CN107574227B - 一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法，属于分子检测领域。本发明在单个杂交链式反应HCR的基础上，通过设计两级HCR反应，在单个HCR反应基础上达到了信号的进一步扩增，最终一个目标物可以使多个标记有不同荧光染料的发夹核酸探针之间发生交替杂交，形成枝状的DNA纳米结构，通过荧光共振能量转移提供信号输出，根据荧光团的荧光强度改变值判断目标核酸的浓度。本方法可用于DNA和miRNA的体外检测，特异性好，灵敏度高。本方法还可用于细胞内的miRNA的成像分析，有利于实现癌症的早期诊断。

Description

一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法。

背景技术

小分子核酸(miRNA)是一类与癌症紧密相关的肿瘤标志物，它由18～25个核苷酸的小分子非编码RNA构成，在有机体的生长发育，细胞繁殖、代谢、凋亡等生理过程中发挥重要作用(Lee Y.S.,Dutta A.,Annu.Rev.Pathol.,2009,4,199-227.)。miRNA具有组织特异性，在癌症患者血清中表达异常，它的表达与癌症分类、分型以及分期紧密相关，具有较高的灵敏度、稳定性和特异性。因此，建立简单灵敏的miRNA检测方法对重大疾病早期诊断以及相关药物研发具有重要意义。

目前miRNA的检测方法主要有Northern印迹、微阵列杂交、非恒温的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以及恒温扩增方法。Northern印迹和微阵列杂交技术的特异性和灵敏度不高，RT-PCR方法操作繁琐、引物设计严格且必须依赖精良仪器(温度循环)，因而恒温扩增核酸技术成为miRNA检测的一个研究热点。常见的恒温扩增技术主要分为蛋白酶/核酸酶介导扩增技术和核酸链杂交催化放大技术。蛋白酶活性比较高，但对外界反应环境敏感，稳定性有限，反应繁琐，花费较高。核酸酶(DNAzyme)是具有酶催化活性的DNA或RNA分子，具有制备简便、稳定性高、信号读取性强等优点，但是核酸酶的底物链稳定性有限，限制了其普适性应用。核酸链杂交催化技术主要包括杂交链反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)(Dirks R.M.,Pierce N.A.,P.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101,15275-15278.)和催化发夹自组装反应(CHA)(Yin P.,Choi H.M.T.,Calvert C.R.,Pierce,N.A.,Nature,2008,451,318-322.)，利用单个分析物催化诱导两种发夹核酸分子交互打开，并获得扩增信号。CHA具有设计简单、稳定性好、背景信号低、抗干扰等优点，但是其灵敏度往往不高。大部分的核酸恒温扩增方法都是致力于研究扩增体系的信号输出方式，而少数方法是致力于研究体系本身的进一步扩增。

两级HCR在单级HCR基础上有进一步的扩增，还未有人研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于级联杂交链式反应(ConcatenatedHybridization Chain Reaction，C-HCR)的核酸分析方法，该方法具有稳定性好、灵敏度高以及选择性好的优点，有利于实现癌症的早期诊断，并进一步监测其发生发展过程。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明的第一方面提供一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法，其步骤如下：

(1)发卡探针的设计：目标DNA(I)为含a*、b*的序列，运用NUPACK软件设计发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆；上游HCR-1包含H₁、H₂两个发卡，H₁包括a、b、c、b*四个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为发卡结构的环部，a为H₁的5’端单链黏性末端；H₂包括d、b*、a*、b、c*和e五个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，c*为H₂的3’端单链黏性末端，H₂的5’端延伸出一段d序列，d序列中有2-6个碱基封闭在H₂的茎部，H₂的3’端延伸出一段e序列；目标物的a*、b*先跟H₁中a、b杂交从而打开H₁，H₁被打开后释放出c、b*，H₁中c、b*可以与H₂中的c*、b杂交，H₂被打开后释放出a*、b*，该释放出来的序列与目标物的序列一样，因此被打开后的H₂又可以跟H₁杂交，最终一个目标就可以引发多个H₁、H₂之间的相互杂交，形成一条很长的DNA纳米线(HCR-1)；在没有目标物I时，发卡H₁、H₂能保持自身的稳定性，无法发生HCR-1反应。当有目标物I时，就可以引发HCR-1反应，HCR-1产物可以用I-(H₁-H₂)_N表示，即一个目标可以引发多个H1、H2之间的相互杂交；当形成HCR-1产物后，两个相邻H₂的3’端和5’端靠近使d、e序列靠近以及H₂中部分封闭在茎端的d序列完全裸露出来，该靠近的d-e序列可以作为引发链T引发下游HCR-2反应，下游HCR-2包含H₃、H₄、H₅、H₆四个发卡，H₃包括d、f、d*、e*，其3’端标记有TAMRA荧光团，f为H₃的发卡结构的环部，e*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₃茎部；H₄包括f*、d*、g、d，g为H₄的发卡结构的环部，f*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₄茎部；H₅包括d、h、d*、g*，其5’端标记有FAM荧光团,为报告荧光基团，h为H₅的发卡结构的环部，g*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₅茎部；H₆包括h*、d*、e、d，e为H₆的发卡结构的环部，h*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₆茎部；HCR-1产物中靠近的d-e序列先跟H₃中d*、e*杂交从而打开H₃，H₃被打开后释放出d、f，H₃中d、f可以与H₄中的d*、f*杂交，H₄被打开后释放出d、g，H₄中d、g可以与H₅中的d*、g*杂交，H₅被打开后释放出d、h，H₅中d、h可以与H₆中的d*、h*杂交，H₆被打开后释放出d、e，该释放出来的序列与T序列一样，因此被打开后的H₆又可以跟H₃杂交，最终一个目标就可以引发多个H₃、H₄、H₅、H₆之间的相互杂交，形成一条很长的DNA纳米线(HCR-2)，该产物可以用T-(H₃-H₄-H₅-H₆)_N表示；由于H₃上标记有TAMRA荧光团，H₅上标记有FAM荧光团，目标DNA(I)引发HCR-1和HCR-2反应后导致两个荧光团相互靠近，发生荧光共振能量转移，提供信号输出；只有发生HCR-1反应后，两个相邻H₂的3’端和5’端靠近使d、e序列靠近以及H₂中部分封闭在茎端的d序列完全裸露出来，该靠近的d-e序列才可以作为T引发下游HCR-2反应，即目标DNA(I)引发HCR-1反应，HCR-1产物可以引发HCR-2反应；

或者，

当检测目标物miRNA时，运用NUPACK软件设计发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆、H₇；H₇的5’端黏性末端及茎部的序列与目标miRNA完全互补，a*、b*为H₇发卡结构的环部；H₁-H₆的序列设计要求同目标为DNA(I)的设计要求；首先利用miRNA识别并打开H₇，发卡H₇被打开后释放a*-b*，此处的序列a*-b*与目标DNA(I)的序列a*、b*都是引发级联HCR的起始序列，因此被打开后的H₇可以引发上游HCR-1反应，继而可以引发下游HCR-2反应，发生荧光共振能量转移，提供信号输出；

(2)基于级联杂交链式反应实现DNA的检测：在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(HEPES)中，将所有发卡探针(H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆均为200nM)与目标DNA混合，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度；

或者，

基于级联杂交链式反应实现miRNA的检测：在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液中，将所有发卡探针(H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆均为200nM，H₇为50nM)与miRNA混合，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度；

上述方法中，所述的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液浓度为10mM，pH为7.2，含1MNaCl和50mM MgCl₂。

进一步地，本发明提供一种miRNA-21的检测方法，其H₁-H₇的核苷酸序列如SEQ IDNO：1-7所示。

进一步地，本发明还提供上述基于级联杂交链式反应的miRNA的检测方法在细胞成像分析中的应用，其具体为：将6μL转染试剂lipo3000与发卡探针(H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆均为0.2nmol，H₇为0.1nmol)混匀于400μL opti-MEM中，5min后再转入汇合度为70％细胞中，在细胞中加入80μL血清，2h后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像，通过FRET信号强弱判断细胞内miRNA含量的高低。

本发明的技术原理为：

利用目标DNA(I)引发上游HCR-1反应，即目标DNA(I)打开发卡H₁，打开的H₁可以跟发卡H₂杂交，H₂中有一段序列跟目标DNA(I)的序列相同，从而H₂被打开后又可以跟H₁杂交，继而目标DNA(I)可以引发H₁和H₂之间的交替杂交，形成很长的纳米线(HCR-1)。H₂的5’端连接d序列，3’端连接e序列，由于d序列中有部分序列封闭在H₂的茎端，因此单独的H₂无法引发HCR-2反应，当形成HCR-1产物后，两个相邻H₂的3’端和5’端靠近使d、e序列靠近以及H₂中部分封闭在茎端的d序列完全裸露出来，该靠近的d-e序列可以作为引发链(T)引发下游HCR-2反应，即引发链(T)打开发卡H₃，打开的H₃可以跟发卡H₄杂交，H₄被打开后又可以跟发卡H₅杂交，H₅被打开后又可以跟发卡H₆杂交，H₆中有一段序列跟引发链(T)的序列相同，从而H₆被打开后又可以跟H₃杂交，继而引发链(T)可以引发H₃、H₄、H₅和H₆之间的交替杂交，形成很长的纳米线(HCR-2)。最终目标DNA(I)引发H₁、H₂、H₃、H₄、H₅和H₆之间的级联杂交链式反应产生枝状的DNA纳米结构，由于H₃上标记有TAMRA荧光团，H₅上标记有FAM荧光团，目标DNA(I)引发HCR-1和HCR-2反应后导致两个荧光团相互靠近，发生荧光共振能量转移，提供信号输出。此时，探针上荧光团的荧光强度改变值与目标DNA的浓度呈正相关，根据荧光团的荧光强度改变值判断目标DNA的浓度。该方法也是一个通用的检测方法，任何目标分析物只要能和外加DNA链结合如能释放出起始链(I)，均可引发级联杂交链式反应。因此该反应还可用于检测miRNA，首先利用miRNA识别并打开一个H₇，发卡H₇被打开后释放起始链，起始链(I)引发上游HCR-1反应，继而可以引发下游HCR-2反应，发生荧光共振能量转移。此时，探针上荧光团的荧光强度改变值与miRNA的浓度呈正相关，根据荧光团的荧光强度改变值判断miRNA的浓度。其具体原理如图1所示。

本发明的第二方面提供一种基于级联杂交链式反应的DNA检测试剂盒，其包含发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆，上游HCR-1包括H₁、H₂两个发卡，当目标DNA(I)为含a*、b*的序列时，H₁包括a、b、c、b*四个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为发卡结构的环部，a为H₁的5’端单链黏性末端；H₂包括d、b*、a*、b、c*和e五个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，c*为H₂的3’端单链黏性末端，H₂的5’端延伸出一段d序列，d序列中有2-6个碱基封闭在H₂的茎端，H₂的3’端延伸出一段e序列。下游HCR-2包含H₃、H₄、H₅、H₆四个发卡，H₃包括d、f、d*、e*，其3’端标记有TAMRA荧光团，f为H₃的发卡结构的环部，e*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₃茎部；H₄包括f*、d*、g、d，g为H₄的发卡结构的环部，f*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₄茎部；H₅包括d、h、d*、g*，其5’端标记有FAM荧光团,为报告荧光基团，h为H₅的发卡结构的环部，g*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₅茎部；H₆包括h*、d*、e、d，e为H₆的发卡结构的环部，h*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₆茎部；d、e、f、g分别与d*、e*、f*、g*互补。

本发明的第三方面提供一种基于级联杂交链式反应的miRNA检测试剂盒，其包含发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆、H₇，H₇的5’端黏性末端及茎部的序列与目标miRNA互补，a*、b*为H₇发卡结构的环部；上游HCR-1包括H₁、H₂两个发卡，H₁包括a、b、c、b*四个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为发卡结构的环部，a为H₁的5’端单链黏性末端；H₂包括d、b*、a*、b、c*和e五个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，c*为H₂的3’端单链黏性末端，H₂的5’端延伸出一段d序列，d序列中有2-6个碱基封闭在H₂的茎端，H₂的3’端延伸出一段e序列。下游HCR-2包含H₃、H₄、H₅、H₆四个发卡，H₃包括d、f、d*、e*，其3’端标记有TAMRA荧光团，f为H₃的发卡结构的环部，e*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₃茎部；H₄包括f*、d*、g、d，g为H₄的发卡结构的环部，f*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₄茎部；H₅包括d、h、d*、g*，其5’端标记有FAM荧光团,为报告荧光基团，h为H₅的发卡结构的环部，g*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₅茎部；H₆包括h*、d*、e、d，e为H₆的发卡结构的环部，h*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₆茎部；d、e、f、g分别与d*、e*、f*、g*互补。

本发明的技术效果是：本发明通过设计两级HCR提高了目标DNA和miRNA的检测灵敏度，在单个HCR反应基础上达到了信号的进一步扩增。体系的荧光强度改变值与目标DNA的浓度呈正相关，据此实现对目标DNA和miRNA的检测，该方法具有稳定、灵敏度高以及选择性好的优点。当用该方法检测miRNA时，只需引入与目标miRNA互补的、同时含有一段通用序列的不同的H₇，而H₁-H₆的序列保持不变，可以达到检测不同的miRNA的目的；该方法也可以检测蛋白质，只需在H₇中已入一段蛋白质对应的适配体即可，任何目标分析物只要能和外加DNA链结合如能释放出引发HCR的起始链(I)，均可引发级联杂交链式反应，达到检测该目标分析物的目的，因此该反应可用于检测其他核酸、蛋白等生物分子。单级HCR是N倍的信号放大，该级联HCR是N²倍的信号放大，在本发明的一个实施例中，级联HCR产生的荧光响应是单级HCR的25倍，信号放大能力更强，灵敏度更高。我们构建的级联HCR的产物是枝状的DNA纳米结构，该枝状DNA纳米结构包含的荧光基团更多，产物更稳定，荧光强度更大，可以提高miRNA在细胞内的成像效果，而单个HCR荧光弱，稳定性差，容易降解等。该研究有利于实现癌症的早期诊断，并进一步监测其发生发展过程。

附图说明

图1(A)级联杂交链式反应用于DNA检测的原理图；

(B)级联杂交链式反应用于miRNA-21检测的原理图。

图2(A)荧光光谱图(a)H₁、H₂、H₃、H₄、H₅和H₆，(b)H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆和T(T_I、T_II和T_III杂交形成T)，(c)H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆和目标DNA(I)；

(B)C-HCR体系用于检测不同浓度的目标DNA分子的荧光光谱图，(a)0,(b)1×10^-11,(c)5×10^-11,(d)1×10^-10,(e)5×10^-10,(f)1×10^-9,(g)5×10^-9,(h)1×10^-8,(i)5×10^-8和(j)1×10^-7M。插图:校正曲线；

(C)C-HCR体系(a)和传统HCR体系(b)用于检测不同浓度的目标DNA分子的校正曲线；

(D)碱基错配分析的荧光光谱图(a)目标DNA,(b)单碱基错配I_A,(c)两个碱基错配I_B,(d)三个碱基错配I_C。插图：荧光强度改变值；

(E)T(T_I/T_II/T_III)引发HCR-2反应的原理图；

(F)级联杂交链式反应产生的枝状DNA结构图。

图3.(A)凝胶电泳表征；

(B)有目标物时C-HCR产物的原子力显微镜表征；

(C)没有目标物时C-HCR产物的原子力显微镜表征；

(D)传统HCR产物的原子力显微镜表征。

图4.(A)C-HCR体系用于检测不同浓度的miRNA-21的荧光光谱图，(a)0,(b)1×10^-11,(c)5×10^-11,(d)1×10^-10,(e)5×10^-10,(f)1×10^-9,(g)5×10^-9,(h)1×10^-8,(i)5×10^-8和(j)1×10^-7M；

(B)选择性分析的荧光光谱图(a)没有目标物，(b)β-actin mRNA,(c)let-7a,(d)son DNA和(e)miR-21；

(C)荧光强度(λ＝520nm)随时间的变化，在不同浓度的血清溶液中分析miRNA-21，(a)0nM miR-21，缓冲溶液,(b)10nM miR-21,缓冲溶液，(a′)0nM miR-21，5％血清,(b′)10nM miR-21，5％血清,(a″)0nM miR-21，10％血清,(b″)10nM miR-21，10％血清；

(D)在不同浓度的血清溶液中分析miRNA-21的荧光强度(λ＝520nm)改变值。

图5.(A)C-HCR和HCR分析活细胞内的miR-21,(a)C-HCR分析乳腺癌细胞(MCF-7)，(b)传统HCR(H₁、H₂、H₃、H₄和H₅)分析乳腺癌细胞(MCF-7)，(c)乳腺癌细胞(MCF-7)加入miR-21的抑制剂(miR-21inhibitor)后，再用C-HCR进行分析,(d)C-HCR分析宫颈癌细胞(HeLa)；

(B)测量C-HCR体系在乳腺癌细胞(MCF-7)内的FRET效率。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】

发卡探针的设计：运用NUPACK软件设计相关发卡探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成相关核酸序列。在没有目标物时保证每个发卡的茎端有足够的碱基互补配对，能够保持自身的稳定性，荧光保持不变，但在有目标物存在时能够引发级联杂交链式反应，形成枝状的DNA纳米结构，发生荧光共振能量转移，实现目标物的检测。所有发卡探针干粉先用磷酸盐缓冲液溶解，用紫外分光光度计测其吸光度，计算出准确浓度，然后用HEPES缓冲液(浓度为10mM，pH 7.2，含1M NaCl和50mM MgCl₂)将所有发卡探针配成4μM，在PCR中95℃5min，25℃2h，让其形成稳定的发卡。反应均在HEPES缓冲液中进行。

图1A为级联杂交链式反应用于DNA检测的原理图。在HEPES缓冲液中所有发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、H₅和H₆均为200nM，采用荧光光谱仪对C-HCR和HCR体系进行分析，结果如图3所示。由图2(A)可见，在C-HCR体系中没有加入目标物时该体系荧光不会发生变化(图2(A)中的曲线a)，在C-HCR体系中加入50nM T(T_I/T_II/T_III，即T_I、T_II和T_III杂交后形成T)时，T只能引发HCR-2(H₃、H₄、H₅和H₆)反应，因此该体系的荧光只发生微小的变化(图2(A)中的曲线b)，其原理图见图2(E)。在C-HCR体系中加入50nM I(其DNA序列见表1)时，I可以引发级联HCR反应，该体系的荧光发生显著的变化(图2(A)中的曲线c)，级联HCR产生的荧光响应是单级HCR的25倍，证明级联HCR在传统HCR的基础上发生了进一步的扩增，符合反应机理，其原理图见图2(F)。

采用凝胶电泳对C-HCR产物进行表征，配置HCR-1反应液：在HEPES缓冲液中H₁、H₂浓度均为200nM，I为20nM；配置HCR-2反应液：在HEPES缓冲液中H₁、H₂浓度均为200nM，T为20nM；配置C-HCR反应液：在HEPES缓冲液中H₁、H₂、H₃、H₄、H₅和H₆均为200nM，T为20nM；以上反应均在室温下反应2h。将反应液与loading buffer混匀后加入12％丙烯酰胺凝胶中，电泳仪电压设置为120V，3h后取出凝胶用GelRed进行染色，最后通过化学发光成像系统在紫外光线下使DNA显现。电泳结果如图3(A)所示。由图3(A)可见，HCR-1和HCR-2被分开证明，只有当上游HCR-1、下游HCR-2和C-HCR与其对应的引发链结合时才会形成大分子量的产物，这个结果与荧光实验结果是一致的。

采用原子力显微镜对C-HCR产物进行表征，配置HCR-1反应液：在HEPES缓冲液中H₁、H₂浓度均为200nM，I为20nM；配置C-HCR反应液：在HEPES缓冲液中H₁、H₂、H₃、H₄、H₅和H₆均为200nM，T为20nM；以上反应均在室温下反应2h。新剥的云母片需用90μL(3-aminopropyl)trimethoxysilane(APTES)和30μL N,N-diisopropylethylamine(DIPEA)的蒸汽进行预处理2h，使其带正电，该过程在干燥器中进行。将DNA样品稀释至20nM后滴在云母片上，15min后用超纯水洗三遍，氮气吹干，用原子力显微镜进行扫描。结果如图3(B)、3(C)和3(D)所示，当C-HCR体系中加入引发链时，结果是枝状的DNA纳米结构(图3(B))，说明发生了级联HCR反应，同时引入两个控制实验，当C-HCR体系中没有加入引发链时，结果只是一些小点(图3(C))，说明没有引发链时发卡探针之间能保持自身的稳定性。当上游HCR-1体系中加入引发链时，结果是一条条DNA的线状结构(图3(D))，符合反应机理。

【实施例2】基于级联杂交链式反应的DNA检测

在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(浓度为10mM，pH 7.2，含1M NaCl和50mM MgCl₂)中，将所有发卡探针(H₁、H₂、H₃、H₄、H₅和H₆均为200nM)与不同浓度的目标DNA(0，1×10^-11，5×10^-11，1×10^-10，5×10^-10，1×10^-9，5×10^-9，1×10^-8，5×10^-8，1×10^-7M)混合，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度(激发电压600V，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，激发波长490nm，波长扫描范围505-650nm)。

由图2(B)可见，在C-HCR体系中没有加入目标DNA时，每个发卡探针都能保持自身的稳定性，该体系荧光不会发生变化(图2(B)中的曲线a)，当加入不同浓度的目标DNA时，荧光强度改变值与目标DNA的浓度呈正相关，据此可对目标DNA进行检测。由图2(B)可见，随着目标DNA浓度的增加，体系的荧光强度(λ＝520nm)逐渐下降，该荧光强度的改变值与目标DNA浓度在0.01-1nM范围内呈良好的线性关系，检出限为0.003nM，实现了对目标DNA的快速和高灵敏性检测。

为了论证C-HCR相对于传统HCR有进一步的扩增，将C-HCR体系和传统HCR体系(H₁、H₂、H₃、H₄和H₅)同时用于检测不同浓度的靶标DNA分子(图2(C))，对比发现，C-HCR体系的灵敏度更高，检测效果更好。

为了论证本方法对目标DNA检测的选择性，在目标DNA中引入一个碱基错配I_A、两个碱基错配I_B和三个碱基错配I_C进行考察。由图2(D)可见，只有与目标DNA(I)作用时，体系的荧光才会发生显著的变化(图2(D)中的曲线a)，两个碱基错配I_B和三个碱基错配I_C引起的荧光变化非常小(图2(D)中的曲线c，曲线d)，单碱基错配I_A引起的荧光变化(图2(D)中的曲线b)与目标DNA引起的荧光变化有显著的差别，以上结果表明，本发明方法对目标DNA检测有良好的选择性。

【实施例3】基于级联杂交链式反应的miRNA-21体外检测

在羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(浓度为10mM，pH 7.2，含1M NaCl和50mM MgCl₂)中，将所有发卡探针(H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆均为200nM，H₇为50nM)与不同浓度的miRNA-21(0，1×10^-11，5×10^-11，1×10^-10，5×10^-10，1×10^-9，5×10^-9，1×10^-8，5×10^-8，1×10^-7M)混合，在室温下孵育2h，利用荧光光谱仪测量体系的荧光强度(激发电压600V，激发狭缝为5nm，发射狭缝为10nm，激发波长490nm，波长扫描范围505-650nm)。

图1B为级联杂交链式反应用于miRNA-21检测的原理图。由图4(A)可见，在C-HCR体系中没有加入miRNA-21时，每个发卡探针都能保持自身的稳定性，该体系荧光不会发生变化(图4(A)中的曲线a)，当加入不同浓度的miRNA-21时，荧光强度改变值与miRNA-21的浓度呈正相关，据此可对miRNA-21进行检测。由图4(A)可见，随着miRNA-21浓度的增加，体系的荧光强度(λ＝520nm)逐渐下降，该荧光强度的改变值与miRNA-21浓度在0.01-1nM范围内呈良好的线性关系，检出限为0.003nM，实现了对miRNA-21的快速和高灵敏性检测。

为了论证本方法对miRNA-21检测的选择性，选取β-actin mRNA，let-7a和son DNA为干扰组分进行考察。由图4(B)可见，只有与miRNA-21作用时，体系的荧光才会发生显著的变化(图4(B)中的曲线e)，β-actin mRNA，let-7a和son DNA引起的荧光变化非常小(图4(B)中的曲线b，c，d)，以上结果表明，本发明方法对miRNA-21检测有良好的选择性。

考察C-HCR体系在血清溶液中的稳定性，结果如图4(C)、4(D)所示，C-HCR体系在5％血清和10％血清中检测目标物时基本不受干扰，表明该体系在复杂的生物环境中也可以实现目标物的检测。

表1.经由NUPACK软件设计的DNA探针

【实施例4】

基于级联杂交链式反应的miRNA-21的细胞成像分析

乳腺癌细胞(MCF-7)和宫颈癌细胞(HeLa)生长于含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中，放置于含有5％CO₂细胞培养箱中培养。细胞需均匀的分铺在激光共聚焦培养皿上，让其生长24小时细胞的汇合度为70％后，将6μL转染试剂lipo3000与发卡探针(H₁ ^*、H₂ ^*、H₃ ^*、H₄ ^*、H₅ ^*、H₆ ^*均为0.2nmol，H₇ ^*为0.1nmol)混匀于400μL opti-MEM中，5min后再转入细胞中，在细胞中加入80μL血清，2h后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像。

表2.用于活细胞成像的DNA探针：

*代表碱基进行了硫代修饰(Phosphorothioate Bonds)，在进行细胞实验时，可以提高核酸的稳定性；m代表RNA碱基进行了甲氧基修饰(2’-O-Me RNA base)，在进行细胞实验时，可以提高RNA的稳定性。

传统HCR的miRNA-21的细胞成像分析

将6μL转染试剂lipo3000与发卡探针(H₁、H₂、H₃、H₄、H₅均为0.2nmol，H₇为0.1nmol)混匀于400uL opti-MEM中，5min后再转入细胞中，在细胞中加入80μL血清，2h后通过共聚焦显微镜对细胞进行成像。

由图5(A)可见，C-HCR体系在乳腺癌细胞中FRET信号最强(a，图5(A))，表明miR-21在乳腺癌细胞中高表达，而传统HCR体系在乳腺癌细胞中FRET信号较弱(b，图5(A))，表明C-HCR在HCR的基础上有进一步的扩增，C-HCR产生的枝状DNA纳米结构的定位效果更好。当在乳腺癌细胞(MCF-7)中加入miR-21的抑制剂后，再用C-HCR进行分析，结果如图(c，图5(A))所示，基本已没有FRET信号产生，表明C-HCR体系可以监测活细胞内miR-21的变化。当C-HCR体系在宫颈癌细胞中成像分析时，FRET信号较弱(d，图5(A))，表明miR-21在宫颈癌细胞中低表达。

为了论证C-HCR在MCF-7细胞内确实发生了荧光共振能量转移，用光漂荧光受体的方法测量C-HCR体系在MCF-7细胞内的FRET效率。由图5(B)可见，FRET效率大约为0.62，证明MCF-7细胞内确实有miR-21存在并发生了C-HCR反应。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ggaattcgga gctaggtagg tagagtaatg ccgtctacct acctagctcc g 51

<210> 2

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gcttcatctt catctccgtc tacctaccta gctccgaatt cccggagcta ggtaggtaga 60

cggcattaca cactc 75

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

gagtgtcgga gatgaagatg aagccatcgt gcttcatctt catctccgta mra 53

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gcttcatctt catctccggt tttgcggaga tgaagatgaa gcacgatg 48

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

caaaaccgga gatgaagatg aagcttgcct gcttcatctt catctccg 48

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gcttcatctt catctccgac actccggaga tgaagatgaa gcaggcaa 48

<210> 7

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

atcagactga tgttgaggtc tacctaccta gctccgaatt cctcaacatc agtctgataa 60

gcta 64

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

tctacctacc tagctccgaa ttcc 24

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gcttcatctt catctccgtc tacctaccta tttttt 36

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

ttttttggta tacggcatta cacactc 27

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aaaaaatagg taggtagagt aatgccgtat accaaaaaa 39

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 12

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 14

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 14

acucccagau guuagcaac 19

<210> 15

<211> 41

<212> RNA

<213> 人工序列()

<400> 15

gcaagccaug uacguugcua uccaggcugu gcuaucccug u 41

Claims (2)

1.一种基于级联杂交链式反应的miRNA检测试剂盒，其特征在于，包含发卡探针H₁、H₂、H₃、H₄、H₅、H₆、H₇，H₇的3’端黏性末端及茎部的序列与目标miRNA完全互补，a*、b*为H₇发卡结构的环部，是HCR-1的引发链序列；上游HCR-1包括H₁、H₂两个发卡，H₁包括a、b、c、b*四个部分，其中b与b*互补成双链作为H₁茎部，c为发卡结构的环部，a为H₁的5’端单链黏性末端；H₂包括d、b*、a*、b、c*和e五个部分，其中b与b*互补成双链作为H₂茎部，a*为发卡结构的环部，c*为H₂的3’端单链黏性末端，H₂的5’端延伸出一段d序列，d序列中有2-6个碱基封闭在H₂的茎端，H₂的3’端延伸出一段e序列;下游HCR-2包含H₃、H₄、H₅、H₆四个发卡，H₃包括d、f、d*、e*，其3’端标记有TAMRA荧光团，f为H₃的发卡结构的环部，e*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₃茎部；H₄包括f*、d*、g、d，g为H₄的发卡结构的环部，f*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₄茎部；H₅包括d、h、d*、g*，其5’端标记有FAM荧光团, 为报告荧光基团，h为H₅的发卡结构的环部，g*为在发卡结构茎部延伸出的5’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₅茎部；H₆包括h*、d*、e、d，e为H₆的发卡结构的环部，h*为在发卡结构茎部延伸出的3’单链黏性末端，其中d与d*互补成双链作为H₆茎部；d、e、f、g分别与d*、e*、f*、g*互补。

2.根据权利要求1所述的miRNA检测试剂盒，其特征在于，所述的miRNA为miRNA-21，其H₁-H₇的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-7所示。

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