量。
根据本发明的再一方面,本发明也提供与新血管生成性眼科疾病的治疗方法,包括将预防和/或治疗有效量的TDNs-siRNA或含有TDNs-siRNA的药物组合物施用于有需要的个体。
在某些实施方式中,可以将TDNs-siRNA或含有TDN-siRNA的药物组合以预防和/或治疗的有效剂量施用于患眼的整体、局部,特别是玻璃体。制剂方式可以是任何适于眼部局部施用的剂型,包括但不限于注射剂、滴眼剂等。
有益的效果
本发明所提供的siRNA能引起RNAi介导的Runt相关转录因子1(RUNX1)mRNA的翻译过程,从而抑制或沉默其互补基因的表达,下调RUNX1表达,将siRNA用于制备治疗新血管生成性眼科疾病的药物,具有十分良好的应用前景。
本发明首次将siRNA与TDNs设计成具有空间四面体结构的TDNs-siRNA核酸分子,增加了稳定性,帮助siRNA高效入胞,提高siRNA对RUNX1 mRNA的降解效力,从而减少RUNX1的表达,阻止新生血管的生成。
附图说明
图1为经各候选siRNA(siRNA-2/siRNA-3/siRNA-4/siRNA-6)处理后其RUNX1 mRNAPCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图,其中泳道1-3为siRNA-2样品、泳道4-6为siRNA-3样品、泳道7-9为siRNA-4样品、泳道10-12为siRNA-6样品、泳道13-15为空白对照组样品;
图2为经各候选siRNA处理后,其RUNX1基因沉默效果定量分析图;
图3为TDN以及TDN-siRNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳图,其中泳道1为TDN样品、泳道2-6为TDN-siRNA-3样品;
图4为TDN以及TDN-siRNA的毛细管电泳图;
图5为TDN以及TDN-siRNA的透射电镜图;
图6为TDN以及TDN-siRNA的粒径/电位结果图;
TDN(左)、TDN-siRNA(右)
图7为siRNA、siRNA+Lipo、TDN、TDN-siRNA复合物在不同细胞(HEK-293细胞、HUVEC细胞以及HREC细胞)中的入胞效率;
图8为各给药组施用后,不同细胞中RUNX1基因沉默效果,其中包括空白组(control)、siRNA组和siRNA+Lipo组、不同浓度的TDN组(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L)、不同浓度的TDN-siRNA组(5nmol/L、10nmol/L、15nmol/L);
图9为各给药组施用后,不同细胞(HEK-293细胞、HUVEC细胞以及HREC细胞)中RUNX1蛋白表达抑制水平统计,其中包括空白组(control)、siRNA组、siRNA+Lipo组、TDN组、TDN-siRNA组;
图10为HREC细胞各实验组RUNX1蛋白WB检测条带;
图11为各给药组施用于鸡胚绒毛尿囊膜模型后,其新生血管抑制水平,包括空白组(control)、Aflibercept(阳性对照)组、siRNA组、siRNA+Invivofectamine(转染试剂)、TDN组、TDN-siRNA组;
图12为各给药组施用于小鼠OIR模型后,各组小鼠视网膜中RUNX1蛋白表达量的水平,包括空白组(control)、siRNA组、siRNA+Invivofectamine组、TDN组、TDN-SiRNA组;
图13为各给药组施用于小鼠OIR模型后,各组小鼠视网膜中新生血管面积统计结果,包括空白组(control)、Aflibercept(阳性对照)组、siRNA+Invivofectamine组、TDN组、TDN-siRNA组;
图14为OIR模型中各给药组小鼠视网膜新生血管生成情况及无血管区恢复情况;
图15为TDN-siRNA-3连接示意图。
具体实施方式
以下通过对本发明较佳实施方式的描述,详细说明但不限制本发明。
材料来源:如非特别说明,本发明所使用的材料均为市售购买。
HEK-293购自上海景泽生物技术有限公司;
HREC细胞购自angiopromie公司;
HUVEC细胞购自澳赛尔斯生物;
LipoRNAiMAX购自赛默飞;
Invivofectamine试剂购买自赛默飞;
阿柏西普注射液(Aflibercept):购自拜耳医药保健有限公司,规格为40mg/ml/瓶;
C57/BL小鼠购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司
实施例1siRNA筛选及其基因沉默
(1)siRNA合成
根据RUNX1 mRNA设计并委托金斯瑞合成公司合成了6种siRNA,序列如下表1所示:
(2)细胞转染
1)将HUVEC细胞从液氮罐中取出复苏,经培养稳定传代2-4代后用于转染实验。
2)转染前一天,在6孔板中每个孔内接种3.0x10^5个细胞,每孔加入2.5mL不含抗生素的生长培养基,保证转染时会有50-60%的融合率。
3)从细胞中去除生长培养基。每孔加入1.5mL新鲜的无血清的生长培养基,用培养基稀释各候选siRNA+Lipofectamine RNAiMAX的复合物加入到各待测细胞组中,使其siRNA浓度为15nmol/L。在37℃的二氧化碳培养箱中培养细胞5-6小时后更换含有血清的培养基并培养细胞48小时后检测基因沉默效果。
其中,siRNA和Lipofectamine RNAiMAX混合物可如下方法准备:在250μl的无血清生长培养基中加入候选siRNA,柔和混匀。然后在250μl生长培养基中加入5μlLipofectamine RNAiMAX进行稀释,室温下孵育5分钟。Lipofectamine RNAiMAX使用前要先混匀,混合稀释好的siRNA和Lipofectamine RNAiMAX,室温下孵育20分钟。
(3)检测
上述各组细胞接受处理后按照总RNA提取试剂盒步骤过柱提取,提取后测定RNA浓度并用琼脂糖凝胶电泳验证纯度后,每组取等量RNA参照逆转录试剂盒步骤,进行逆转录合成为cDNA,-80℃保存。以cDNA为模板进行PCR扩增,使用琼脂糖凝胶电泳检测各组PCR产物。同时,使用q-PCR染料试剂盒,严格按照步骤,以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。采用试剂盒中标准三步法进行Real Time-PCR扩增。得到Ct值,以GAPDH为内参,使用相对定量法,计算2-△△Ct值。
(4)实验结果
基于琼脂糖凝胶电泳的检测,siRNA-1与siRNA-5与对照组无显著差异,基因沉默效果不佳(未呈现),而如图1所示,siRNA-2/siRNA-3/siRNA-4/siRNA-6相较于对照组展现出一定程度的基因沉默效果,其中siRNA-3/siRNA-4/siRNA-6的基因沉默效果更好,因而选siRNA-3、siRNA-4、siRNA-6进行Real Time-PCR检测。
如图2所示,与空白对照组相比,siRNA-3、siRNA-4和siRNA-6均表现出一定的基因沉默效果,其中siRNA-3效果最佳,因此选择siRNA-3进行后续实验。
实施例2TDN-siRNA复合物
(1)TDNs的合成
将四条单链(S1,S2,S3,S4)按照等摩尔比(每条单链加入1μl浓度为100μM的储存液)加入到含有96μl的TM buffer(10mM Tris-HCl,50mM MgCl2,pH 8.0)的200μl EP管中,将反应液加热到95℃维持10min,然后快速降温到4℃维持20min合成了TDNs。
4条单链的序列(5′→3′)如下:
S1:ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA(SEQ ID NO.7);
S2:ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG(SEQ ID NO.8);
S3:ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC(SEQ ID NO.9);
S4:ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG(SEQ ID NO.10);
其中S1的5’端可选地连接一个Cy5荧光标记基团用于TDNs的示踪。
(2)TDNs-siRNA复合物的合成
在实施例1的基础上,将S1序列替换为S1-siRNA-3,其中S1通过连接序列-TTTTT-与siRNA-3的正义链以化学键连接,将S1-siRNA-3、S2、S3、S4按照等摩尔比(每条单链加入1μl浓度为100μM的储存液)加入到含有95μl的TM buffer(10mM Tris-HCl,50mM MgCl2,pH8.0)的200μl EP管中,将反应液加热到95℃维持10min,然后快速降温到4℃维持20min合成了TDN-siRNA-3(TDN-siRNA),其连接方式如示意图(图15)所示。
实施例3 TDN-siRNA的表征
(1)鉴定方法
使用毛细管电泳、PAGE电泳检测合成得到的TDN-siRNA;使用透射电镜检测TDNs与TDN-siRNA的外形;使用动态光散射检测TDNs与TDNs-SiRNA的zeta电位及粒径。
(2)结果
如图3-4所示,电泳结果指示TDN-siRNA的条带分子量符合TDN与siRNA的复合情况,表示siRNA已成功连接至TDN。
如图5所示,透射电镜图中可观测到TDNs以及TDN-siRNA的四面体结构颗粒。
如图6所示,TDNs颗粒和TDN-siRNA颗粒的粒径约为15-20nm,其中前者的zeta电位为-6.41mV,后者的zeta电位为-21.9mV。
实施例4细胞实验
(1)荧光标记细胞摄取实验
细胞:人胚胎肾细胞293(HEK-293)、人视网膜内皮细胞(HREC细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验细胞
实验分组:空白组、siRNA(Cy5标记)组、siRNA(Cy5标记)+Lipo RNAiMAX(转染试剂)组、TDN(Cy5标记)组、TDN-siRNA(Cy5标记)组。
实验方法:
1)在转染实验的前一天,在每个孔的2ml生长培养基中加入3x10^5个细胞(确保转染时细胞密度在60-80%)。
2)使用DMEM培养基稀释各组样品至终体积250μl。
3)将待测样品添加到细胞中:每孔加样250ul,其最终样品浓度为15nmol/L。
4)37℃静置培养细胞24h(小时),之后收样使用流式细胞仪检测入胞情况。
其中转染试剂的使用方法为:给细胞换液,加3%血清的培养基1.7mL。然后用147μl的无血清培养基加3μl siRNA混匀,141μl的无血清培养基加9μl转染试剂混匀,把两管液体混合,孵育5min,滴加至细胞中
实验结果:
如图7所示,各细胞的入胞结果类似,空白组未检测到明显荧光信号(未呈现),siRNA加转染试剂处理组的样本检测到明显的阳性荧光信号,入胞效率为90.0%左右,siRNA无转染试剂处理组的样本则仅检测到微弱的荧光信号,入胞效率不超过2%,说明siRNA自身的入胞能力不佳,在转染试剂的辅助下才能够有效入胞。TDN组与TDN-siRNA处理组均检测到较强的阳性荧光信号,说明在不添加转染试剂的情况下TDN的携载能够实现siRNA的高效入胞。
(2)RUNX1基因沉默实验
细胞:人胚胎肾细胞293(HEK-293)、人视网膜内皮细胞(HREC细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验细胞
实验分组:空白组、siRNA组、siRNA+Lipo(转染试剂)组、5nmol/L TDN组、10nmol/LTDN组、15nmol/L TDN组、5nmol/L TDN-siRNA组、10nmol/L TDN-siRNA组和15nmol/L TDN-siRNA组
实验方法:
1)在转染实验的前一天,在每个孔的2ml生长培养基中加入3×10^5个细胞(确保转染时细胞密度在60-80%)。
2)使用DMEM培养基稀释各组样品至终体积250μl。
3)将待测样品添加到细胞中:每孔加样250μl,其中siRNA组、siRNA+Lipo(转染试剂)组中siRNA的终浓度均为15nmol/L,其余给药组按照实验分组的浓度梯度为终浓度。
4)37℃静置培养细胞24h,之后收样进行qPCR实验检测基因沉默效果。
实验结果:
如图8所示,各细胞中基因沉默的作用趋势大致相同,其中不添加转染试剂处理的siRNA组与空白对照相比,并未展现出明显的差异性效果,而siRNA+Lipo组与空白组相比展现出一定的基因沉默作用。而TDN-siRNA组随浓度增大展现出明显的基因沉默作用,在相同浓度下与siRNA+Lipo组相当甚至更优,尤其是在HREC细胞中,其TDN-siRNA组在相同浓度下展现明显优于siRNA+Lipo组的基因沉默效果。
(3)RUNX1蛋白表达抑制实验
细胞:人胚胎肾细胞293(HEK-293)、人视网膜内皮细胞(HREC细胞)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实验细胞
实验分组:空白组、siRNA组、siRNA+Lipo(转染试剂)组、TDN组、TDN-siRNA组
实验方法:
1)在转染实验的前一天,在每个孔的2ml生长培养基中加入3×10^5个细胞(确保转染时细胞密度在60-80%)。
2)使用0%FBS的培养基换液后,将各组样品添加到细胞中,六孔为一组,控制其终浓度为15nmol/L。
3)37℃静置培养细胞24h后收样,提取蛋白,检测蛋白浓度后进行WB实验,检测其RUNX1的蛋白表达量。
实验结果:
如图9所示,蛋白定量结果与前述基因沉默效果基本一致,TDN-siRNA组展现出与siRNA+Lipo组相当甚至更低的RUNX1的表达量,尤其是在HREC细胞中,其TDN-siRNA组在相同浓度下展现明显优于siRNA+Lipo组的RUNX1表达抑制水平,见图10。
实施例5体内外模型实验
(1)鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)新生血管抑制实验
实验分组:空白组、Aflibercept(阳性对照)组(1nmol/L)、siRNA组(1nmol/L)、siRNA(1nmol/L)+Invivofectamine(转染试剂)、TDN组(1nmol/L)、TDN-siRNA组(1nmol/L)
实验方法:
用1:1000新洁尔灭液擦拭鸡蛋,将购买的SPF种鸡蛋表面清洁,拭干后用照蛋器检查种蛋是否完好,用铅笔标记实验名称,之后将鸡蛋放入孵化箱中孵化,条件设定为37.0±0.5℃,相对湿度60%,仪器设定每两个小时转蛋一次,继续孵育4-5天。
等鸡蛋孵育5-6d(天)的时候,将实验用的鸡胚随机分为6组,每组5只。在照蛋器下用马克笔标记气室,画出开窗位置,用75%酒精消毒后,用注射器针头轻轻将蛋壳钻出一个小孔,之后用眼科镊在蛋壳上慢慢撕出一个直径约1cm窗口(用砂轮,然后用眼科镊轻轻揭掉蛋膜,暴露鸡胚绒毛尿囊膜,注意不要损伤血管。)滴加待测样品药液于绒毛尿囊膜上,后用透明封口膜封闭窗口,孵育48h后,用酒精消毒接种部位及四周,撕去封闭处卵壳,滴入10%福尔马林液固定10min,待CAM上的血管凝固后,剥离假气室周围的蛋壳,使CAM充分暴露,用眼科剪取3cm×3cm的CAM,脱水后用石蜡包埋,平行于CAM方向,连续切片,厚度8μm,0.5%甲苯胺蓝染色。取标本于250倍视野下计数微血管的横截面,分别随机6个不重复的高倍视野,取其平均值(四舍五入)作为该标本的单位面积下的MVD(微血管密度),并计算器血管生成抑制率,计算方法如下:
血管生成抑制率=(空白组MVD值-实验组MVD值)/空白组MVD值*100%
表2实验结果:
如图11所示,阿柏西普(Aflibercept)阳性对照组展现出明显的新生血管抑制作用,而siRNA+Invivofectamine组展现出优于siRNA组的新生血管抑制活性,指示siRNA在转染试剂的作用下能够有效进入细胞并通过对RUNX1的沉默表达作用产生一定的新生血管抑制效果。令人惊讶的是,单独的TDN展现出几乎与阳性对照组相当的新生血管抑制活性,其具体作用原理还有待进一步探究。同时,TDN-siRNA组展现出极其优异的新生血管抑制活性,不仅显著优于阳性对照组,也优于siRNA+Invivofectamine组和TDN组。
(2)氧诱导的血管增殖性视网膜病变(OIR)小鼠模型
造模过程:
将出生后第7天(P7)的C57/BL小鼠与母鼠放入含氧体积分数为75%±3%的饲养箱内连续饲养5天,饲养温度维持在(25±2)℃,每天照明12h,用自动氧气分析仪监控箱内氧气含量。出生后第12天(P12)放回正常空气中饲养,这时小鼠视网膜处于相对缺氧状态,出生后第17天(P17)视网膜内有大量新生血管形成。
1)小鼠视网膜RUNX1蛋白表达量检测
实验分组及给药方式:
于P12出氧箱时进行玻璃体腔注射,各分组如下:
空白组:不进行玻璃体腔给药
siRNA组:双眼玻璃体腔注射1μL的75μmol/L的siRNA
siRNA+Invivofectamine组:双眼玻璃体腔注射1μL siRNA-Invivofectamine复合物,其中siRNA的浓度为75μmol/L。
TDN组:双眼玻璃体腔注射1μL 75μmol/L TDN
TDN-siRNA组:双眼玻璃体腔注射1μL 75μmol/L TDN-siRNA复合物
实验方法:
给药两天后,取各组小鼠3只,麻醉处死后取出双眼眼球共6只放入250μL细胞裂解液中,超声粉碎,低温超速离心30min,收集上清液,置于低温冰箱中保存。采用ELISA试剂盒检测视网膜蛋白提取液中RUNX1表达。
实验结果:
如图12所示,siRNA-Invivofectamine组相较于空白组展现出明显的RUNX1表达抑制作用,而TDN-siRNA组展现出更优于siRNA-Invivofectamine组的RUNX1蛋白表达抑制效果,说明采用TDN载体携载siRNA能够有效促进其入胞并沉默RUNX1基因表达进而降低其蛋白表达量。
2)小鼠视网膜新生血管生成抑制实验
实验分组及给药方式:
于P12出氧箱时进行玻璃体腔注射,各分组如下:
空白组(negative CTRL):不进行玻璃体腔给药
Aflibercept(阳性对照)组:双眼玻璃体注射1μL 40mg/mL的阿柏西普;
siRNA+Invivofectamine组:双眼玻璃体腔注射1μL siRNA-Invivofectamine复合物,其中siRNA的浓度为75μmol/L;
TDN组:双眼玻璃体腔注射1μL 75μmol/L TDN;
TDN-siRNA组:双眼玻璃体腔注射1μL 75μmol/L TDN-siRNA复合物;
实验方法:
于P17,取各组小鼠3只,麻醉处死后取出双眼眼球共6只,在10%的甲醛中室温固定半小时。显微镜下去除角膜、虹膜和晶体,小心完整地剥离视网膜,从视网膜锯齿缘到4个象限的赤道部做放射状切开,视网膜平铺在玻片上,水溶性封片剂封口,加盖玻片。用荧光显微镜检测平铺的视网膜,Image-Pro Plus(Media Cybernetics,美国)软件测量视网膜新生血管的面积。
实验结果:
如图13-14所示,空白组图片显示经过OIR造模的小鼠,其视网膜在P17产生了明显的病变,视网膜在后极部形成无血管区(小圈内),以及新生血管区(小圈和大圈之间)。Aflibercept(阳性对照)组给药之后能够在一定程度上抑制新生血管的生成,并促进无血管区的血管正常化。此外,TDN组展现出与Aflibercept(阳性对照)组接近的新生血管生成抑制效果。值得注意的是,TDN-siRNA组展现出明显优于阳性对照组的新生血管抑制作用,并能够明显促进无血管区的正常化,展现出对病变视网膜优异的修复作用。
本发明不限于以上实施方式,本领域技术人员可以根据说明书的描述对本发明做出各种改变或变形,只要不脱离本发明的精神,均属于本发明的范围。
序列列表:
SEQ ID NO.1
GGCAGAAACUAGAUGAUCAGA
SEQ ID NO.2
UGAUCAUCUAGUUUCUGCCGA
SEQ ID NO.3
CAGAGUCAGAUGCAGGAUACA
SEQ ID NO.4
UAUCCUGCAUCUGACUCUGAG
SEQ ID NO.5
AGUUUCUGCCGAUGUCUUCGA
SEQ ID NO.6
GAAGACAUGGCAGAAACUAG
SEQ ID NO.7
ATTTATCACCCGCCATAGTAGACGTATCACCAGGCAGTTGAGACGAACATTCCTAAGTCTGAA
SEQ ID NO.8
ACATGCGAGGGTCCAATACCGACGATTACAGCTTGCTACACGATTCAGACTTAGGAATGTTCG
SEQ ID NO.9
ACTACTATGGCGGGTGATAAAACGTGTAGCAAGCTGTAATCGACGGGAAGAGCATGCCCATCC
SEQ ID NO.10
ACGGTATTGGACCCTCGCATGACTCAACTGCCTGGTGATACGAGGATGGGCATGCTCTTCCCG
Claims (12)
1.一种小干扰RNA,所述小干扰RNA特异性靶向Runt相关转录因子1基因及其同型mRNA,通过沉默其互补基因的表达,下调RUNX1表达量,所述的小干扰RNA选自:
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸组成的反义链;
(b)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸组成的反义链;和
(c)如SEQ ID NO.5所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸组成的反义链。
2.一种药物组合物,含有治疗有效量的权利要求1所述的小干扰RNA。
3.权利要求1所述的小干扰RNA或权利要求2所述的药物组合物在制备预防和/或治疗新生血管性眼科疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其中所述的新生血管性眼科疾病选自糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、年龄相关性黄斑变性、高度近视黄斑出血或中心性渗出性视网膜脉络膜病变。
5.一种用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物,所述DNA四面体药物复合物包括:
(1)小干扰RNA,所述小干扰RNA特异性靶向Runt相关转录因子1基因及其同型mRNA,通过沉默其互补基因的表达,下调RUNX1表达量,所述的小干扰RNA选自:
(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸组成的反义链;
(b)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.4所示的核苷酸组成的反义链;和
(c)如SEQ ID NO.5所示的核苷酸组成的有义链和如SEQ ID NO.6所示的核苷酸组成的反义链;以及
(2)一DNA四面体,所述DNA四面体由四条单链DNA经碱基互补配对形成;所述四条单链DNA的核苷酸序列分别一对一地选自如SEQ ID NO.7~10的所示序列;
其中所述小干扰RNA与DNA四面体的至少一条单链连接。
6.根据权利要求5所述的DNA四面体药物复合物,其中将所述小干扰RNA的有义链通过化学键与所述DNA四面体的至少一条单链连接。
7.根据权利要求6所述的DNA四面体药物复合物,其中在所述小干扰RNA的有义链与所述DNA四面体的至少一条单链之间还包含一接头。
8.根据权利要求7所述的DNA四面体药物复合物,其中所述接头为连接序列-TTTTT-。
9.根据权利要求5~8任一项所述的DNA四面体药物复合物,其中将形成所述DNA四面体的四条单链DNA以等摩尔比置于足以使其变性的温度下使其变性,然后将温度降低至使其退火进而通过链间碱基互补配对形成DNA四面体结构;将所述四条单链DNA的至少一条连接所述小干扰RNA。
10.一种药物组合物,含有权利要求5所述的用于治疗新生血管性视网膜疾病的DNA四面体药物复合物。
11.权利要求5所述的DNA四面体药物复合物或权利要求10所述的药物组合物在制备预防和/或治疗新生血管性视网膜疾病药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其中所述的新生血管性视网膜疾病选自糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜静脉周围炎、年龄相关性黄斑变性、高度近视黄斑出血或中心性渗出性视网膜脉络膜病变。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211066294.9A CN115896107A (zh) | 2022-09-01 | 2022-09-01 | 一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰rna及其dna四面体复合物 |
PCT/CN2022/121379 WO2024045251A1 (zh) | 2022-09-01 | 2022-09-26 | 一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰rna及其dna四面体复合物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211066294.9A CN115896107A (zh) | 2022-09-01 | 2022-09-01 | 一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰rna及其dna四面体复合物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115896107A true CN115896107A (zh) | 2023-04-04 |
Family
ID=86481347
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211066294.9A Pending CN115896107A (zh) | 2022-09-01 | 2022-09-01 | 一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰rna及其dna四面体复合物 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115896107A (zh) |
WO (1) | WO2024045251A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117448333A (zh) * | 2023-10-30 | 2024-01-26 | 中山大学中山眼科中心 | 一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物及其应用 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117866622B (zh) * | 2024-03-11 | 2024-05-28 | 东南大学 | 一种基于多价空间模式识别的dna四面体荧光探针及应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3541408A4 (en) * | 2016-11-15 | 2020-06-24 | The Schepens Eye Research Institute, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF ABERRANT ANGIOGENESIS |
CN113286811A (zh) * | 2018-07-30 | 2021-08-20 | 南加利福尼亚大学 | 改善过继性细胞疗法的效力和安全性 |
CN114404608B (zh) * | 2022-03-01 | 2023-02-03 | 四川大学 | 一种嵌入式搭载siRNA的四面体框架核酸及其用途 |
-
2022
- 2022-09-01 CN CN202211066294.9A patent/CN115896107A/zh active Pending
- 2022-09-26 WO PCT/CN2022/121379 patent/WO2024045251A1/zh unknown
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117448333A (zh) * | 2023-10-30 | 2024-01-26 | 中山大学中山眼科中心 | 一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物及其应用 |
CN117448333B (zh) * | 2023-10-30 | 2024-05-10 | 中山大学中山眼科中心 | 一种靶向DOCK6的siRNA与四面体框架核酸复合物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2024045251A1 (zh) | 2024-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN115896107A (zh) | 一种治疗新生血管性视网膜疾病的小干扰rna及其dna四面体复合物 | |
CN112007044B (zh) | 一种预防视网膜神经节细胞氧化应激和湿性黄斑病变的药物 | |
Zhang et al. | MiR-146a promotes oligodendrocyte progenitor cell differentiation and enhances remyelination in a model of experimental autoimmune encephalomyelitis | |
IL194419A (en) | Dsrna to inhibit the expression of a 5eg gene in a human cell, a pharmaceutical compound containing it, a vector method | |
CN112662674B (zh) | 靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用 | |
Yang et al. | MiR-126 overexpression inhibits high glucose-induced migration and tube formation of rhesus macaque choroid-retinal endothelial cells by obstructing VEGFA and PIK3R2 | |
KR20100017422A (ko) | 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용하여 기억 형성에 관여하는 유전자를 확인하는 방법 | |
WO2017062659A1 (en) | Compositions and methods for treating diabetic retinopathy | |
WO2019048645A1 (en) | STABILIZED COMPOSITIONS OF SMALL ACTIVATOR RNA (PARNA) FROM CEBPA AND METHODS OF USE | |
CN110251529A (zh) | miR-124-3p与其类似物在制备抗乳腺癌疾病药物中的应用 | |
CN111172290B (zh) | 肝细胞癌诊断和治疗的miRNA | |
TW200916117A (en) | RNAi-related inhibition of TNF α signaling pathway for treatment of ocular angiogenesis | |
CN109055561A (zh) | lncRNA-AP003774.1在诊断和/或治疗乳腺癌症中的应用 | |
CN110106248B (zh) | 环状RNA hsa_circ_0001543在制备视网膜变性疾病诊断试剂中的应用 | |
US20140323549A1 (en) | Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system | |
CN107913284A (zh) | miRNA302‑367簇的微小RNA在靶向抑制血管新生和肿瘤生长的应用 | |
JP7394815B2 (ja) | NRARP遺伝子の発現を阻害するためのsiRNA、並びにそのための方法及び組成物におけるそれらの使用 | |
KR20190037166A (ko) | 결합 조직 성장 인자를 표적으로 하는 rna 복합체를 함유하는 노인성 황반변성의 예방 또는 치료용 약학 조성물 | |
CN115992138A (zh) | 用于治疗与pcsk9相关疾病的靶向寡核苷酸 | |
CN116459270B (zh) | 一种药物组合物及其在制备防治眼部新生血管性疾病药物中的应用 | |
CN115969988A (zh) | 一种治疗新生血管性视网膜疾病的dna四面体药物复合物及其制备方法和用途 | |
CN103361347B (zh) | 针对血管生成素2的微小rna | |
CN111349704B (zh) | 肝癌的诊断产品和治疗组合物 | |
CN102727513B (zh) | 靶向于组织因子基因的小核酸及其用途 | |
EP4289953A1 (en) | Double-stranded nucleic acid molecule for treating proliferative vitreoretinopathy and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |