KR102559020B1 - 산화그래핀 및 압타머와 G-quadruplex 핵산 구조체 기반 혼성연쇄반응을 이용한 표적물질 검출방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타머 헤어핀프로브, 상기 압타머 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제1 헤어핀프로브 및 상기 제1 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제2 헤어핀프로브를 이용한 혼성연쇄반응을 통하여 G-quadruplex 구조체를 형성시키고, 이를 특이적으로 인식하는 신호물질을 이용하여 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서는 종래 압타머 기반의 표적물질 검출방법에 비하여 다양한 반응 조건에서 간편하고 저렴하게 표적물질의 검출이 가능하다. 또한, 산화그래핀을 도입하여 반응에 참여하지 않는 헤어핀프로브를 흡착시키는 바, 종래 혼성연쇄반응에 비해 비특이적인 혼성연쇄반응을 효과적으로 방지할 수 있는 장점이 있다.
Description
본 발명은 산화그래핀 및 압타머와 G-quadruplex 핵산 구조체 기반 혼성연쇄반응 (Graphene oxide and aptamer/G-quadruplex-based hybridization chain reaction, 이하 'GQ-HCR'로도 기재됨)을 이용한 표적물질 검출방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타머 헤어핀프로브, 상기 압타머 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제1 헤어핀프로브 및 상기 제1 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제2 헤어핀프로브를 이용하여 표적물질과 함께 G-quadruplex 핵산 구조체를 형성시키되, 산화그래핀을 추가로 도입하여 표적물질의 검출 감도를 현저히 향상시킨 산화그래핀 및 압타머와 G-quadruplex 핵산 구조체 기반 혼성연쇄반응을 이용한 표적물질 검출방법에 관한 것이다.
압타머는 그 자체로 안정된 이차구조를 가지면서 표적물질에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특성을 가진 약 20 - 60 mer 길이의 단일 가닥의 핵산 (DNA 혹은 RNA)이다. 압타머는 1990년 Larry Gold 연구팀에 의해 개발된 Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)라는 압타머 스크리닝 기술을 통해 처음 개발되었으며, 그 이후 저분자 유기물, 금속 이온, 펩타이드, 단백질 등 다양한 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 수많은 압타머들이 발굴되었다. 이러한 압타머들은 보통 pM 수준의 높은 결합력을 갖기 때문에 항체를 대체할 수 있는 물질로 각광받고 있다. 항체와는 달리, 압타머는 화학적 합성 방법을 통해 제조되기 때문에 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, 변형 (modification)이 용이하다. 또한, 물리적/화학적 환경에 대한 안정성이 매우 높아 실온에서의 장시간 보관 및 운반이 가능하기 때문에 장시간 반복 사용이 요구되는 현장 진단용으로의 응용이 매우 유리하다는 장점이 있다.
최근에는, 표적물질-압타머의 상호작용을 기반으로 한 표적물질 검출기술이 활발하게 연구되고 있다. 대표적으로, 금 또는 탄소 나노입자 등에 고정화가 용이한 압타머의 특성을 이용하여, 나노입자 기반의 압타머를 활용한 표적물질 검출기술이 다양하게 개발되었다. 하지만 이는 검출 민감도가 좋지 못하며, 반응 버퍼 조건에서 압타머를 고정한 나노입자의 불안정으로부터 야기된 착오 신호가 발생한다는 문제점이 있다(Wang, Y., Li, H., & Xu, D., Analytica chimica acta, 905, 149-155.(2016); Yi, Y., et al., Analytical Methods, 5(10), 2477-2484.(2013)). 한편, 높은 민감도를 위해 증폭 반응을 유도하는 효소들을 사용한 압타머 기반 표적물질 검출기술들도 활발히 개발되어 왔다. 하지만 이는 pH, 반응 온도, 버퍼 조건 등에 제한적이고, 잡음 (noise signal)이 크다는 단점이 있다(Lee, J., et al., Analytical chemistry, 82(1), 197-202.(2010); Yao, L. Y., et al., Analytical Methods, 7(20), 8786-8792.(2015)).
한편, 현재 범죄현장에 유류된 상피세포 증거물을 특이적으로 검출하여 범인을 식별할 증거로 활용하는 방안이 아직 확립되어 있지 않은 상황이다.
이에, 본 발명자들은 상기 언급한 종래 기술들의 한계를 극복하기 위하여 예의 노력한 결과, 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타머 헤어핀프로브, 상기 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제1 헤어핀프로브 및 상기 제1 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제2 헤어핀프로브를 이용하는 경우 표적물질과 함께 G-quadruplex 핵산 구조체를 형성하고, 혼성연쇄반응 기반의 G-quadruplex 핵산 구조체 증폭을 통해 표적물질 특이적 검출 신호를 효과적으로 증폭시킬 수 있으며, 산화그래핀을 추가로 도입하여 비특이적 반응을 효과적으로 억제할 수 있으며, 상기 GQ-HCR 기술 및 티오플라빈 T(ThT)를 모두 이용하면 상피세포를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 표적물질을 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있는 신규한 혼성연쇄반응 조성물과 키트 및 이를 이용하여 표적물질을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상피세포를 높은 특이도와 민감도로 검출할 수 있는 신규한 조성물 및 이를 이용하여 상피세포를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적물질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 트리거-1 염기서열을 포함하는 압타머 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브;
및 상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브를 포함하는, 표적물질 검출용 조성물을 제공한다.
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브;
및 상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브를 포함하는, 표적물질 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 표적물질 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 혼성연쇄반응을 이용한 표적물질 검출방법을 제공한다:
(a) 표적물질을 상기 조성물과 혼성연쇄반응시키는 단계; 및
(b) 상기 혼성연쇄반응에 의해 형성된 G-quadruplex 구조체를 측정하는 단계.
본 발명은 또한, 상피세포 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 트리거-1 염기서열을 포함하는 압타머 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브; 및
티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)를 포함하는, 상피세포 검출용 조성물을 제공한다.
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브; 및
티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)를 포함하는, 상피세포 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상피세포 함유 시료를 상기 상피세포 검출용 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 상피세포 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 표적물질 검출방법은 종래의 나노입자 및 효소를 이용한 압타머 기반의 표적물질 검출방법에 비해 보다 안정적이고 여러 반응조건에 제한 없이 보다 저렴하고 간편하게 표적물질 검출이 가능한 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 표적물질 검출방법은 형광물질이 수식되어 있는 핵산 프로브의 고정화나 형광물질 표지 또는 핵산을 증폭시키는 효소를 필요로 하지 않고 비 효소(Enzyme-free) 및 비 표지(Label-free)로 검출이 가능하다. 또한, 본 발명에서는 산화그래핀을 이용하여 반응에 참여하지 않는 헤어핀프로브들을 흡착시킴으로써 비특이적인 반응을 획기적으로 방지할 수 있다는 점에서 의의가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 표적물질 검출방법은 질병 유래 단백질, 상피세포 등의 세포 막단백질, 소 분자 (small molecule), 금속 이온 등 압타머로 검출 가능한 모든 물질을 표적으로 삼을 수 있어 다양한 분야에서 활용이 가능하고 범용성이 뛰어난 기술이라는 점에서 의의가 있다.
또한, 본 발명에 따른 상피세포 검출용 조성물을 범죄현장에서 법광원과 함께 이용하면 상피세포 증거물의 시각화에 활용할 수 있고, 나아가 과학수사의 발전에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 GQ-HCR 기술의 반응을 이용하여 표적물질을 검출하는 방법 도식화한 것이다. 구체적으로, (A)는 표적물질이 존재하지 않을 경우, 혼성연쇄반응이 진행되지 않아 헤어핀프로브 (HP, H1, H2)가 모두 산화그래핀에 흡착되어있으며 형광 신호가 발생하지 않는 것을 나타낸 것이고, (B)는 표적물질이 존재할 경우 HP와 표적물질의 결합에 의해 유도되는 혼성연쇄반응으로 산화그래핀에 흡착되어있는 H1과 H2가 연쇄적으로 반응하면서 혼성연쇄반응 산물에 G-quadruplex 구조체가 형성되고, 형성된 G-quadruplex 구조체에 결합하는 형광물질에 의해 강한 형광 신호가 발생하는 것을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 유효성 실험 결과를 나타낸 것이다. 다양한 반응 조건 (a: H1+H2; b: 표적물질 + HP + H2; c: 표적물질 + HP +H1; d: HP + H1 + H2; e: 표적물질 + HP + H1 + H2)에 따른 형광 신호 발생 여부를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 표적물질 검출 민감도를 나타낸 것으로, (a)에서는 파장 분포에 따른 형광 강도를 다양한 농도의 표적물질을 이용하여 확인하였고, (b)에서는 표적물질의 농도 의존적 형광 강도의 변화를 확인하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 표적물질 검출 특이도 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 표적물질 특이적 검출 효과를 상피세포의 표적 막단백질을 이용하여 확인한 결과이다. SK-BR-3: 표적 막단백질 (HER2) 발현 세포, MDA-MB-231: 표적 막단백질 (HER2) 비발현 세포.
도 6은 GQ-HCR 기술의 산화그래핀 유무에 따른 신호 대 잡음 비 (Signal-to-Noise Ratio; S/N ratio) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 GQ-HCR 기술 및 티오플라빈 T (Thioflavin T, ThT)를 모두 이용하여 표적 상피세포를 검출하는 방법을 도식화한 것이다. 보다 구체적으로, (A)는 상피세포 표면에 발현된 막단백질을 매개로 개시되는 GQ-HCR 반응에 의해 만들어지는 혼성연쇄반응의 산물에 G-quadruplex 구조체가 형성되며, 형성된 G-quadruplex 구조체와 ThT의 상호작용을 통해 강한 형광 신호가 발생하는 것을 나타낸 것이고, (B)는 상피세포 내부물질과 ThT의 직접 상호작용을 통해 강한 형광 신호가 발생하는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 GQ-HCR과 ThT를 모두 이용한 상피세포의 검출 유효성 실험 결과를 나타낸 것이다. 다양한 반응 조건 (a: 표적 상피세포(HaCaT cell)가 없는 조건; b: ThT가 없는 조건; c: 헤어핀프로브(HP, H1, H2)가 없는 조건; d: 헤어핀프로브 중 HP를 표적 막단백질(HER2)에 결합하지 못하는 무작위 서열로 대체한 조건; e: 표적 상피세포, ThT, 헤어핀프로브가 모두 포함된 조건)에 따른 형광 신호 발생 여부를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 상피세포 검출용 조성물에 포함된 ThT와 상피세포 내부단백질의 상호작용을 검증하기 위한 실험 결과를 나타낸 것이다. 다양한 농도의 표적 상피세포 내부단백질(keratin)을 포함하는 분석 시료에서 측정한 492 nm 형광 신호의 세기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 상피세포 검출용 조성물을 이용한 표적 상피세포의 검출 민감도를 나타낸 것으로, (a)에서는 파장 분포에 따른 형광 강도를 다양한 농도의 표적 상피세포를 이용하여 확인하였고, (b)에서는 표적 상피세포의 농도에 따른 492 nm에서의 형광 강도의 변화를 확인한 결과를 나타내었다.
도 11은 상피세포 검출용 조성물을 이용하여 시각화한 다양한 농도의 상피세포를 450 nm 법광원과, 492 nm 부근의 파장을 선택적으로 투과하는 차폐 필터로 관찰한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 법광원을 조사하기 전의 상피세포를 촬영한 것이고, (b)는 법광원 조사 후 차폐 필터를 통해 관찰한 상피세포를 촬영한 것이고, (c)는 (a)와 (b)에서 관찰되는 각 반응 용액이 포함하는 상피세포의 농도를 나타낸 표이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 유효성 실험 결과를 나타낸 것이다. 다양한 반응 조건 (a: H1+H2; b: 표적물질 + HP + H2; c: 표적물질 + HP +H1; d: HP + H1 + H2; e: 표적물질 + HP + H1 + H2)에 따른 형광 신호 발생 여부를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 표적물질 검출 민감도를 나타낸 것으로, (a)에서는 파장 분포에 따른 형광 강도를 다양한 농도의 표적물질을 이용하여 확인하였고, (b)에서는 표적물질의 농도 의존적 형광 강도의 변화를 확인하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 표적물질 검출 특이도 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 GQ-HCR 기술의 표적물질 특이적 검출 효과를 상피세포의 표적 막단백질을 이용하여 확인한 결과이다. SK-BR-3: 표적 막단백질 (HER2) 발현 세포, MDA-MB-231: 표적 막단백질 (HER2) 비발현 세포.
도 6은 GQ-HCR 기술의 산화그래핀 유무에 따른 신호 대 잡음 비 (Signal-to-Noise Ratio; S/N ratio) 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 GQ-HCR 기술 및 티오플라빈 T (Thioflavin T, ThT)를 모두 이용하여 표적 상피세포를 검출하는 방법을 도식화한 것이다. 보다 구체적으로, (A)는 상피세포 표면에 발현된 막단백질을 매개로 개시되는 GQ-HCR 반응에 의해 만들어지는 혼성연쇄반응의 산물에 G-quadruplex 구조체가 형성되며, 형성된 G-quadruplex 구조체와 ThT의 상호작용을 통해 강한 형광 신호가 발생하는 것을 나타낸 것이고, (B)는 상피세포 내부물질과 ThT의 직접 상호작용을 통해 강한 형광 신호가 발생하는 것을 나타낸 것이다.
도 8은 GQ-HCR과 ThT를 모두 이용한 상피세포의 검출 유효성 실험 결과를 나타낸 것이다. 다양한 반응 조건 (a: 표적 상피세포(HaCaT cell)가 없는 조건; b: ThT가 없는 조건; c: 헤어핀프로브(HP, H1, H2)가 없는 조건; d: 헤어핀프로브 중 HP를 표적 막단백질(HER2)에 결합하지 못하는 무작위 서열로 대체한 조건; e: 표적 상피세포, ThT, 헤어핀프로브가 모두 포함된 조건)에 따른 형광 신호 발생 여부를 확인한 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 상피세포 검출용 조성물에 포함된 ThT와 상피세포 내부단백질의 상호작용을 검증하기 위한 실험 결과를 나타낸 것이다. 다양한 농도의 표적 상피세포 내부단백질(keratin)을 포함하는 분석 시료에서 측정한 492 nm 형광 신호의 세기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 상피세포 검출용 조성물을 이용한 표적 상피세포의 검출 민감도를 나타낸 것으로, (a)에서는 파장 분포에 따른 형광 강도를 다양한 농도의 표적 상피세포를 이용하여 확인하였고, (b)에서는 표적 상피세포의 농도에 따른 492 nm에서의 형광 강도의 변화를 확인한 결과를 나타내었다.
도 11은 상피세포 검출용 조성물을 이용하여 시각화한 다양한 농도의 상피세포를 450 nm 법광원과, 492 nm 부근의 파장을 선택적으로 투과하는 차폐 필터로 관찰한 결과를 나타낸 것으로, (a)는 법광원을 조사하기 전의 상피세포를 촬영한 것이고, (b)는 법광원 조사 후 차폐 필터를 통해 관찰한 상피세포를 촬영한 것이고, (c)는 (a)와 (b)에서 관찰되는 각 반응 용액이 포함하는 상피세포의 농도를 나타낸 표이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 산화그래핀 및 압타머와 G-quadruplex 핵산 구조체 기반 혼성연쇄반응 (Graphene oxide and aptamer/G-quadruplex-based hybridization chain reaction, GQ-HCR) 기술을 통해 표적물질을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로 본 발명에서는 표적물질에 특이적으로 결합할 수 있는 압타머를 포함하는 압타머 헤어핀프로브, 상기 압타머 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제1 헤어핀프로브 및 상기 제1 헤어핀프로브와 부분 혼성화하는 제2 헤어핀프로브를 이용하여, 표적물질과 G-quadruplex 핵산 구조체를 형성시키고, 혼성연쇄반응 기반의 G-quadruplex 핵산 구조체 증폭을 통해 표적물질 특이적 검출 신호를 효과적으로 증폭시켰으며, 산화그래핀을 도입하여 비특이적 반응을 효과적으로 억제하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 표적물질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 트리거-1 염기서열을 포함하는 압타머 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브; 및
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브를 포함하는, 표적물질 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브; 및
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브를 포함하는, 표적물질 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 조성물을 포함하는 표적 물질 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 산화그래핀을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 GQ-HCR에 사용되는 헤어핀프로브가 반응에 참여하는 경우에만 반응용액에 노출될 수 있도록, 단일 가닥의 핵산과 흡착하는 성질이 있는 산화그래핀을 도입함으로써, 비특이적 증폭 반응을 억제하기 위한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 PBS, NaCl, MgCl2 을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 압타머 헤어핀프로브는 'HP'로도 표시될 수 있으며, 압타머 및 트리거-1 염기서열을 포함하되, 압타머와 트리거-1 염기서열 사이에 스페이스 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 압타머 헤어핀프로브는 도 1에 도시된 바와 같이 압타머 염기서열의 일부와 트리거-1 염기서열의 일부가 혼성화되어 헤어핀 구조를 형성한다.
본 발명에서, 상기 제1 헤어핀프로브는 상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함한다. 이 경우, 상기 제1 헤어핀프로브는 도 1에 도시된 바와 같이 상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열의 일부와 트리거-2 염기서열의 일부가 혼성화되어 헤어핀 구조를 형성한다.
본 발명에서, 상기 제2 헤어핀프로브는 상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함한다. 이 경우, 상기 제2 헤어핀프로브는 도 2에 도시된 바와 같이 상기 트리거-2에 상보적인 염기서열의 일부와 트리거-1 염기서열의 일부가 혼성화되어 헤어핀 구조를 형성한다.
본 발명에서, 상기 트리거-1 염기서열은 '혼성연쇄반응 유발 염기서열-1'으로도 표현될 수 있고, 상기 트리거-2 염기서열은 '혼성연쇄반응 유발 염기서열-2'로도 표현될 수 있다. 본 발명에서 상기 트리거-1 염기서열은 압타머 헤어핀프로브가 표적물질과 결합하여 노출되고, 상기 노출된 트리거-1 염기서열에 제1 헤어핀프로브가 결합하며 트리거-2 염기서열이 노출되고, 노출된 트리거-2 염기서열에 제2 헤어핀프로브가 결합되며 결합된 제2 헤어핀프로브의 트리거-1 염기서열이 노출되고, 여기에 또 다른 제1 헤어핀프로브가 결합하며 해당 트리거-2 염기서열이 노출되는 것과 같이, 이들 트리거 염기서열에 의해 혼성연쇄반응이 유발된다.
본 발명에서는 표적물질이 존재하지 않는 경우, 3 종의 헤어핀프로브 (HP, H1, H2)이 산화그래핀에 흡착되어 있어 반응에 참여하지 않는다. 그러나, 표적물질이 존재하는 경우, 산화그래핀에 흡착되어 있는 압타머 헤어핀프로브가 표적물질과의 결합에 의해 반응용액에 노출된다. 이 때 트리거-1 염기서열은 압타머 헤어핀프로브가 표적물질과 결합하여 구조가 변형되며 노출되게 되는데, 이와 같이 노출된 트리거-1 염기서열은 제1 헤어핀프로브의 발판가닥 (toehold region)에 결합하며 가닥 치환 반응 (strand displacement)에 의해 제1 헤어핀프로브가 개방 (hairpin probe opening)되어 G-rich 염기서열 및 트리거-2 염기서열이 노출된다. 노출된 트리거-2 염기서열은 제2 헤어핀프로브의 발판가닥에 결합하며, 가닥 치환 반응에 의해 제2 헤어핀프로브가 개방되어 G-rich 염기서열 및 트리거-1 염기서열이 노출된다. 이러한 반응으로, 제1 헤어핀프로브에 삽입되어있는 트리거-2 염기서열과 제1 헤어핀프로브에 삽입되어 있는 트리거-1 염기서열이 연속적으로 노출되어 연쇄적으로 제1 헤어핀프로브와 제2 헤어핀프로브를 개방시키며, 결과적으로 혼성연쇄반응 산물인 이중 가닥의 핵산이 생성되고 다량의 G-rich 염기서열이 자유롭게 노출되게 된다. 자유로운 G-rich 염기서열은 G-quadruplex 구조체를 형성하며, G-quadruplex에 특이적으로 결합하여 강한 형광 신호를 발생하는 형광 물질 (Thioflavin T, ThT)을 도입함으로써, ThT로부터 증폭된 강한 형광 신호를 확인할 수 있다.
따라서, 상기 조성물은 상기 압타머 헤어핀프로브, 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브가 반응하여 생성되는 산물에 특이적으로 결합하는 신호물질을 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 여기서 상기 생성되는 산물은 G-quadruplex 구조체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 신호물질은 방사성 표지(radiolabel), 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 영상화제(imaging agent) 및 금속 이온(metal ion)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 신호물질은 티오플라빈 T (Thioflavin T, ThT)일 수 있다. 티오플라빈 T는 상기 혼성연쇄반응에 의해 생성되는 G-quadruplex 구조체에 특이적으로 결합하여 형광 신호를 증폭시킴으로써 비 효소 (Enzyme-free) 및 비 표지 (Label-free)의 고감도 검출 시스템을 구현할 수 있다. 이 경우, G-quadruplex 구조체에 특이적으로 결합해 강한 형광 신호를 보이는 신호물질이라면, 티오플라빈 T를 대체할 수 있는 다른 형광물질을 첨가하는 것도 가능할 것이다.
즉, 본 발명에서, 상기 프로브는 별도의 신호물질로 수식되어, 표적물질의 존재 하에 혼성연쇄반응하여 자체적으로 신호를 발생시킬 수 있으나, 또 다른 양태로서 별다른 신호물질의 수식 없이 혼성연쇄반응하여 G-quadruplex 핵산 구조체를 형성하고, 여기에 신호물질이 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 G-rich 염기서열은 3 내지 50, 바람직하게는 5 내지 30, 더욱 바람직하게는 7 내지 15, 가장 바람직하게는 12개의 구아닌(G)으로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 표적물질은 단백질, 펩타이드, 금속 이온, 저분자 유기물 및 소분자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질이나 펩타이드는 질병 특이적 단백질 또는 펩타이드일 수 있으며, 이 경우 본 발명은 질병 진단 용도로 활용 가능할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질이나 펩타이드는 세포 막단백질, 예컨대, EpCAM 또는 HER2 일 수 있으며, 예를 들어 세포 표면에 일부가 노출되도록 발현되는 세포 막단백질일 수 있고, 이 경우 세포의 파쇄 없이 상기 단백질이나 펩타이드를 검출이 가능한 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 산화그래핀에 흡착되어 있는, 혼성연쇄반응 유발 염기서열-1 (트리거-1) 및 표적물질에 특이적인 압타머 염기서열이 수식된 헤어핀프로브 (압타머 헤어핀프로브, HP)가 표적물질과의 결합에 의해 반응용액에 노출되고 HP의 구조가 변형되어 트리거-1 염기서열이 노출되고; 상기 노출된 트리거-1 염기서열에 의해, 산화그래핀에 흡착되어있는 트리거-1과 상보적인 염기서열, G-rich 염기서열 및 혼성연쇄반응 유발 염기서열-2 (트리거-2)가 수식된 헤어핀프로브 (HCR 헤어핀-1, 이하 H1)와 트리거-1 서열, G-rich 염기서열 및 트리거-2와 상보적인 염기서열이 수식된 헤어핀프로브 (HCR 헤어핀-2, 이하 H2)가 연쇄적으로 반응용액에 노출되며 혼성화 반응이 일어나며; 상기 혼성연쇄반응에 의해 생성되는 산물이 G-quadruplex 구조체를 형성하고, G-quadruplex 구조체에 특이적으로 결합해 강한 형광 신호를 보이는 형광 물질을 첨가하여 형광 신호를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서 다음 단계를 포함하는 혼성연쇄반응을 이용한 표적물질 검출방법에 관한 것이다:
(a) 표적물질을 상기 조성물과 혼성연쇄반응시키는 단계; 및
(b) 상기 혼성연쇄반응에 의해 형성된 G-quadruplex 구조체를 측정하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계는
(i) 압타머 헤어핀프로브를 표적물질과 반응시켜 압타머 헤어핀프로브의 트리거-1 염기서열을 노출시키는 단계; 및 (ii) 상기 (i)단계에서 노출된 트리거-1 염기서열에 의해, 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브가 연쇄적으로 개방되어 혼성연쇄반응(hybridization chain reaction)을 유발시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다(도 1).
본 발명에 있어서, 상기 혼성연쇄반응은
i) 압타머 헤어핀프로브의 트리거-1 염기서열이 제1 헤어핀프로브의 트리거-1 염기서열과 상보적인 염기서열에 결합하여 트리거-2 염기서열이 노출되는 단계;
ii) 상기 노출된 트리거-2 염기서열이 제2 헤어핀프로브의 트리거-2 염기서열과 상보적인 염기서열에 결합하여 트리거-1 염기서열이 노출되는 단계; 및
iii) 상기 노출된 트리거-1 염기서열이 제1 헤어핀프로브의 트리거-1 염기서열과 상보적인 염기서열에 결합하여 트리거-2 염기서열이 노출되는 단계를 포함하며, ii) 및 iii) 단계를 반복함으로써 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브가 연쇄적으로 개방되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 헤어핀프로브가 개방되는 것이란 제1 헤어핀프로브의 트리거-2 염기서열 및 G-rich 염기서열이 노출되는 것을 의미하며, 상기 제2 헤어핀프로브가 개방되는 것이란 제2 헤어핀프로브의 트리거-1 염기서열 및 G-rich 염기서열이 노출되는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 GQ-HCR 기술은 표적물질에 특이적인 압타머 서열을 포함하는 압타머 헤어핀프로브를 이용하여 등온 (isothermal), 비 효소 (enzyme-free) 신호 증폭 반응인 혼성연쇄반응을 유도한다. 이를 좀 더 상세히 서술하면, 표적물질이 존재하는 경우, 표적물질에 의해 압타머 서열이 포함되어 있는 압타머 헤어핀프로브의 헤어핀 구조가 풀려 선형화되고, 이와 같이 선형화된 압터머 헤어핀프로브에 또 다른 2 종의 헤어핀프로브가 반응하여 혼성연쇄반응이 작동하도록 디자인 되었다. 이 경우, 상기 2 종의 추가되는 헤이핀 프로브는 다량의 구아닌 염기서열 (이하 G-rich 염기서열)이 삽입되어 있어 혼성연쇄반응 산물이 효과적으로 G-quadruplex 구조체로 형성될 수 있다. 한편, 본 발명에서는 G-quadruplex 구조체에 특이적으로 결합하는 형광 물질을 도입하게 되는데, 표적물질에 압타머 헤어핀 그래핀이 결합하고 추가로 2 종의 헤어핀프로브가 결합함으로써 증폭되는 혼성연쇄반응으로 생성되는 G-quadruplex 구조체에 상기 형광 물질이 결합하며 강한 형광 신호가 발생되어, 상기 형광 신호를 측정함으로써 표적물질을 검출하게 된다.
한편, 상기 반응은 산화그래핀을 포함하는 반응 조성물에서 진행되는 것이 바람직하다. 이 경우, 표적물질이 존재하지 않는 조건에서는 3 종의 헤어핀 (HP, H1, H2)이 산화그래핀에 흡착되어 있어 반응에 참여하지 않는 반면, 표적물질이 존재하는 경우, 산화그래핀에 흡착되어 있는 HP가 표적물질과의 결합에 의해 반응용액에 노출된다.
본 발명에 있어서, 상기 표적물질은 질병 유래 단백질, 세포막단백질, 소 분자, 금속이온으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 세포막단백질은 바람직하게는 EpCAM 및 HER2 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 표적물질이 존재하지 않는 경우, 상기 압타머 헤어핀프로브, 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브는 산화그래핀에 흡착되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 압타머 헤어핀프로브는 트리거-1 염기서열 및 표적물질과 결합하는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 헤어핀프로브는 트리거-1 염기서열과 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제2 헤어핀프로브는 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 G-quadruplex 구조체는 G-rich 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 G-quadruplex 구조체는 신호물질로 검출하고, 상기 신호물질은 방사성 표지(radiolabel), 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 영상화제(imaging agent) 및 금속 이온(metal ion)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 신호물질은 티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 특정 염기서열의 압타머 헤어핀프로브, 제1 헤어핀프로브, 제2 헤어핀프로브를 사용하였으나, 본 발명의 도 1에 도시한 바와 같은 혼성연쇄반응이 가능한 염기서열의 조합을 사용하는 경우, 본 발명이 다양한 방식으로 구현 가능하다는 것은 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
한편, 범죄현장에서 범인을 식별할 증거로 활용하기 위하여, 유류된 상피세포를 특이적으로 검출하는 것은 쉽지 않은 실정이며, 본 발명의 일 실시예에서는 ThT를 포함하지 않고 3종의 헤어핀프로브(HP, H1, H2)만을 포함하는 조성물을 사용한 경우 매우 낮은 형광신호가 발생하므로(조건 b) 상피세포를 검출하는 데 한계가 있는 반면, 3종의 헤어핀프로브(HP, H1, H2) 및 ThT를 모두 포함하는 조성물을 사용한 경우 더욱 강한 형광 신호가 발생하므로(조건 e) 효과적으로 상피세포를 검출할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명에서는 (a) 상피세포 표면에 발현된 막단백질을 매개로 한 GQ-HCR 반응에 의해 형성된 G-quadruplex와 ThT의 상호작용으로 인해 발생하는 형광신호 및 (b) ThT와 상피세포 내부물질과의 상호작용으로 인해 발생하는 형광신호를 모두 측정함으로써 상피세포를 검출하였다(실시예 8, 도 7 및 도 8).
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 상피세포 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 트리거-1 염기서열을 포함하는 압타머 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브; 및
티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)를 포함하는, 상피세포 검출용 조성물에 관한 것이다.
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브; 및
티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)를 포함하는, 상피세포 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 상피세포 단백질은 상피세포 막단백질인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 EpCAM 또은 HER2 일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 티오플라빈 T는 상피세포 내부물질과 반응하여 신호를 발생시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용된 티오플라빈 T (Thioflavin T, ThT)는 G-quadruplex와의 상호작용을 통해 형광 신호를 낼 수 있는 물질일 뿐만 아니라, 상피세포 내부에 존재하는 keratin과 같은 내부물질과의 상호작용을 통해 형광신호를 발생시킬 수 있는 물질이다.
본 발명에 있어서, 상기 상피세포 내부물질은 ThT와 결합하여 형광 신호를 발생시키는 물질을 모두 포함하며, 용어 "내부"는 세포막 안에 존재하는 세포질, 핵 및 기타 세포 기관을 의미한다. 상기 상피세포 내부물질은 바람직하게는 내부단백질이며, 더 바람직하게는 keratin일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상피세포 함유 시료를 상기 상피세포 검출용 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 상피세포 검출방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. GQ-HCR 기술 반응 조건 확립
본 발명에 따른 GQ-HCR 기술의 반응 용액 제조 과정은 다음과 같다.
10 mM PBS (pH 6.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2를 포함하는 반응 완충 용액에 HP (1 μM) 0.9 μL, H1 (10 μM) 1.2 μL, H2 (10 μM) 1.5 μL, 산화그래핀 (1 mg/mL) 3.6 μL 및 다양한 농도의 표적물질 6 μL를 반응 완충 용액에 첨가하여 반응 용액 (최종 30 μL)은 제조하고, 37℃에서 1 시간 동안 반응을 진행시킨다. 반응이 완료된 후, 상기 반응 용액에 ThT (2.5 mM) 1.5 uL를 첨가하고, ThT로부터 발생하는 형광 신호 세기를 측정함으로써, 최종 G-quadruplex 구조체 생성량을 분석하였다.
본 GQ-HCR 기술 개발을 위해 사용된 핵산 프로브의 염기서열 정보는 다음과 같으며, 이에 한정되지는 않는다.
HP: 5’-GTA GCC TGA AGC CAA ACC AAA AAA AAA AAC AGG CTA CGG CAC GTA GAG CAT CAC CAT GAT CCT G-3’ (서열번호 1)
H1: 5’-TGG TTT GGC TTC AGG CTA CGG CTG GGT AGG GCG GGT TGG GAA AAA TCC AGC CGT AGC CTG-3’ (서열번호 2)
H2: 5’- GCC GTA GCC TGA AGC CAA ACC ATG GGT AGG GCG GGT TGG GAA ACA GGC TAC GGC TGG ATT-5’ (서열번호 3)
실시예 2. GQ-HCR 기술의 유효성 검증
실시예 1에서 언급된 반응 조건을 이용하여 본 기술의 유효성 검증 실험을 진행하였다. 이를 위해 Platelet-derived growth factor BB (이하 PDGF-BB)를 표적물질로 삼아 유효성 검증 실험을 진행하였다. 다양한 반응 조건 (a ~ e)에 따른 실험을 수행한 결과, 표적물질인 PDGF-BB, HP, H1, H2를 모두 포함하는 반응 조건 (e)에서 월등히 높은 형광 신호가 발생하는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 3. GQ-HCR 기술의 표적물질 검출 민감도 검증
실시예 1에서 언급된 반응 조건을 이용하여 본 기술의 민감도 검증 실험을 진행하였다. 다양한 농도 (50 pM ~ 20 nM)의 표적물질 (PDGF-BB)을 포함하는 분석 시료를 제조한 후 분석 반응을 수행한 결과, 본 기술의 표적물질 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 4.53 pM인 것을 확인하였으며, 이는 기존 기술들에 필적할 만한 우수한 수준의 성능임을 확인하였다(도 3).
실시예 4. GQ-HCR 기술의 표적물질 검출 특이도 검증
실시예 1에서 언급된 반응 조건을 이용하여 본 기술의 선택도 검증 실험을 진행하였다. 400 nM의 표적이 아닌 물질 (Thrombin, BSA, Cytochrome C, Lysozyme, Immunoglobulin G) 및 20 nM의 PDGF-BB를 포함하는 분석 시료 (30 μL)에 대해 분석 반응을 수행한 결과, PDGF-BB를 포함하는 분석 시료에서만 강한 형광 신호가 발생하였고, 이에 따라, 본 기술을 기반으로 표적물질인 PDGF-BB를 선택적으로 검출해낼 수 있음을 확인하였다(도 4).
실시예 5. GQ-HCR 기술을 이용한 표적 막단백질 검출의 유효성 검증
실시예 1에서 언급된 반응 조건을 이용하여 본 기술의 표적 막단백질 검출에 대한 유효성 검증 실험을 표적 막단백질 과발현 상피세포를 이용하여 진행하였다. 2,500 cells/μL의 표적 막단백질 (HER2) 과발현 상피세포인 SK-BR-3를 포함하는 분석 시료, 2,500 cells/μL의 표적 막단백질 (HER2) 비발현 상피세포인 MDA-MB-231을 포함하는 분석 시료와 상피세포를 포함하지 않는 분석 시료를 제조한 후 분석 반응을 수행한 결과, 표적 막단백질 (HER2) 과발현 상피세포인 SK-BR-3를 포함하는 반응조건에서만 월등히 높은 형광 신호가 발생하는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 6. 산화그래핀 유무에 따른 S/N ratio 비교
실시예 1에서 언급된 반응 조건을 이용하여 본 발명의 유효성 검증 실험을 진행하였다. 표적물질로는 실시예 2에서 이용한 PDGF-BB 20 nM를 이용하였으며, 산화그래핀 유무를 제외하고는 동일 조건에서 실험을 진행하였다. 신호 대 잡음 비 (Signal-to-ratio, S/N Ratio)는 통상 연구간 사용되는, 표적 물질이 포함된 양성 표본의 형광 신호값(F) 대비 표적 물질이 포함되지 않은 음성 표본의 형광 신호값(F0)의 비율(F/F0) 을 적용하여 계산하였으며, 그 결과 도 6에서와 같이 산화그래핀을 도입하였을 때 신호 대 잡음 비가 현저히 높게 나타났으며, 산화그래핀의 도입으로 본 발명에 따른 GQ-HCR 기술의 비특이적 반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7. GQ-HCR 기술 및 thioflavin T (ThT)를 모두 이용한 상피세포 검출용 조성물의 구축
본 발명에 따른 GQ-HCR 기술과 ThT를 모두 이용한 상피세포 검출용 반응 용액(이하 상피세포 검출용 조성물)의 제조 과정은 다음과 같다.
10 mM PBS (pH 6.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2를 포함하는 반응 완충 용액에 HP (1 μM) 0.9 μL, H1 (10 μM) 1.2 μL, H2 (10 μM) 1.5 μL, 산화그래핀(1 mg/mL) 1.8 μL 및 다양한 농도의 표적 상피세포 6 μL를 반응 완충 용액에 첨가하여 반응 용액(최종 30 μL)을 제조하고, 37℃에서 5 분 동안 반응을 진행시킨다. 반응이 완료된 후, 상기 반응 용액에 ThT (2.5 mM) 3.6 uL를 첨가하고, ThT로부터 발생하는 형광 신호 세기를 측정하였다.
본 상피세포 검출용 조성물을 이용한 상피세포의 검출을 위해 사용된 핵산 프로브의 염기서열 정보는 다음과 같으며, 이에 한정되지는 않는다.
HP: 5’-CGC TGC AAG CCA AAC CAA AAA AAA AAA GCA GCG GTG TGG GGG CAG CGG TGT GGG GGC AGC GGT GTG GGG-3’ (서열번호 4)
H1: 5’-TGG TTT GGC TTG CAG CGG GCT GGG TAG GGC GGG TTG GGA AAA ATC CAG CCC GCT GCA A-3’ (서열번호 5)
H2: 5’-GCC CGC TGC AAG CCA AAC CAT GGG TAG GGC GGG TTG GGA AAT TGC AGC GGG CTG GAT T-3’ (서열번호 6)
실시예 8. GQ-HCR과 ThT를 모두 이용한 상피세포의 검출 유효성 평가
실시예 7에서 언급된 반응 조건을 이용하여 상피세포 검출 조성물을 이용한 상피세포의 검출 유효성 검증 실험을 진행하였다(도 8). 다양한 반응 조건(a ~ e)에 따른 실험을 수행한 결과, 표적 막단백질 혹은 ThT가 반응 용액에 존재하지 않는 시료의 경우 낮은 형광신호가 발생하였으나(조건 a, b), 상피세포와 ThT가 모두 포함된 시료의 경우에는 강한 형광신호가 발생하는 것을 확인하였다(조건 c ~ e). 특히, 표적 막단백질(HER2)에 의한 hybridization chain reaction (HCR)이 일어나지 않는 경우(조건 c, d)에도 표적 상피세포(HaCaT cell)이 존재할 시 HCR이 일어나는 경우(조건 e) 대비 약 80 % 가량의 형광 신호가 발생하는 것을 확인함으로써, 상피세포 검출 조성물에 포함된 ThT가 상피세포와 직접 상호작용을 통해 강한 형광신호를 발생시킴을 입증하였으며, 상피세포 막단백질에 의한 GQ-HCR 반응이 일어났을 때 더욱 강한 형광 신호가 발생한다는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 9. 상피세포 검출용 조성물을 이용한 ThT와 상피세포 내부단백질 간의 상호작용의 검증
상피세포 검출용 조성물을 이용하여 GQ-HCR 반응 용액에 포함된 ThT와 상피세포 내부단백질 간의 상호작용을 검증하기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해 상피세포의 내부단백질의 대부분을 차지하는 keratin과 상피세포 검출용 조성물에 포함된 ThT의 상호작용으로 인해 발생하는 형광 신호를 측정하였다. 다양한 농도의 keratin (11.05 ng/μL ~ 221 ng/μL)을 상피세포 대신 상피세포 검출용 조성물에 첨가하여 분석 시료를 제조한 후 분석 반응을 수행한 결과, keratin의 농도가 높아질수록 발생하는 형광 신호가 증가하는 것을 확인함으로써, 상피세포 내부의 keratin이 상피세포 검출용 조성물에 포함된 ThT와 반응하여 강한 형광신호를 발생한다는 것을 확인하였다(도 9).
실시예 10. 상피세포 검출용 조성물을 이용한 표적 상피세포의 검출 및 검출 한계 확인
상피세포 검출용 조성물을 이용하여 표적 상피세포의 검출 민감도 검증 실험을 진행하였다. 다양한 농도(10 cells/μL ~ 10,000 cells/μL)의 표적 상피세포(HaCaT cell)를 포함하는 분석 시료를 제조한 후 분석 반응을 수행한 결과, 본 기술의 표적 상피세포 검출 한계(limit of detection, LOD)는 4.10 cells/μL인 것을 확인하였다(도 10).
실시예 11. 법광원을 이용한 상피세포 시각화 결과
상피세포 검출용 조성물을 이용한 반응을 통해 표적 상피세포를 범죄현장에서 사용하는 법광원을 이용하여 관찰할 수 있는지에 대한 실험을 진행하였다. 다양한 농도(10 cells/μL ~ 10,000 cells/μL)의 표적 상피세포(HaCaT cell)가 도포된 페트리 접시 위에 상피세포 검출용 조성물을 도포하여 반응을 진행시킨 뒤, 법광원을 이용하여 ThT의 여기 파장에 해당하는 450 nm의 광선을 입사시키고, 492 nm 부근의 파장을 선택적으로 투과하는 차폐 필터를 이용하여 다양한 농도의 표적 상피세포에서 발생하는 신호를 관찰하였다. 그 결과 상피세포의 농도가 증가할수록 관찰되는 형광신호의 세기가 더욱 강해지는 것을 확인하였으며, 이를 통해 본 기술에서 활용된 상피세포 검출용 조성물과 법광원을 이용해 상피세포를 성공적으로 관찰할 수 있음을 확인하였다(도 11).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
<120> Method for detecting target utilizing Graphene oxide and
aptamer/G-quadruplex-based hybridization chain reaction (GQ-HCR)
<130> P21-B281
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HP
<400> 1
gtagcctgaa gccaaaccaa aaaaaaaaac aggctacggc acgtagagca tcaccatgat 60
cctg 64
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1
<400> 2
tggtttggct tcaggctacg gctgggtagg gcgggttggg aaaaatccag ccgtagcctg 60
60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H2
<400> 3
gccgtagcct gaagccaaac catgggtagg gcgggttggg aaacaggcta cggctggatt 60
60
<210> 4
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HP for detecting epithelial cell
<400> 4
cgctgcaagc caaaccaaaa aaaaaaagca gcggtgtggg ggcagcggtg tgggggcagc 60
ggtgtgggg 69
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1 for detecting epithelial cell
<400> 5
tggtttggct tgcagcgggc tgggtagggc gggttgggaa aaatccagcc cgctgcaa 58
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H2 for detecting epithelial cell
<400> 6
gcccgctgca agccaaacca tgggtagggc gggttgggaa attgcagcgg gctggatt 58
Claims (24)
- 표적물질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 트리거-1 염기서열을 포함하는 압타머 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브; 및
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브를 포함하는, 표적물질 검출용 조성물에 있어서,
상기 G-rich 서열은 각각 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브의 중단부에 온전한 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 산화그래핀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 압타머 헤어핀프로브, 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브가 반응하여 생성되는 산물에 특이적으로 결합하는 신호물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 생성되는 산물은 G-quadruplex 구조체인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 G-quadruplex 구조체는 G-rich 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 신호물질은 방사성 표지(radiolabel), 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 영상화제(imaging agent) 및 금속 이온(metal ion)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 신호물질은 티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)인 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 표적물질은 질병 유래 단백질, 세포막단백질, 소 분자, 금속이온으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 표적물질 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 표적물질 검출용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 혼성연쇄반응을 이용한 표적물질 검출방법:
(a) 표적물질을 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물과 혼성연쇄반응시키는 단계; 및
(b) 상기 혼성연쇄반응에 의해 형성된 G-quadruplex 구조체를 측정하는 단계.
- 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계는
(i) 압타머 헤어핀프로브를 표적물질과 반응시켜 압타머 헤어핀프로브의 트리거-1 염기서열을 노출시키는 단계; 및
(ii) 상기 (i)단계에서 노출된 트리거-1 염기서열에 의해, 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브가 연쇄적으로 개방되어 혼성연쇄반응(hybridization chain reaction)을 유발시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 표적물질은 질병 유래 단백질, 세포막단백질, 소 분자, 금속이온으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 표적물질이 존재하지 않는 경우, 상기 압타머 헤어핀프로브, 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브는 산화그래핀에 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 압타머 헤어핀프로브는 트리거-1 염기서열 및 표적물질과 결합하는 압타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 헤어핀프로브는 트리거-1 염기서열과 상보적인 염기서열, G-rich 염기서열 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 제2 헤어핀프로브는 트리거-2 염기서열과 상보적인 염기서열, G-rich 염기서열 및 트리거-1 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 (b)단계의 G-quadruplex 구조체는 G-rich 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 (b)단계의 G-quadruplex 구조체는 신호물질로 검출하고, 상기 신호물질은 방사성 표지(radiolabel), 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 영상화제(imaging agent) 및 금속 이온(metal ion)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 신호물질은 티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 상피세포 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 트리거-1 염기서열을 포함하는 압타머 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열에 상보적인 염기서열; G-rich 염기서열; 및 트리거-2 염기서열을 포함하는 제1 헤어핀프로브;
상기 트리거-1 염기서열; G-rich 염기서열; 및 상기 트리거-2 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 제2 헤어핀프로브; 및
티오플라빈 T(Thioflavin T, ThT)를 포함하는, 상피세포 검출용 조성물에 있어서,
상기 G-rich 서열은 각각 제1 헤어핀프로브 및 제2 헤어핀프로브의 중단부에 온전한 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 표적물질 검출용 조성물. - 제20항에 있어서, 상기 상피세포 단백질은 상피세포 막단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제21항에 있어서, 상기 상피세포 막단백질은 EpCAM 또은 HER2인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 티오플라빈 T는 상피세포 내부물질과 반응하여 신호를 발생시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 상피세포 함유 시료를 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항의 조성물과 반응시키는 단계를 포함하는 상피세포 검출방법.
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-
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| CN110734960A (zh) | 2019-09-19 | 2020-01-31 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 基于链式杂交反应及荧光碳量子点的痕量muc1荧光检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Jiahao Huang 등, Anal. Chem., 86, 페이지 3209-3215, 2014.* |
| Tianxiao Chen 등, Anal. Sci., 33, 페이지 1333-337, 2017.* |
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|---|---|
| WO2022131846A1 (ko) | 2022-06-23 |
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