CN112877402A - 一种目标物催化诱导自组装dna网状纳米材料的制备与应用 - Google Patents

一种目标物催化诱导自组装dna网状纳米材料的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备与应用。首次提出将回文序列嵌入到发卡探针，进而miRNA诱导催化自组装形成DNA网状纳米材料。细胞内的miRNA‑21或miRNA‑31，触发一对含回文序列的发夹探针HP1/HP2或HP3/HP4的级联杂交反应，从而自组装形成多个信号输出的网状纳米材料。本发明不依赖酶的使用，无需制备复杂的纳米材料，只涉及两条DNA探针，避免了复杂、耗时的DNA链设计过程，也节省了成本。本发明所构建的DNA自组装网状纳米材料能用于活细胞内生物标志物miRNA‑21或miRNA‑31的成像，为疾病的早期诊断和药物研发提供潜在工具。

Description

一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备与应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备方法与应用。
背景技术
目前，已经开发了几种用于miRNA分析的传统技术，包括Northern blot，荧光原位杂交（FISH）和聚合酶链反应（PCR）。然而，这些技术需要在分析之前固定细胞或裂解大量细胞导致操作繁琐、耗时长、灵敏度低，这极大地限制了它们在生物医学中的应用。另外，科学家开发的分子信标（Molecular beacon）因在细胞内环境中很容易被核酸酶（例如DNase）非特异性降解，而产生假阳性信号。为了解决以上问题，我们构建了具有一定粘性DNA网状纳米结构以实现活细胞中靶miRNA的原位成像。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提供一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备方法与应用。一对含回文序列的发夹探针在miRNA 诱导催化自组装形成DNA网状纳米材料，其制备方法简便快捷，成本节约。该DNA网状纳米材料能够用于肿瘤生物标志物成像，实现对细胞内目标miRNA可视、灵敏、特异、稳定的成像，进一步用于临床诊断试剂盒的开发中。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料，包括一对含回文序列的发夹探针DNA和与发夹探针DNA对应的miRNA。
上述一对含回文序列的发夹探针DNA为HP1/HP2，与发夹探针DNA HP1/HP2对应的miRNA为miRNA-21；或者一对含回文序列的发夹探针DNA为HP3/HP4，与发夹探针DNA HP3/HP4对应的miRNA为miRNA-31；
所述 HP1的核苷酸序列为：5’-GATCGCGATCTCAACAT-FAM-CAGTCTGATAAGCTAACATCGTAGCTTATCAGACTG-BHQ-1-3’；其中GATCGCGATC为回文序列；TCAACAT(FAM)CAGTCTGATAAGCTA为miRNA-21识别序列；CAGTCTGATAAGCTA与TAGCTTATCAGACTG序列互补；
所述HP2的核苷酸序列为：5’-AGTTCGAACTT-Cy3-AGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTCAGTCTGATAAGCT-BHQ-2-ACGATGT-3’，其中AGTTCGAACT为回文序列；T-Cy3-AGCTTATCAGACTGATGTTGA与miRNA-21对应的 DNA 序列；T-Cy3-AGCTTATCAGACTGA与TCAGTCTGATAAGCT-BHQ-2-A序列互补；
所述MiRNA-21的核苷酸序列为：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。
所述HP3的核苷酸序列为：5’-GATCGCGATCAGCTAT-FAM-GCCAGCATCTTGCCTACATCGAGGCAAGATGCTGG-BHQ-1-3’；其中GATCGCGATC为回文序列；AGCTAT-FAM-GCCAGCATCTTGCCT为miRNA-31识别序列，CCAGCATCTTGCCT与AGGCAAGATGCTGG序列互补；
所述HP4的核苷酸序列为：5’-AGTTCGAACTAGGCAAGATGCTGGCATAGCTTTTGCCAGCATCTTGCCTCGATGT-3’，其中AGTTCGAACT为回文序列；AGGCAAGATGCTGGCATAGCT与miRNA-31对应的DNA 序列；AGGCAAGATGCTGGC与GCCAGCATCTTGCCT序列互补；
所述MiRNA-31的核苷酸序列为：5’-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU-3’。
一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备方法：先将一对含回文序列的发夹探针DNA（HP1/HP2或 HP3/HP4）分别稀释至10 μM，各自在90 ℃退火，逐渐冷却至25℃形成发夹结构，备用；然后退火后的发夹探针DNA（HP1/HP2或 HP3/HP4）各1 μL 、一定浓度的与发夹探针DNA对应的miRNA（miRNA-21或 miRNA-31）与17 μL tris-buffer混合，在常温下反应2小时。
所述述发夹探针DNA对应的miRNA的浓度为：50 nM。
所述tris-buffer的配方法为：25mM tris-HCl，100 mM NaCl, 50 mM KAc, 10 mMMgAc2 and 1 mM DTT，pH 8.2。
上述一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料用于活细胞内生物标志物miRNA的成像。
一种包含目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的检测试剂。
本发明的优点在于：
（1）本发明DNA网状纳米材料的制备方法简便快捷，只需将原料组分中的三种聚合物在室温混合反应反应2小时，就能获得DNA网状纳米材料。
（2）本发明DNA网状纳米材料的原料包含一对含回文序列的发夹探针HP1和HP2，或者HP3和HP4；本发明首次提出将回文序列嵌入到发卡探针5端，进而miRNA -21或miRNA -31诱导催化自组装形成DNA网状纳米结构。在无任何酶参与下，细胞内的miRNA -21或miRNA-31触发HP1和HP2、或者HP3和HP4的级联杂交反应，从而自组装形成多个信号输出的网状纳米结构。
（3）本发明DNA网状纳米材料的制备一方面不依赖酶的使用，另一方面无需制备复杂的纳米材料，其稳定性也好，与传统的DNA折纸自组装方法不同，该方法中只涉及两条DNA探针，避免了复杂、耗时的DNA链设计过程，也节省了成本；本发明所构建的DNA自组装网状纳米材料能用于活细胞内生物标志物miRNA的成像，为疾病的早期诊断和药物研发提供了一种潜在工具。
附图说明
图1为DNA网状纳米材料制备AFM表征图。
图2为DNA网状纳米材料粘性测试图。图2左侧：为材料粘性原理图；图2右侧左上角小图：在合成的网状纳米材料中加入loading dye，用玻璃棒牵拉；图2右侧大图：不加loading dye的粘性测试。
图3为细胞内miRNA-21成像可行性图。DAPI：用DAPI细胞核染色的细胞荧光图；FAM：未经细胞核染色的细胞荧光图；Merged：细胞核染色与未经细胞核染色的细胞荧光叠加图。
图4为细胞内miRNA-31的可行性图。DAPI：用DAPI细胞核染色的细胞荧光图；FAM：未经细胞核染色的细胞荧光图；Merged ：细胞核染色与未经细胞核染色的细胞荧光叠加图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料，其原料包括：HP1，HP2和miRNA-21三种寡聚物；其中，
HP1的核苷酸序列为：
5’-GATCGCGATCTCAACAT-FAM-CAGTCTGATAAGCTAACATCGTAGCTTATCAGACTG-BHQ-1-3’，其中GATCGCGATC为回文序列；TCAACAT(FAM)CAGTCTGATAAGCTA为miRNA-21识别序列；CAGTCTGATAAGCTA与TAGCTTATCAGACTG序列互补；
HP2的核苷酸序列为：
5’-AGTTCGAACTT-Cy3-AGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTCAGTCTGATAAGCT-BHQ-2-ACGATGT’，其中AGTTCGAACT为回文序列；T-Cy3-AGCTTATCAGACTGATGTTGA与miRNA-21对应的DNA 序列；T-Cy3-AGCTTATCAGACTGA与TCAGTCTGATAAGCT-BHQ-2-A序列互补；
MiRNA-21的核苷酸序列为：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；
其制备方法为：先将HP1和HP2分别稀释至10 μM，在90 ℃退火，逐渐冷却至25 ℃形成发夹结构，备用；然后将1 μL退火后的 HP1，1 μL退火后的 HP2、50 nM miRNA-21与17 μLtris-buffer混合，并在常温下反应2小时。
上述tris-buffer的配方法为：25mM tris-HCl，100 mM NaCl, 50 mM KAc, 10 mMMgAc2 and 1 mM DTT，pH 8.2。
实施例2
一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料，其原料包括：HP3，HP4和miRNA-31三种寡聚物；其中，
HP3的核苷酸序列为：5’-GATCGCGATCAGCTAT-FAM-GCCAGCATCTTGCCTACATCGAGGCAAGATGCTGG-BHQ-1-3’，其中GATCGCGATC为回文序列；AGCTAT(FAM)GCCAGCATCTTGCCT为miRNA-31识别序列，CCAGCATCTTGCCT与AGGCAAGATGCTGG序列互补；
HP4的核苷酸序列为：5’-AGTTCGAACTAGGCAAGATGCTGGCATAGCTTTTGCCAGCATCTTGCCTCGATGT-3’，其中AGTTCGAACT为回文序列；AGGCAAGATGCTGGCATAGCT与miRNA-31对应的 DNA 序列；AGGCAAGATGCTGGC与GCCAGCATCTTGCCT序列互补；
MiRNA-31的核苷酸序列为：5’-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU-3’
其制备方法为：先将HP3和HP4分别稀释至10 μM，在90 ℃退火，逐渐冷却至25 ℃形成发夹结构，备用；然后将1 μL退火后的 HP3，1 μL退火后的 HP4、50 nM miRNA-31与17 μLtris-buffer混合，并在常温下反应2小时。
上述tris-buffer的配方法为：25mM tris-HCl，100 mM NaCl, 50 mM KAc, 10 mMMgAc2 and 1 mM DTT，pH 8.2。
实施例3
形貌测试：取实施例1制备的自组装DNA网状纳米材料10 µL，滴定到干净、刚撕裂的云母片上，在常温下放置30分钟后，用100 µL的水洗4遍后，用N2吹干。然后对其形貌进行测试，AFM图像由Nanoscope AFM系统（Bruker，Germany）用轻敲模式，其中硅悬臂的参数如下：驱动频率=70 kHz，弹簧系数=0.4 N/m。
空白组：为HP1：HP2：miRNA-21=1：1：0的比例制备所得材料。
形貌测试结果见图1。图1结果表明：与空白组对比，实施例1所制备的自组装DNA网状纳米材料在AFM下观察到其形貌为网状结构。
粘性测试：将HP1、HP2、miRNA-21用量扩大10倍。将1 μL HP1（100 μM），1 μL HP2（100 μM）、500 nM miRNA-21与17 μL tris-buffer混合，并在常温下孵育过夜。用玻璃棒沾取DNA网状纳米材料，向上牵拉。
粘性测试结果见图2，图2结果表明：用玻璃棒牵拉DNA网状纳米材料，发现其具有一定的粘连，说明本发明的自组装DNA网状纳米材料具有一定的粘性，对细胞的原位成像具有一定的优势。
实施例4
转染实验按照实验说明书进行：首先将HP1（2 µL，10 µM）与HP2（2 µL，10 µM）与无血清的Opti-MEM混合至200 µL，常温下，静置10分钟，接着加入10 µL的脂质体-3000，并孵育10分钟，制成DNA混合物；将HEK-293细胞、Hela细胞和MCF-7细胞分别在12孔板上培养生长，当细胞长到80%时，加入上述DNA混合物，2小时后，细胞用PBS清洗3次后，用含有血清的Opti-MEM培养基在含有5% CO2培养箱中37 ℃孵育12小时；最后，用4%（w/v）的多聚甲醛将细胞固定20分钟；最终，细胞核用DAPI染料作用5分钟；随后，荧光成像通过A1R激光共聚焦扫描显微镜扫描。DAPI与FAM标记的网状纳米材料使用的激发波长分别为405 nm与488 nm。
细胞内成像结果见图3。图3结果过表明：在MCF-7细胞内miRNA-21高表达时，细胞内荧光最强，对于miRNA-21中表达的HeLa细胞荧光次之，而miRNA-21低表达的HEK-293细胞,其荧光信号最低。说明此方法用于miRNA-21成像是可行的。
实施例5
转染实验按照实验说明书进行。首先将HP3（2 µL，10 µM）与HP4（2 µL，10 µM）与无血清的Opti-MEM混合至200 µL，常温下，静置10分钟。接着加入10 µL的脂质体-3000，并孵育10分钟，制成DNA混合物。将Hela细胞和MCF-7细胞在12孔板上培养生长，当细胞长到大约80%时，加入上述DNA混合物，2小时后，细胞用PBS清洗3次后，用含有血清的Opti-MEM的培养基在含有5% CO2培养箱中37 ℃孵育12小时。最后，用4%（w/v）的多聚甲醛将细胞固定20分钟。最终，细胞核用DAPI染料作用5分钟。随后，荧光成像通过A1R激光共聚焦扫描显微镜扫描。DAPI与FAM标记的网状纳米材料使用的激发波长分别为405 nm与488 nm。
细胞内成像结果见图4。图4结果过表明：在MCF-7细胞内miRNA低表达时，细胞内荧光较弱，而在HeLa细胞内miRNA高表达，细胞内荧光信号显著提高，说明此方法用于miRNA成像是可行的。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
<120> 一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备与应用
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> HP1
<400> 1
gatcgcgatc tcaacatcag tctgataagc taacatcgta gcttatcaga ctg 53
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> HP2
<400> 2
agttcgaact tagcttatca gactgatgtt gattttcagt ctgataagct acgatgt 57
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> MiRNA-21
<400> 3
uagcuuauca gacugauguu ga 22
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> HP3
<400> 4
gatcgcgatc agctatgcca gcatcttgcc tacatcgagg caagatgctg g 51
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> HP4
<400> 5
agttcgaact aggcaagatg ctggcatagc ttttgccagc atcttgcctc gatgt 55
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> MiRNA-31
<400> 6
aggcaagaug cuggcauagc u 21

Claims (8)

1.一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料，其特征在于：所述自组装DNA网状纳米材料包括一对含回文序列的发夹探针DNA和与发夹探针DNA对应的miRNA。
2.根据权利要求1所述的一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料，其特征在于：所述一对含回文序列的发夹探针DNA为HP1/HP2，与发夹探针DNA对应的miRNA为miRNA-21；
所述 HP1的核苷酸序列为：
5’-GATCGCGATCTCAACAT-FAM-CAGTCTGATAAGCTAACATCGTAGCTTATCAGACTG-BHQ-1-3’；
所述HP2的核苷酸序列为：
5’-AGTTCGAACTT-Cy3-AGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTCAGTCTGATAAGCT-BHQ-2-ACGATGT-3’，
所述MiRNA-21的核苷酸序列为：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’。
3.根据权利要求1所述的一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料，其特征在于：所述一对含回文序列的发夹探针DNA为HP3/HP4，与发夹探针DNA对应的miRNA为miRNA-31；
所述HP3的核苷酸序列为：5’-GATCGCGATCAGCTAT(FAM)GCCAGCATCTTGCCTACATCGAGGCAAGATGCTGG(BHQ-1)-3’；
所述HP4的核苷酸序列为：5’-AGTTCGAACTAGGCAAGATGCTGGCATAGCTTTTGCCAGCATCTTGCCTCGATGT-3’；
所述MiRNA-31的核苷酸序列为：5’-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU-3’。
4.一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备方法，其特征在于：先将一对含回文序列的发夹探针DNA分别稀释至10 μM，各自在90 ℃退火，逐渐冷却至25 ℃形成发夹结构，备用；然后退火后的发夹探针DNA各1 μL 、一定浓度的与发夹探针DNA对应的miRNA与17 μL tris-buffer混合，在常温下反应2小时。
5.如权利要求4所述的一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备方法，其特征在于：所述述与发夹探针DNA对应的miRNA的浓度为：50 nM。
6.如权利要求4所述的一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的制备方法，其特征在于：所述tris-buffer的配方法为：25mM tris-HCl，100 mM NaCl, 50 mM KAc, 10 mMMgAc2， 1 mM DTT，pH 8.2。
7.如权利要求1所述的一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料用于活细胞内生物标志物miRNA的成像。
8.一种包含如权利要求1所述一种目标物催化诱导自组装DNA网状纳米材料的诊断试剂。
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