CN111718985A - 一种microRNAs检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种microRNAs检测试剂盒及检测方法和应用，所述试剂盒包括肽核酸、茎环DNA和修饰有蔗糖转化酶的DNA。本申请所提供的microRNAs的检测试剂盒，引入双重无酶介导的新型级联恒温扩增反应信号放大策略，利用了催化茎环自组装和杂交链式反应协同作用，实现了循环miRNAs高特异性和高灵敏度的分析，同样适用于新型冠状病毒RNA、禽流感病毒RNA、基因突变等方面的检测，具有广泛的应用前景。且检测过程中，使用手持式血糖仪的信号定量血清中循环microRNAs含量，具有方便、易携带、可操作性强的特点。

Description

一种microRNAs检测试剂盒及检测方法和应用
技术领域
本申请涉及一种microRNAs检测试剂盒及检测方法和应用，属于化学和生物传感领域。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一种内源性小RNA，长度约为20-24个核苷酸，在生命过程中发挥着许多重要的调控功能，包括早期发育、细胞增殖、凋亡和细胞死亡。最近的研究表明，miRNAs的表达水平也与癌症的发生、转移和肿瘤术后恢复密切相关。因此，miRNAs将是其所涉及的相应类型癌症的理想的潜在生物标志物。一般来说，miRNAs不仅在癌细胞或肿瘤组织中表达，在外周血中也有表达。通常，外周血中miRNAs的表达水平与癌细胞或肿瘤组织中miRNAs的表达水平有一定的相关性，而细胞/组织中表达异常的miRNAs大多在外周血中有相同的变化趋势。此外，经室温、煮沸、反复冻融循环和过酸处理后，发现外周血miRNAs在过夜后保持稳定。外周血检测具有无创、可重复、可同时进行多指标检测的优点。因此，对肿瘤细胞或肿瘤组织，尤其是外周血中miRNAs的识别和定量，将对癌症的早期诊断和治疗，以及对癌症患者的预后有很大的价值。
针对外周血中微量循环miRNAs的表达与定量检测，目前应用最广泛的方法是实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和NGS法。qRT-PCR具有很高的灵敏度，只需要相对较低的RNA量既可以对RNA进行绝对定量。但由于其在逆转录和PCR过程中选择性较低，更适合于较长DNA/RNA靶点的定量，不适用于大约20个碱基的短链miRNAs的定量，另外，每一步反应需要特殊的引物，可能产生假阳性信号。与PCR相比，新型的NGS系统提供了更大的动态范围，但由于相对较高的NGS错误率，miRNAs的测序仍然受到限制。此外，NGS对基础设施、计算机能力和人员专业知识要求较高，限制了其临床应用，一次测试的成本非常高(1000美元)。因此，开发对设备和人员技能要求低、对核酸对液体活检的敏感性和选择性高的技术是有意义的。
为了解决这些问题，本申请提出了一种利用个人血糖仪(PGM)测定循环miRNAs的试剂盒方法。本申请引入双重无酶介导的新型级联恒温扩增反应信号放大策略，该放大策略利用了催化茎环自组装和杂交链式反应协同作用，实现了循环miRNAs高特异性和高灵敏度的分析。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供了一种microRNAs检测试剂盒，该检测盒能够在microRNAs检测中，利用催化茎环自组装和杂交链式反应的协同作用，放大microRNAs信号，提高了microRNAs的检测灵敏度。
所述microRNAs检测试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒包括肽核酸、茎环DNA和修饰有蔗糖转化酶的DNA。
可选地，所述试剂盒包括：
1条肽核酸序列；
4条茎环DNA长链，分别为H1、H2、H3、H4；
2条修饰有蔗糖转化酶的DNA短链，分别为cDNA1、cDNA2。
可选地，肽核酸的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
可选地，H1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
H2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
H3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
H4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；
cDNA1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；
cDNA2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。
可选地，试剂盒的检测限为0.36fM。
根据本申请的又一个方面，提供了一种microRNAs的检测方法，至少包括以下步骤：
S1)获得肽核酸修饰物；
S2)在肽核酸修饰物存在条件下，将待测物与茎环DNA混合，在催化茎环自组装的条件下得到的产物I被肽核酸修饰物捕获；
S3)在产物I存在条件下，修饰有蔗糖转化酶的DNA和茎环DNA进行杂交反应，得到的产物中加入蔗糖，测定葡萄糖的浓度。
可选地，步骤S1)中肽核酸修饰物为PNA序列与氨基固定剂偶联得到。
具体地，肽核酸修饰物为PNA的氨基末端与氨基固定剂(Nunc immobilizeramino)的氨基基团震荡偶联得到，震荡偶联条件为：在室温条件下震荡反应2h～2.5h。
可选地，步骤S2)中茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链；
所述待测物中含有microRNAs片段，microRNAs片段触发由两条茎环DNA长链参与的催化茎环自组装反应，得到茎环DNA长链的双链产物；或
待测物中不含microRNAs片段，则不发生催化茎环自组装反应。
可选地，步骤S2)中茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链，分别为H1和H2；
H1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
H2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。
可选地，步骤S2)中所述催化茎环自组装的条件包括：
将含有茎环DNA溶液在90～95℃下加热反应3～5分钟后，快速冰浴冷却3～5分钟，然后加入待测物，在室温下反应1～2小时。
优选地，快速冰浴冷却后，室温放置1h。
具体地，加热温度的下限可独立选自90℃、90.5℃、91℃、91.5℃、92℃；加热温度的上限可独立选自92.5℃、93℃、93.5℃、94℃、95℃。
具体地，加热反应时间可独立选自3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟；或上述任两个点值之间的范围。
具体地，冷却时间可独立选自3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟；或上述任两个点值之间的范围。
具体地，室温反应时间可独立选自1小时、1.25小时、1.5小时、1.75小时、2小时；或上述任两个点值之间的范围。
可选地，步骤S3)中修饰有蔗糖转化酶的DNA包括至少2条修饰有蔗糖转化酶的DNA短链；
步骤S3)中所述茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链；
待测物中含有microRNAs片段，茎环DNA长链的双链产物的末端触发修饰有蔗糖转化酶的DNA和茎环DNA的杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的线性长链；或
待测物中不含microRNAs片段，则不发生杂交链式反应。
可选地，步骤S3)中茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链，分别为H3和H4；
H3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
H4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；
步骤S3)中修饰有蔗糖转化酶的DNA包括至少2条修饰有蔗糖转化酶的DNA短链，分别为cDNA1、cDNA2；
cDNA1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；
cDNA2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。
可选地，步骤S3)中所述杂交反应条件包括：
将含有茎环DNA溶液90～95℃下加热反应3～5分钟后，快速冰浴冷却3～5分钟后，然后加入修饰有蔗糖转化酶的DNA反应25～35分钟，最后加入试剂盒中，在室温下反应3～4小时。
优选地，快速冰浴冷却后，在室温放置1h。
具体地，加热温度的下限可独立选自90℃、90.5℃、91℃、91.5℃、92℃；加热温度的上限可独立选自92.5℃、93℃、93.5℃、94℃、95℃。
具体地，加热反应时间可独立选自3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟；或上述任两个点值之间的范围。
具体地，冷却时间可独立选自3分钟、3.5分钟、4分钟、4.5分钟、5分钟；或上述任两个点值之间的范围。
具体地，室温反应时间可独立选自3小时、3.25小时、3.5小时、3.75小时、4小时；或上述任两个点值之间的范围。
可选地，待测物中含有microRNAs片段，测得葡萄糖浓度；或
待测物中不含microRNAs片段，测量结果为空白值或背景值。
可选地，步骤S3)中通过血糖仪测定葡萄糖的浓度。
可选地，步骤S3)中通过血糖仪测定葡萄糖的浓度，以确认待测物中是否含有microRNAs和/或待测物中microRNAs的含量。
可选地，所述检测方法采用上述任一试剂盒。
可选地，所述检测方法包括：
1)获得肽核酸PNA修饰的试剂盒；
2)在试剂盒中，添加待测物；
如待测物中含有目标microRNAs片段，触发由茎环DNA参与的催化茎环自组装反应，得到的产物被肽核酸PNA捕获；
如待测物中不含有目标microRNAs片段，则不发生催化茎环自组装反应；
3)通过步骤2)得到产物，使得修饰有蔗糖转化酶的DNA与茎环DNA在试剂盒中进行杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链；或
不发生杂交链式反应；
4)在试剂盒中添加蔗糖，蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖，葡萄糖的最终浓度，以此确定是否含有目标microRNAs和/或目标microRNAs的含量。
可选地，所述检测方法包括：
1)获得肽核酸PNA修饰的试剂盒；
2)在所述试剂盒中，添加待测物；
如待测物中含有目标microRNAs片段，目标microRNAs片段触发由H1和H2参与的催化茎环自组装反应，得到H1+H2双链产物，并被肽核酸探针PNA捕获；
如待测物中不含有目标microRNAs片段，则不发生催化茎环自组装反应；
3)获得修饰有蔗糖转化酶的cDNA1和cDNA2，将cDNA1和cDNA2分别与H3和H4杂交，得到H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物；
4)将试剂盒中的H1+H2双链产物与H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物进行杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链；或
不发生杂交链式反应；
5)在试剂盒中添加蔗糖，待蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖后，测定葡萄糖的最终浓度，以此确定是否含有目标microRNAs和/或目标microRNAs的含量。
可选地，步骤1)包括：
通过固相多肽合成技术制备得到PNA序列，PNA与试剂盒底部氨基基团反应，偶联，即得到PNA修饰的试剂盒。
可选地，所述方法，至少包括以下步骤：
1)获得肽核酸探针PNA修饰的试剂盒；
2)在所述试剂盒中，添加目标microRNAs片段，所述目标microRNAs片段触发由H1和H2参与的催化茎环自组装反应，得到H1+H2双链产物，并被肽核酸探针PNA捕获；
3)获得修饰有蔗糖转化酶的cDNA1和cDNA2，将cDNA1和cDNA2分别与H3和H4杂交，得到H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物；
4)将所述试剂盒中的H1+H2双链产物与H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物进行杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链；
5)在所述试剂盒中添加蔗糖，待蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖后，测定葡萄糖的最终浓度，以此确定目标microRNAs的含量。
在优选的实施方式中，当存在待测microRNAs片段时，所述目标microRNAs触发催化茎环自组装和杂交链式反应，负载的蔗糖转化酶多，可得到有效的血糖仪读数，以此确定目标microRNAs的含量；
当不存在待测microRNAs片段时，将不触发催化茎环自组装和杂交链式反应，没有有效的蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖，血糖仪读数为背景值。
可选地，步骤2)中，目标microRNAs与H1和H2的摩尔比为1:3.5～4.5:3.5～4.5；优选地，目标microRNAs与H1和H2的摩尔比为1:4:4。
肽核酸探针PNA与H1+H2双链产物摩尔比为2～2.5:1；优选地，肽核酸探针PNA与H1+H2双链产物摩尔比为2:1。
具体地，目标microRNAs与H1和H2的摩尔比中，H1和H2的下限可分别独立选自3.5、3.6、3.7、3.8、3.9；H1和H2的上限可分别独立选自4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5。
具体地，肽核酸探针PNA与H1+H2双链产物摩尔比的下限可独立选自2:1、2.05:1、2.1:1、2.15:1、2.2:1；肽核酸探针PNA与H1+H2双链产物摩尔比的下限可独立选自2.25:1、2.3:1、2.35:1、2.4:1、2.5:1。
可选地，修饰有蔗糖转化酶的DNA，通过将蔗糖转化酶与DNA复合物通过磺基-SMCC偶联得到；
本申请一种具体地实施方式，修饰有蔗糖转化酶的DNA的获得方法为：
将蔗糖转化酶与sulfo-SMCC链接剂反应Ⅰ，得到转化酶-SMCC复合物；
将转化酶-SMCC复合物与SH-cDNA反应Ⅱ，得到修饰有蔗糖转化酶的DNA；
优选的，反应Ⅱ的条件为：反应温度为28～30℃，pH为7.4～7.5。
得到的修饰有蔗糖转化酶的DNA的浓度，可以通过紫外可见光谱定量分析得到。
可选地，所述检测方法还包括：
将试剂盒中的各核苷酸与不同浓度的目标microRNAs片段进行杂交，建立标准曲线来确定试剂盒灵敏度的步骤；
可选地，目标microRNAs浓度范围为：1fM～10nM，肽核酸探针PNA浓度为1μM，H1和H2浓度为400nM，H3+cDNA1和H4+cDNA2浓度为1μM。
本申请又一方面，提出了上述microRNAs检测试剂盒的应用。
上述microRNAs检测试剂盒适用于血清中循环microRNAs的液体活检。
本申请又一方面，提出了上述microRNAs的检测方法的应用。
上述microRNAs的检测方法适用于血清中循环microRNAs的液体活检。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的microRNAs的检测试剂盒，引入双重无酶介导的新型级联恒温扩增反应信号放大策略，利用了催化茎环自组装和杂交链式反应协同作用，实现了循环miRNAs高特异性和高灵敏度的分析。
2)本申请所提供的microRNAs的检测试剂盒，具有成本低、无需繁琐的修改和分离步骤、操作方便、以及稳定性高的优点，同样适用于新型冠状病毒RNA、禽流感病毒RNA、基因突变等方面的检测，具有广泛的应用前景。
3)本申请所提供的microRNAs的检测方法，相比于传统PCR技术，协同催化茎环自组装和杂交链式反应的新型等温扩增技术放大microRNAs信号，具有恒温、免酶、无需特殊引物、更适合短链核酸检测等优点。
4)本申请所提供的microRNAs的检测方法，使用手持式血糖仪的信号定量血清中循环microRNAs含量，具有方便、易携带、可操作性强的特点。
附图说明
图1为本申请一种实施方式中microRNAs的检测方法的示意图；
图2为本申请实施例中试剂盒的检测灵敏度结果；
图3为本申请试剂盒线性范围和检测限。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买，其中肽核酸探针通过固相肽合成技术制备；茎环DNA H1、H2、H3、H4以及用于负载蔗糖转化酶的DNA、SH-cDNA均购自上海杰李生物技术有限公司；目标miRNAs(miRNA155，SEQ.ID.NO.8)购自上海吉玛制药技术有限公司；所有核酸序列均通过紫外-可见吸收光谱仪进行精确定量。
实验中使用的水均为18.2MΩ的Milli-Q超纯水。
蔗糖转化酶、sulfo-SMCC链接剂、三(2-羧乙基)膦TCEP和单链鲑鱼精子DNA购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；赖氨酸购自国药集团化学试剂有限公司；牛血清白蛋白购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
根据本申请的一种实施方式，microRNAs的检测方法，如图1所示，包括以下步骤：
1)获得肽核酸探针PNA修饰的试剂盒；
2)在所述试剂盒中，添加目标microRNAs片段，所述目标microRNAs片段触发由H1和H2参与的催化茎环自组装反应，得到H1+H2双链产物，并被肽核酸探针PNA捕获；
3)获得修饰有蔗糖转化酶的cDNA1和cDNA2，将cDNA1和cDNA2分别与H3和H4杂交，得到H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物；
4)将所述试剂盒中的H1+H2双链产物与H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物进行杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链；
5)在所述试剂盒中添加蔗糖，待蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖后，测定葡萄糖的最终浓度，以此确定目标microRNAs的含量。
本申请中，一种具体的实现方式是，PNA修饰的96孔试剂盒的制备及PNA捕获实验操作如下：
将PNA溶解在pH为9的固定缓冲液中(溶液中PNA的最终浓度为1.0μM)，并向试剂盒的每个孔中加入100μL。设置未加PNA的孔为空白对照。将试剂盒用密封带密封，并置于平板振荡器(600～700转/分钟)上，室温条件下震荡反应2小时，得到肽核酸修饰的试剂盒。然后向修饰PNA的孔中加入50μL覆盖溶液，使最终体积为150μL。将其再次置于在平板振荡器上震荡30分钟。随后吸出孔内液体，用300μL 1×PBST洗涤4次，再用1×PBS洗涤4次。最后加入250μL 1×PBS，将试剂盒密封储存于4℃备用。实验前，通过抽吸除去1×PBS，并向孔中加入200μL封闭溶液。将试剂盒密封并在37℃下振荡孵育30分钟，立即吸出孔内液体并迅速加入催化茎环自组装(CHA)反应后的样品，将平板密封并在室温下孵育40分钟使PNA捕获CHA产物，随后用300μL 1×PBST洗涤4次，再用1×PBS洗涤4次。将这些孔与200μL BLBs孵育，将试剂盒密封并在37℃下振荡孵育30分钟。
本申请中，一种具体的实现方式是，催化茎环自组装(CHA)反应操作过程如下：
本工作中1×PBS缓冲液由DEPC处理的水配制。所有DNA和miRNAs样品均用1×PBS溶解制备。为了形成稳定的发夹结构，发夹DNA探针溶液(即含有H1，H2的溶液)在95℃加热5分钟，然后放入冰浴中5分钟进行快速冷却。最后，将溶液在室温下孵育1小时。按照H1，H2与miRNA155按摩尔比4：4：1(最终浓度分别为400nM，400nM和100nM)，将miRNAs加入溶液中，在室温下孵育2小时，制备得到CHA反应产物(即H1+H2双链产物)。
本申请中，一种具体的实现方式是，修饰有蔗糖转化酶的DNA的合成过程如下：
首先，将蔗糖转化酶(2.5mg)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐sulfo-SMCC链接剂(1mg)混合溶解于1mL PBS缓冲液(PBS缓冲液中含有10mMPB,137mM NaCl,2.7mM KCl,pH 7.4)中，在室温条件下以750rpm震荡2.5小时，使转化酶与sulfo-SMCC通过酰胺键连接，将混合物以6000rpm离心1分钟，除去不溶的过量的sulfo-SMCC。随后，通过Amicon-10K过滤器过滤六次纯化得到转化酶-SMCC复合物的产物。同时，将SH-cDNA与15μL的100mM三(2-羧乙基)膦TCEP连续混合，在室温下静置1小时用于活化SH-cDNA(溶液体积为120μL，SH-cDNA的含量为125μM)，通过Amicon-10K过滤6次除去过量的TCEP。随后，将活化的SH-cDNA与转化酶-SMCC复合物混合，并在30℃，pH7.4条件下搅拌过夜，使SH-cDNA与SMCC末端的马来酰亚胺连接以得到蔗糖转化酶-cDNA缀合物。然后，通过Amicon-50K纯化至少6次除去未反应的SH-cDNA，得到纯化后的蔗糖转化酶-cDNA缀合物(Inv-cDNA缀合物，即修饰有蔗糖转化酶的DNA)。
本申请中，一种具体的实现方式是，H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物制备、杂交链式反应(HCR)及血糖仪测试如下：
所有参与HCR反应的DNA均溶解于含有140mM MgCl2的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中。
发夹H3，H4探针溶液在95℃加热5分钟，然后通过将样品放入冰浴中5分钟进行快速冷却，并在室温下孵育1小时以形成稳定的发夹结构。随后，将H3和Inv-cDNA1，H4和Inv-cDNA2在室温(RT)下孵育30分钟，分别形成H3+Inv-cDNA1，H4+Inv-cDNA2稳定双链。
HCR反应由H3+Inv-cDNA1，H4+Inv-cDNA2与CHA以10：10：1的摩尔比(最终浓度分别为4μM，4μM和400nM)在RT下混合，并加入上述96孔板的每个孔中100μL，密封室温反应4小时，得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链。取下孔并进行洗涤程序。
通过多通道吸移管在试剂盒中加入100μL 100mM蔗糖，50℃条件下反应45分钟。使用罗氏ACCU-CHEK Performa纳米个人血糖计立即监测这些孔，检测得到葡萄糖的浓度。读取数据后用薄膜把试剂盒密封起来，置于4℃保存。
本申请的方法中，当存在待测microRNAs片段时，所述目标microRNAs介导由茎环H1和H2参与的催化茎环自组装反应，得到H1+H2双链产物，肽核酸探针捕获所述H1+H2双链至试剂盒中，随后，H1末端触发负载有cDNA1-转化酶的茎环H3和负载有cDNA2-转化酶的茎环H4参与的杂交链式反应，形成线性长链，该长链负载有蔗糖转化酶，添加蔗糖后，蔗糖转化酶在55℃条件下将蔗糖转化为葡萄糖，利用血糖仪测定葡萄糖的最终浓度，以此确定目标microRNA的含量，得到在线性范围内试剂盒的最低检测限；当不存在待测microRNA片段时，所述目标microRNA将不触发催化茎环自组装和杂交链式反应，因此，没有有效的蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖，血糖仪读数为背景值。
优选地，血糖仪读数直接反应microRNAs含量的高低，而本申请中血糖仪读数高低是由蔗糖转化酶含量决定的，即microRNAs浓度高介导的催化茎环自组装和杂交链式反应产物多，含有蔗糖转化酶浓度高，蔗糖转换为葡萄糖的浓度也高，反之亦然。
本申请中DNA片段和PNA序列如表1所示。
表1DNA和肽核酸探针的序列
Figure BDA0002589551110000121
实施例1
1.蔗糖转化酶-cDNA缀合物的合成：
首先，将蔗糖转化酶(2.5mg)和sulfo-SMCC链接剂(1mg)混合溶解于1mL PBS缓冲液(PBS缓冲液中含有10mM PB,137mM NaCl,2.7mM KCl,pH 7.4)中，在室温条件下以750rpm震荡2.5小时，使转化酶与sulfo-SMCC通过酰胺键连接，将混合物以6000rpm离心1分钟，除去不溶的过量的sulfo-SMCC。随后，通过Amicon-10K过滤器过滤六次纯化得到转化酶-SMCC复合物的产物。同时，将SH-cDNA与15μL的100mM TCEP连续混合，在室温下静置1小时用于活化SH-cDNA(溶液体积为120μL，SH-cDNA的含量为125μM)，通过Amicon-10K过滤6次除去过量的TCEP。随后，将活化的SH-cDNA与转化酶-SMCC复合物混合，并在30℃，pH7.4条件下搅拌过夜，使SH-cDNA与SMCC末端的马来酰亚胺连接以得到蔗糖转化酶-cDNA缀合物。随后，通过Amicon-50K纯化至少6次除去未反应的SH-cDNA，得到纯化后的蔗糖转化酶-cDNA缀合物(Inv-cDNA缀合物)。最后，将得到的Inv-cDNA缀合物以5mg/mL的浓度分散在PBS缓冲液中。使用前，将Inv-cDNA缀合物稀释至1μM的DNA浓度，此时转化酶浓度为0.15mg/mL(通过DeNovix DS-11分光光度计计算)。
2.缓冲液准备：
固定缓冲液：100mM Na2CO3，pH 9.6；
覆盖溶液(CAP)：25mM赖氨酸，10mM NaH2PO4，100mM NaCl，0.1mM EDTA，pH 8.0；
1×PBS：9.0g·l-1NaCl，144mg·l-1KH2PO4，795mg·l-1Na2HPO4，pH 7.4；
1×PBST：含有0.05wt％吐温20的1×PBS；
封闭缓冲液(BLB)：2wt％牛血清白蛋白，25mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)，150mMNaCl，0.05wt％吐温20，0.1mM EDTA，pH 7.4；
BLBs缓冲液：含有0.1mg·ml-1单链鲑鱼精子DNA的BLB。
3.催化茎环自组装(CHA)反应操作过程如下：
本工作中1×PBS缓冲液由DEPC处理的水配制。所有DNA和miRNA样品均用1×PBS溶解制备。
为了形成稳定的发夹结构，发夹DNA探针溶液(即含有H1，H2的溶液)在95℃加热5分钟，然后放入冰浴中5分钟进行快速冷却。然后，将溶液在室温下孵育1小时。按照H1，H2与miRNA155按摩尔比4：4：1(最终浓度分别为400nM，400nM和100nM)，将miRNA155加入溶液中，在室温下孵育2小时，制备得到如图1中的CHA反应产物。
4.PNA修饰的96孔试剂盒的制备及PNA捕获实验操作如下：
将PNA溶解在pH为9的固定缓冲液中(溶液中PNA的最终浓度为1.0μM)，并向试剂盒的每个孔中加入100μL。设置未加PNA的孔为空白对照。将试剂盒用密封带密封，并置于平板振荡器(600转/分钟)上，室温条件下震荡反应2小时。然后向修饰PNA的孔中加入50μL覆盖溶液，使最终体积为150μL。将其再次置于在平板振荡器上震荡30分钟。随后吸出孔内液体，用300μL 1×PBST洗涤4次，再用1×PBS洗涤4次。最后加入250μL 1×PBS，将试剂盒密封储存于4℃备用。当准备好进行测定时，通过抽吸除去1×PBS，并向孔中加入200μL封闭溶液。将板密封并在37℃下振荡孵育30分钟，立即吸出孔内液体并迅速加入CHA反应后的样品，将平板密封并在室温下孵育40分钟使PNA捕获CHA产物，随后用300μL 1×PBST洗涤4次，再用1×PBS洗涤4次。将这些孔与200μL BLBs孵育，将试剂盒密封并在37℃下摇动30分钟。
5.杂交链式反应(HCR)制备及血糖仪测试如下：
所有参与HCR反应的DNA均溶解于含有140mM MgCl2的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中。
发夹H3，H4探针溶液在95℃加热5分钟，然后通过将样品放入冰浴中5分钟进行快速冷却，并在室温下孵育1小时以形成稳定的发夹结构。随后，将H3和Inv-cDNA1，H4和Inv-cDNA2在室温(RT)下孵育1小时，分别形成H3+Inv-cDNA1，H4+Inv-cDNA2稳定双链。HCR反应由H3+Inv-cDNA1，H4+Inv-cDNA2与CHA以10：10：1的摩尔比(最终浓度分别为4μM，4μM和400nM)在RT下混合，并加入上述96孔板的每个孔中100μL，密封室温反应4小时，即得到如图1所示的负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链。取下孔并进行洗涤程序。
通过多通道吸移管在试剂盒中加入100μL 100mM蔗糖，50℃条件下反应45分钟。使用罗氏ACCU-CHEK Performa纳米个人血糖计立即监测这些孔，检测得到葡萄糖的浓度。读取数据后用薄膜把试剂盒密封起来，置于4℃保存。
使用具有不同浓度的目标microRNAs(0,1fM，10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM和10nM)评估该试剂盒，结果如图3所示，试剂盒的检测灵敏度为fM级别，检测线性范围为1fM～10nM，检测限为0.36fM。
图1为本申请实施例中利用双重级联恒温扩增技术检测microRNA的示意图。该示意图主要有三部分组成，包括1)当存在目标物microRNA时，触发由茎环H1和H2引导的催化茎环自组装(CHA)反应，得到H1+H2双链产物，H1+H2双链产物的H2末端可与PNA的12个碱基杂交，并被PNA捕获至试剂盒；2)得到的H1+H2双链产物的H1末端可触发由H3’和H4’参与的杂交链式反应(HCR)，其中H3’和H4’分别由H3，H4与修饰有蔗糖转化酶的cDNA1和cDNA2分别杂交互补形成的产物，HCR反应后得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链；3)添加蔗糖后，蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖，利用血糖仪测定葡萄糖的最终浓度，以此确定目标microRNA的含量，得到在线性范围内试剂盒的最低检测限；
图2为本申请实施例中试剂盒的检测灵敏度结果，从图中可以看出血糖仪读数(葡萄糖浓度)和miRNA155浓度在1fM至10nM之间8个数量级上的对数关系，说明检测灵敏度达到了fM级别。
图3显示了血糖仪读数(葡萄糖浓度)与miRNA155的浓度之间的关系，可以看出，血糖仪读数随目标miRNA155浓度在1fM至10nM范围内线性增加，回归方程为(Y＝3.45log C+16.25,R2＝0.982)。根据方程LOD＝3×(SD/S)，计算得出该试剂盒的miRNA155的检测极限为0.36fM，置信水平为1％，其中SD是响应的标准偏差，S是斜率线性区域中标准曲线的坐标。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
序列表
<110> 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所；中国科学院宁波材料技术与工程研究所
<120> 一种microRNAs检测试剂盒及检测方法和应用
<130> DD200244I
<141> 2020-07-17
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 1
atcacatctc ta 12
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 2
cccctatcac gattagcatt aacctagaga tgtttaatgc taatcgtgat ccataactgt 60
cctg 64
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 3
gcattaaaca tctctaggtt aatgctaatc gtgatcctag agatgtgat 49
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 4
caggctcgtg tgaaaaaatg atccataact gtcctgtcaa ctaagtcagg acagttatgg 60
atcacgatt 69
<210> 5
<211> 74
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 5
acttagttga caggacagtt atggatcagc tacaatcgtg atccataact gtcctgaaaa 60
aagtcgtgtc ctca 74
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 6
cacacgagcc tgaaaaaash 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 7
hsaaaaaatg aggacacgac 20
<210> 8
<211> 23
<212> RNA
<213> An artificial sequence
<400> 8
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

Claims (10)

1.一种microRNAs检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括肽核酸、茎环DNA和修饰有蔗糖转化酶的DNA。
2.根据权利要求1所述的microRNAs检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1条肽核酸序列；
4条茎环DNA长链，分别为H1、H2、H3、H4；
2条修饰有蔗糖转化酶的DNA短链，分别为cDNA1、cDNA2。
3.根据权利要求1或2所述的microRNAs检测试剂盒，其特征在于，所述肽核酸的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
优选地，所述H1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
优选地，所述H2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
优选地，所述H3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
优选地，所述H4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；
优选地，所述cDNA1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；
优选地，所述cDNA2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的microRNAs检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测限为0.36fM。
5.一种microRNAs的检测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1)获得肽核酸修饰物；
S2)在肽核酸修饰物存在条件下，将待测物与茎环DNA混合，在催化茎环自组装的条件下得到的产物I被肽核酸修饰物捕获；
S3)在产物I存在条件下，可触发修饰有蔗糖转化酶的DNA和茎环DNA进行杂交反应，得到的产物中加入蔗糖，测定葡萄糖的浓度。
6.根据权利要求5所述的microRNAs的检测方法，其特征在于，步骤S1)中所述肽核酸修饰物为PNA序列与氨基固定剂偶联得到；
优选地，步骤S2)中所述茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链；
所述待测物中含有microRNAs片段，所述microRNAs片段触发由两条茎环DNA长链参与的催化茎环自组装反应，得到茎环DNA长链的双链产物；或
所述待测物中不含microRNAs片段，则不发生催化茎环自组装反应；
优选地，步骤S2)中所述茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链，分别为H1和H2；
所述H1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
所述H2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
优选地，步骤S2)中所述催化茎环自组装的条件包括：
将含有茎环DNA溶液在90～95℃下加热反应3～5分钟后，快速冰浴冷却3～5分钟，然后加入待测物，在室温下反应1～2小时；
优选地，步骤S3)中修饰有蔗糖转化酶的DNA包括至少2条修饰有蔗糖转化酶的DNA短链；
步骤S3)中所述茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链；
所述待测物中含有microRNAs片段，所述产物I的末端触发修饰有蔗糖转化酶的DNA和茎环DNA的杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的线性长链；或
所述待测物中不含microRNAs片段，则不发生杂交链式反应；
优选地，步骤S3)中所述茎环DNA包括至少两条茎环DNA长链，分别为H3和H4；
所述H3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
所述H4的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；
步骤S3)中所述修饰有蔗糖转化酶的DNA包括至少2条修饰有蔗糖转化酶的DNA短链，分别为cDNA1、cDNA2；
所述cDNA1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；
所述cDNA2的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；
优选地，步骤S3)中所述杂交反应条件包括：
将含有茎环DNA溶液90～95℃下加热反应3～5分钟后，快速冰浴冷却3～5分钟后，然后加入修饰有蔗糖转化酶的DNA反应25～35分钟，最后加入试剂盒中，在室温下反应3～4小时；
优选地，所述待测物中含有microRNAs片段，测得葡萄糖浓度；或
所述待测物中不含microRNAs片段，测量结果为空白值或背景值；
优选地，步骤S3)中通过血糖仪测定葡萄糖的浓度；
优选地，步骤S3)中通过血糖仪测定葡萄糖的浓度，以确认待测物中是否含有microRNAs和/或待测物中microRNAs的含量。
7.根据权利要求6所述的microRNAs的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用权利要求1至5任一项所述的试剂盒。
8.根据权利要求6所述的microRNAs的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
1)获得肽核酸PNA修饰的试剂盒；
2)在所述试剂盒中，添加待测物；
如待测物中含有目标microRNAs片段，触发由茎环DNA参与的催化茎环自组装反应，得到的产物被肽核酸PNA捕获；
如待测物中不含有目标microRNAs片段，则不发生催化茎环自组装反应；
3)通过步骤2)得到产物，使得修饰有蔗糖转化酶的DNA与所述茎环DNA在所述试剂盒中进行杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链；或
不发生杂交链式反应；
4)在所述试剂盒中添加蔗糖，蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖，葡萄糖的最终浓度，以此确定是否含有目标microRNAs和/或目标microRNAs的含量；
优选地，所述检测方法包括：
1)获得肽核酸探针PNA修饰的试剂盒；
2)在所述试剂盒中，添加待测物；
如待测物中含有目标microRNAs片段，所述目标microRNAs片段触发由H1和H2参与的催化茎环自组装反应，得到H1+H2双链产物，并被肽核酸探针PNA捕获；
如待测物中不含有目标microRNAs片段，则不发生催化茎环自组装反应；
3)获得修饰有蔗糖转化酶的cDNA1和cDNA2，将cDNA1和cDNA2分别与H3和H4杂交，得到H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物；
4)将所述试剂盒中的H1+H2双链产物与H3+cDNA1，H4+cDNA2的双链杂交产物进行杂交链式反应，得到负载有蔗糖转化酶的纳米级线性长链；或
不发生杂交链式反应；
5)在所述试剂盒中添加蔗糖，待蔗糖转化酶将蔗糖转化为葡萄糖后，测定葡萄糖的最终浓度，以此确定是否含有目标microRNAs和/或目标microRNAs的含量；
进一步优选地，步骤1)包括：
通过固相多肽合成技术制备得到PNA序列，PNA与试剂盒底部的氨基基团反应，偶联，即得到PNA修饰的试剂盒；
优选地，所述修饰有蔗糖转化酶的DNA，通过将蔗糖转化酶与DNA复合物通过磺基-SMCC偶联得到；
优选地，所述方法还包括：
将试剂盒中的各核苷酸与不同浓度的目标microRNAs片段进行杂交，建立标准曲线来确定试剂盒灵敏度的步骤；
优选地，microRNAs浓度范围为：1fM～10nM，肽核酸探针PNA浓度为1μM，H1和H2浓度为400nM，H3+cDNA1和H4+cDNA2浓度为1μM。
9.权利要求1至4任一项所述的microRNAs检测试剂盒适用于血清中循环microRNAs的液体活检。
10.权利要求5至8任一项所述的microRNAs的检测方法适用于血清中循环microRNAs的液体活检。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249443A (zh) * 2021-05-20 2021-08-13 中国科学技术大学 基于dna自组装的预制放大单元的扩增检测方法
CN114414557A (zh) * 2022-01-20 2022-04-29 重庆医科大学 基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料在电致化学发光检测miRNA中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107574227A (zh) * 2017-10-10 2018-01-12 武汉大学 一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107574227A (zh) * 2017-10-10 2018-01-12 武汉大学 一种基于级联杂交链式反应的核酸分析方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNXUE LIU: "Digital quantitative detection of serum circulating miRNAs using dual-enhanced magnetobiosensors based on cascaded nucleic acid circuits", 《CHEM.COMM.》 *
HONG CHENG: "Mesoporous Silica Containers and Programmed Catalytic Hairpin Assembly/Hybridization Chain Reaction Based Electrochemical Sensing Platform for MicroRNA Ultrasensitive Detection with Low Background", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
XI ZHU: "Sensitive and portable detection of telomerase activity in HeLa cells using the personal glucose meter", 《CHEM.COMM.》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249443A (zh) * 2021-05-20 2021-08-13 中国科学技术大学 基于dna自组装的预制放大单元的扩增检测方法
CN114414557A (zh) * 2022-01-20 2022-04-29 重庆医科大学 基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料在电致化学发光检测miRNA中的应用
CN114414557B (zh) * 2022-01-20 2022-12-16 重庆医科大学 基于二维的金属有机框架锌卟啉配合物纳米材料在电致化学发光检测miRNA中的应用

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