CN117866622B - 一种基于多价空间模式识别的dna四面体荧光探针及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针及应用；所述荧光探针呈四面体结构，所述荧光探针包括5条DNA单链、3条DNA长链以及与DNA长链互补的3条DNA短链；三条所述DNA长链包括3’端修饰的CY5染料，三条所述DNA短链包括3’端修饰的BHQ2染料。本发明的DNA四面体荧光探针通过多价识别环状RNA分子和空间结构匹配，增强环状RNA检测的特异性和灵敏度，适用于环状RNA成像和检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针及应用。
背景技术
环状RNA是一种新型的内源性非编码RNA，具有共价闭合的环状结构。最近的研究表明，环状RNA在肿瘤、心血管疾病和神经系统疾病等多种疾病的发生和发展密切相关。因此，发展环状RNA的检测和成像方法对于相关疾病的早期诊断具有重要意义。然而，环状RNA分子具有二级结构和空间的几何结构复杂，干扰RNA分子种类繁多等特点，导致其在活细胞复杂体系中实现特异性检测和成像仍然是一个巨大的挑战。
目前，环状RNA最广泛的检测方法是qPCR。qPCR虽然灵敏度较好，但其同时也伴随着耗时长、操作繁琐、成本较高等问题。此外，常用的成像手段荧光原位杂交(FISH)技术则具有灵敏度低，需要固定细胞等缺点。
在生命体系中，生物分子可以通过空间几何结构匹配的变构效应和多重识别位点的多价效应来大大增强生物分子之间的相互作用。DNA纳米技术由于具有序列编程可设计、空间结构精确可调控、生物识别与刺激响应性质和生物相容性等优良特性，是构建分子探针的优良工具。其中框架核酸四面体纳米结构具有易于合成、结构可控、易于被细胞内化等优点。
为此，我们提出一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针及应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针及应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针，所述荧光探针呈四面体结构，所述荧光探针包括5条DNA单链、3条DNA长链以及与DNA长链互补的3条DNA短链；三条所述DNA长链包括3’ 端修饰的CY5染料，三条所述DNA短链包括3’端修饰的BHQ2染料。
优选地，5条所述DNA单链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-5所示，A37-1的序列如SEQIDNO.1所示，B37-1的序列如SEQIDNO.2所示，C37-1的序列如SEQIDNO.3所示，D37-1的序列如SEQIDNO.4所示，D37-2的序列如SEQIDNO.5所示。
优选地，3条所述DNA长链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.6-8所示，A37-2的序列如SEQIDNO.6所示，B37-2的序列如SEQIDNO.7所示，C37-2的序列如SEQIDNO.8所示，
优选地，3条所述DNA短链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9-11所示，Q1的序列如SEQIDNO.9所示，Q2的序列如SEQIDNO.10所示，Q3的序列如SEQIDNO.11所示；其中DNA短链Q1与DNA长链A37-2互补，DNA短链Q2与DNA长链B37-2互补，DNA短链Q3与DNA长链C37-2互补。
优选地，5条所述DNA单链的长度为58nt；3条所述DNA长链的长度为77nt；3条所述DNA短链的长度为12nt。
上述所述的一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针在环状RNA成像和非诊断目的检测中的应用。
优选地，所述应用具体包括：体外培养细胞中环状RNA的动态实时监测；小鼠脑切片环状RNA的灵敏快速原位成像；人血浆样本未经扩增RNA中环状RNA的超快速检测。
本发明的有益效果：
1、DNA四面体结构具有生物相容性；从而解决了现有技术中存在的探针毒性等问题，大大提高了活体细胞成像的可能性，具有无毒、易制备等优势。
2、本发明提供的DNA四面体荧光探针能够被细胞主动摄取，并在细胞内稳定存在48h以上，目标物不存在时几乎不会有荧光泄漏，极大增加荧光浓度，提高分辨率。
3、本发明提供的DNA四面体荧光探针具有极大的可编程性，能够在不同的顶点延长链上修饰不同类型、不同个数的荧光染料基团；操作简单、快速，成本低。
4、本发明提供的DNA四面体荧光探针的空间几何结构与环状SCMH1 RNA匹配，并且具有多重识别环状SCMH1 RNA的位点，能够增强探针和环状SCMH1 RNA之间的相互作用，显著提升传感性能和细胞成像效果。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提出的DNA四面体荧光探针的立体结构图；
图2为本发明提出的DNA四面体荧光探针的平面图；
图3为本发明的利用四面体荧光探针基于空间识别模式识别SCHM1 RNA的方法原理示意图；
图4为本发明的琼脂糖凝胶电泳跑胶图像，证明了探针的成功制备；
图5为本发明的通过检测环状RNA的荧光图验证四面体荧光探针多价识别策略；
图6为本发明的检测0-500nM SCHM1 RNA的探针荧光强度，证明探针具有良好的检测灵敏度；
图7为本发明的检测0-20nM SCHM1 RNA的探针荧光强度，证明探针具有良好的检测灵敏度；
图8为本发明的通过检测不同RNA证明四面体荧光探针具有良好的选择性；
图9为本发明的对体外培养细胞中环状RNA的动态实时监测；
图10为本发明的对小鼠脑切片环状RNA的灵敏快速原位成像；
图11为本发明的对人血浆样本未经扩增RNA中环状RNA的超快速检测。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
基于多价空间识别模式的DNA四面体荧光探针的设计和制备
1、DNA四面体荧光探针的设计
所述荧光探针呈四面体结构，所述荧光探针包括5条DNA单链、3条DNA长链以及与DNA长链互补的3条DNA短链；3条所述DNA长链包括3’ 端修饰的CY5染料，3条所述DNA短链包括3’端修饰的BHQ2染料。
四面体荧光探针主体结构中的5条DNA单链的长度为58nt；3条DNA长链的长度为77nt；3条DNA短链的长度为12nt。
2、四面体探针的制备
(1) 材料及制备
PB buffer (10mM PB,50mM MgCl2,pH 7.0)等试剂由自己实验室配置。所有试剂使用超纯水配置。DNA oligo由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并由HPLC纯化，序列如SEQID NO. 1-11所示。其中5条所述DNA单链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-5所示，A37-1的序列如SEQIDNO.1所示，B37-1的序列如SEQIDNO.2所示，C37-1的序列如SEQIDNO.3所示，D37-1的序列如SEQIDNO.4所示，D37-2的序列如SEQIDNO.5所示；3条所述DNA长链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.6-8所示，A37-2的序列如SEQIDNO.6所示，B37-2的序列如SEQIDNO.7所示，C37-2的序列如SEQIDNO.8所示；3条所述DNA短链的核苷酸序列分别如SEQIDNO.9-11所示，Q1的序列如SEQIDNO.9所示，Q2的序列如SEQIDNO.10所示，Q3的序列如SEQIDNO.11所示；其中DNA短链Q1与DNA长链A37-2互补，DNA短链Q2与DNA长链B37-2互补，DNA短链Q3与DNA长链C37-2互补。
本实施例采用的设备包括:冷冻离心机(eppendorf),凝胶显影仪(Tanon，1600)，涡旋震荡仪(DLAB)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪(Tanon，EPS 300)，PCR仪(Eppendorf,Mastercycler nexus GX2),分析天平 (sartorius,BSA224S)，摇床(IKA KS 260 basic)，荧光共聚焦显微镜(OLYMPUS)；
(2) DNA四面体探针的制备及表征
先将单链DNA溶解，将形成四面体纳米结构的十一条单链等比例混合在PB buffer中，配成终浓度为1uM的四面体纳米结构。然后将配好的样品放入PCR仪中95°C持续5min后1min迅速降温至4°C，并在4°C中稳定10min，得到四面体DNA纳米结构。采用琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel)初步表征得到的DNA四面体结构的产率、大小等。如图4，琼脂糖凝胶电泳结果显示，DNA四面体合成成功，其产率在90%以上。
实施例2
四面体荧光探针的性能测试
在本实施例中，所用的RNA序列为如SEQID NO.12-14所示的核苷酸序列。
本实施例将合成的四面体探针进行体外检测环状RNA,包括以下步骤：
S1、根据实施例一的制备方法合成1uM四面体探针；
S2、在25℃条件下将环状SCMH1 RNA和四面体探针孵育；
S3、测量荧光。如图5所示，通过测量荧光验证了四面体探针多价识别策略的可行性。
改变环状RNA的浓度，验证该探针的灵敏度。如图6、图7所示，本发明的四面体探针具有良好的灵敏度，灵敏度：0.01-20 nM。
通过与50nM不同的RNA混合检测，验证四面体探针选择性。如图8所示，显示本发明的四面体探针具有良好的选择性。
实施例3
细胞培养和环状RNA的动态实时监测
（1）HT-22细胞的培养步骤如下：将冻存的HT-22细胞在37℃下水浴1至2分钟，待完全溶解后离心，去上清；用新鲜的含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基重悬细胞，用无菌吸管吸取并打入新制的10ml含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，顺时针摇匀；放入培养箱中，培养箱保持37℃和5%二氧化碳；一至两天长满后传代。
（2）HT-22的传代步骤如下：将培养好的细胞弃去上清，用无菌PBS清洗残液，加入1ml胰酶37℃消化1min，加入等体积含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基终止消化，将细胞吸入离心管中；在1000r下离心5min，去上清；用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基重悬，分配至两个含有新鲜培养基的培养瓶中，轻轻摇匀后放入培养箱。
（3）利用探针对细胞进行动态成像:
将上述细胞进行消化移入离心管中，在1000r下离心5min，去上清；用含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基重悬，移入培养皿中培养；培养基提前加入实施例1制备的DNA四面体荧光探针，轻轻摇匀后放入37℃和5%二氧化碳的培养箱中孵育3-12小时；用活细胞工作站进行成像分析。如图9所示，本发明具有良好的circSCMH1 RNA活细胞成像的能力。
实施例4
小鼠脑切片环状RNA的灵敏快速原位成像
制备小鼠脑冰冻切片，具体步骤如下：将小鼠在含有3%异氟烷、30%氧气和70%二氧化碳的封闭麻醉室内进行麻醉；剪开小鼠胸腔，将连通恒流泵的针头插入小鼠左心室，剖开右心耳排液；先用250mL0.01mol/L PBS灌流，再用40mL4%PFA固定脑组织；取出鼠脑，放置于4%PFA溶液中4℃过夜；转移至30%的蔗糖溶液中，4℃沉降；待脑组织完全沉降后，置于-20℃冰冻切片机平衡2hr；用OCT包埋液包埋脑组织，再次平衡30min；保持-20℃进行切片，切片厚度为30 μm/片。
（2）将实施例1制备的DNA四面体荧光探针和细胞冰冻切片共同孵育12小时后，用激光共聚焦显微镜进行成像分析。分析结果如图10所示，本发明具有良好的circSCMH1 RNA活细胞成像的能力。
实施例5
人血浆样本未经扩增RNA中环状RNA的超快速检测
采集30例健康对照和30名AIS患者的血液并分离血浆，提取总RNA；将RNA样品与实施例1制备的DNA四面体荧光探针共同孵育，并使用荧光检测器测量结果。检测结果如图11所示，通过图11中的数据能够看出在没有核酸扩增的情况下，依然能够通过探针地定量血浆样本中的circSCMH1的拷贝数，表明本发明具有良好人血浆样本未经扩增RNA中环状RNA的超快速检测能力。
表一：DNA四面体荧光探针中5条DNA单链、3条DNA长链、3条DNA短链以及实施例2中3条RNA的序列结构。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (4)
1.一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针，其特征在于，所述荧光探针呈四面体结构，所述荧光探针包括5条DNA单链、3条DNA长链以及与DNA长链互补的3条DNA短链；5条所述DNA单链分别由A37-1、B37-1、C37-1、D37-1、D37-2表示，3条所述DNA长链分别由A37-2、B37-2、C37-2表示，3条所述DNA短链分别由Q1、Q2、Q3表示；三条所述DNA长链包括3’端修饰的CY5染料，三条所述DNA短链包括3’端修饰的BHQ2染料；
所述A37-1的序列为：CCCTGTACTGGCTAGGAATTCACGTTTTAATCTGGGCTTTGGGTTAAGAAACTCCCCG；
所述B37-1的序列为：CGGTGATGCGCCTCCAGCGCGGGGAGTTTCTTAACCCTTTCCGACTTACAAGAGCCGG；
所述C37-1的序列为：CCCATGAGAATAATACCGCCGATTTACGTCAGTCCGGTTTCCCACACGGGACGGCAGGC；
所述D37-1的序列为：GCCCAGATTAAAACGTGAATTCCTAGCCAGTACAGGGTTTCCGGACTGACGTAAATCGG；
所述D37-2的序列为：
CGGTATTATTCTCATGGGTTTGGCACCACCTGAGTCTCGCCCGGCTCTTGTAAGTCGG；
所述A37-2的序列为：CGCTGGAGGCGCATCACCGTTTGCGTATGTGTTCTGTGCGGCCTGCCGTCCCGTGTGGGTAGGTGTGTAGGACTTTGGTGCCAG；
所述B37-2的序列为：GCGAGACTCAGGTGGTGCCTTTGGCATTCGACCAGGAGATATCGCGTTCAGCTATGCCCTTCAGCCGAAATCCTAGAGGGGGCT；
所述C37-2的序列为：CGCACAGAACACATACGCTTTGGGCATAGCTGAACGCGATATCTCCTGGTCGAATGCCTTGATGGTGGCTCCTTGTGGAAAAT；
所述Q1的序列为：CTGGCACCAAAG；所述Q2的序列为：AGCCCCCTCTTA；所述Q3的序列为：ATTTTCCACAAG；其中DNA短链Q1与DNA长链A37-2互补，DNA短链Q2与DNA长链B37-2互补，DNA短链Q3与DNA长链C37-2互补。
2.根据权利要求1所述的DNA四面体荧光探针，其特征在于，5条所述DNA单链的长度为58nt；3条所述DNA长链的长度为77nt；3条所述DNA短链的长度为12nt。
3.如权利要求1-2任一所述的一种基于多价空间模式识别的DNA四面体荧光探针在环状RNA成像和非诊断目的检测中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用具体包括：体外培养细胞中环状RNA的动态实时监测；小鼠脑切片环状RNA的灵敏快速原位成像；人血浆样本未经扩增RNA中环状RNA的超快速检测。
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