CN113287014A - 循序多重蛋白质印迹 - Google Patents
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Abstract
本文描述了用于样品中靶标分析物循序多重检测的方法和组合物。所述方法包括将包含固定在固体支持物上的分析物的样品与特异性结合样品中分析物的结合剂接触,其中每种结合剂结合不同的分析物并连接至包含独特序列的单链核酸分子。然后样品与标记的互补核酸分子接触,该核酸分子结合与一种结合剂连接的单链核酸分子。来自标记物的信号被检测,然后减小或消除。样品可同时接触结合不同结合剂的第二标记的互补核酸分子并检测来自第二标记物的信号。重复该过程以检测样品中每种其他分析物,从而循序地检测样品中的分析物的存在。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月27日提交的美国临时专利申请号62/785,389的优先权,其内容通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
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发明背景
多重蛋白质印迹的现有方法具有有限的多重能力,因为它们需要不同物种的一抗,多种二抗,且用于检测抗体的荧光染料存在光谱重叠。剥离-重探测方法的缺点是长且冗杂,需要重新封闭和额外的长时间抗体孵育步骤来检测每种后续靶标,并且需要使用苛刻的试剂(去污剂、还原剂、低pH)和/或在循环之间加热,这样可以从膜的表面剥离靶标抗原。另外,使用多色检测需要昂贵的仪器,这会影响该方法的采用。
本申请描述了现有试验的问题的解决方案。
发明概述
本文描述了用于循序地检测样品中靶标分析物的存在的方法和组合物。在一些实施方式中,靶标分析物固定于固体支持物上。
一方面,该方法包括:
i)使包含两种或更多固定在固体支持物上的分析物的样品与特异性结合样品中分析物的两种或更多结合剂接触,其中每种分析物特异性结合剂结合不同的分析物并连接至包含独特序列的单链核酸分子;
ii)使样品与核酸分子接触,该核酸分子包含第一可检测标记物和具有互补区的序列,其与第一分析物特异性结合剂相连的独特序列结合;
iii)检测来自第一可检测标记物的信号;
iv)减小第一可检测标记物的信号;
v)使样品与核酸分子接触,该核酸分子包含第二可检测标记物和具有互补区的序列,其与第二分析物特异性结合剂相连的独特序列结合;且
vi)检测来自第二可检测标记物的信号;
从而循序地检测两种或更多种分析物的存在。
在一些实施方式中,该方法进一步包括为了固定于固体支持物上的其他靶标分析物重复步骤(iv)-(vi)。在一些实施方式中,步骤(iv)和(v)同时发生。
在一些实施方式中,减小可检测标记物的信号包括猝灭、失活或去除信号或可检测标记物。在一些实施方式中,去除信号包括消化包含可检测标记物的核酸。在一些实施方式中消化涉及使用限制酶和/或DNA糖基化酶联合内切核酸酶VIII。在一些实施方式中,去除信号涉及包含可光裂解间隔子的核酸骨架的光解。在一些实施方式中,去除信号包括置换包含可检测标记物的核酸链。在一些实施方式中,置换核酸链包括使用具有链置换功能的聚合酶。在一些实施方式中,置换核酸链包括使用粘性末端(toehold)交换链置换,描述于Yurke,B等,2000,Nature 406,p605-608和Zhang,DY及Winfree,E,2009,J Am Chem Soc131,p17303-17314。在一些实施方式中,减小可检测标记物的信号不从固体支持物上去除靶标分析物。在一些实施方式中,第一和第二可检测标记物是相同的或不同的。
在一些实施方式中,包含可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的独特序列形成双链体。
在一些实施方式中,单链核酸分子通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与结合剂相连。在一些实施方式中,结合剂上的碳水化合物氧化之后,通过还原性胺化连接单链核酸分子。在一些实施方式中,用于连接单链核酸的接头包括生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。
在一些实施方式中,结合剂包括抗体或其抗原结合片段、纳米抗体、亲和抗体或其他抗体模拟物、适体、受体、配体、肽、凝集素、核酸分子或小分子。
另一方面,描述了用于循序地检测样品中两种或更多种靶标分析物的存在的方法。在一些实施方式中,靶标分析物固定于固体支持物上。在一些实施方式中,在一个夹心型试验方式中,靶标分析物通过特异性结合靶标分析物的结合剂(例如抗体)与固体支持物相连。
一些实施方式中,所述方法包括:
i)使包含有至少两种不同靶标分析物固定其上的固体支持物与至少特异性结合样品中的第一种靶标分析物的第一结合剂和至少特异性结合样品中的第二种靶标分析物的第二结合剂接触,其中第一分析物特异性结合剂与包含独特序列的第一核酸分子相连,第二分析物特异性结合剂与包含独特序列的第二核酸分子相连;
ii)使第一核酸分子与包含第一可检测标记物的核酸分子及结合第一核酸分子的序列接触;
iii)检测来自第一可检测标记物的信号;
iv)减小第一可检测标记物的信号;
v)使第二核酸分子与包含第二可检测标记物的核酸分子及结合第二核酸分子的序列接触;且
vi)检测来自第二可检测标记物的信号;
从而循序地检测样品中的不同靶标分析物。
在一些实施方式中,第一和第二核酸分子是单链的。在一些实施方式中,结合第一核酸分子的序列与第一核酸分子的独特序列区域互补,结合第二核酸分子的序列与第二核酸分子的独特序列区域互补。在一些实施方式中,包含第一可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的第一核酸分子形成双链体,包含第二可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的第二核酸分子形成双链体。在一些实施方式中,第一和第二可检测标记物是相同的或不同的。
在一些实施方式中,该方法包括为了固定于固体支持物上的其他靶标分析物重复步骤(iv)-(vi)。
在一些实施方式中,减小可检测标记物的信号包括猝灭、失活或去除信号或可检测标记物。在一些实施方式中,去除信号包括消化包含可检测标记物的核酸。在一些实施方式中消化涉及使用限制酶和/或DNA糖基化酶联合内切核酸酶VIII。在一些实施方式中,去除信号涉及包含可光裂解间隔子的核酸骨架的光解。在一些实施方式中,去除信号包括置换包含可检测标记物的核酸链。在一些实施方式中,置换核酸链包括使用具有链置换功能的聚合酶。在一些实施方式中,置换核酸链包含使用粘性末端交换链置换。
在一些实施方式中,包含可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的第一核酸分子、第二核酸分子或两者形成双链体。
在一些实施方式中,第一核酸分子、第二核酸分子或两者通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与结合剂相连。在一些实施方式中,在结合剂上的碳水化合物氧化之后,通过还原性胺化连接单链核酸分子。在一些实施方式中,用于连接单链核酸的接头包括生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。在一些实施方式中,包含独特序列的核酸分子可通过两种或更多种特异性且稳定相连的分子之间相互作用共价或非共价地连接至结合剂。
在一些实施方式中,结合剂包括抗体或其抗原结合片段、纳米抗体、亲和抗体或其他抗体模拟物、适体、受体、配体、肽、凝集素、核酸分子或小分子。
另一方面,本文描述了包含连接至一种或多种靶标分析物的一种或多种结合剂的组合物。在一些组合物的实施方式中,靶标分析物固定于固体支持物上。在一些实施方式中,结合剂与包含独特序列的核酸分子偶联。在一些实施方式中,核酸分子包含沿着至少部分的核酸分子的双链体。
在一些实施方式中,核酸分子包含连接至结合剂的第一寡核苷酸和包含杂交到第一寡核苷酸的可检测标记物的第二寡核苷酸。
在一些实施方式中,第一寡核苷酸通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与结合剂相连。在一些实施方式中,在结合剂上的碳水化合物氧化之后,通过还原性胺化连接单链核酸分子。在一些实施方式中,用于连接单链核酸的接头包括生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。在一些实施方式中,包含独特序列的核酸分子可通过两种或更多种特异性且稳定相连的分子相互作用共价或非共价地连接至结合剂。
在一些实施方式中,结合剂包括抗体或其抗原结合片段、纳米抗体、亲和抗体或其他抗体模拟物、适体、受体、配体、肽、凝集素、核酸分子或小分子。
另一方面,提供了用于生产本文所述组合物的方法。在一些实施方式中,该方法包括使本文所述结合剂与靶标分析物接触。在一些实施方式中,靶标分析物固定于固体支持物上。
另一方面,提供了包含一种或多种本文所述组合物的试剂盒。
附图说明
图1显示了本文所述方法的一个实施方式的示意图。独特的核酸分子通过生物素-链霉亲和素连接连接至不同的结合剂。
图2显示了本文所述的代表性捕获、探针和猝灭寡核苷酸(分别为SEQ ID NO1、2和3)
图3A-3C显示了循序多重蛋白质印迹的代表性数据。图3A显示了如实施例中所述的使用寡核苷酸编码的抗-PCNA mAb和抗-PARP mAb以及单次膜条带的代表性循序多重蛋白质印迹实验。图3B显示了如实施例中所述的来自同一个循序多重蛋白质印迹实验的相邻图像的电泳图数据叠加。图3C显示了如实施例中所述的相同PARP和PCNA靶标的传统化学发光法蛋白质印迹作为对照。
图4显示了使用针对人PCNA和GAPDH的链霉亲和素-偶联抗体和使用5’Cy5.5标记的检测探针寡核苷酸检测的循序多重蛋白质印迹的代表性数据。
图5A和5B显示从HEK293裂解物中检测PCNA的信噪比在至少10次探针-洗涤-检测-猝灭-洗涤循环期间稳定。
图6显示可使用限制酶消化在承载了可检测标记物的探针寡核苷酸和独特捕获寡核苷酸之间形成的DNA双链体减小与GAPDH结合剂相关的可检测信号。
图7显示固体支持物可以是磁性颗粒,则可以使用限制酶或USER酶减小与人IL-6结合剂相关的可检测信号。图8证明固体支持物可以是磁性颗粒,且可以使用粘性末端交换链置换方法减小可检测信号。
定义
本公开所用技术和科学术语具有本领域技术人员所公认的含义。参见例如Lackie,DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》),埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(2007年第4版);Green,M.R.和Sambrook J.,MOLECULAR CLONING,ALABORATORY MANUAL(《分子克隆,实验室手册》)(第4版),冷泉港实验室出版社(冷泉港,纽约2012)。然而,下述术语可具有如下所述的另外的或可替代的定义,其用来帮助理解本文经常用到的某些术语但无意于对本公开范围构成限制。
当术语“包含”或“包括”及其各种变体例如“含有”指步骤或要素时意在表示不排除增加其他步骤或元素,而这种增加是可选的。本文所述方法的实施可采用任何与本文所述相似或等同的方法、装置和材料。
如本文所用,术语“结合剂”或“结合伴侣”指的是结合到另一个实体的分子、复合物或装配体,例如对应于和/或代表靶标的存在或不存在或丰度的靶标分析物。结合剂可特异性地结合到实体上,因此可能与实体形成特异性结合对。特异性结合对的非限制性实例包括互补核酸、受体和其配体、生物素和亲和素/链霉亲和素、抗体或其片段和对应抗原、抗体和蛋白G、聚组氨酸和Ni+2、转录因子和含有转录因子结合位点的核酸、凝集素和其加载碳水化合物的伴侣,或适体和其伴侣。与靶分子特异性相互作用或特异性结合的分子的非限制性示例包括核酸(例如寡核苷酸)、蛋白质(例如抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架、受体、配体)、肽、适配体和小分子。
试验中关于结合剂和特定靶标(和/或关于对应于特定靶标的产物)的“特异性结合”是指结合剂和靶标(和/或结合剂和产物)之间的结合,其在试验中基本不包括其他靶标(和/或它们的对应产物)。
术语“固体支持物”指的是能够结合分析物的表面,例如膜、容器表面(例如板中的孔)、载玻片或盖片、通道或室(例如在微流控芯片中)、毛细管、蘸棒、侧流材料、过滤材料或颗粒,例如珠子、微粒或纳米颗粒。可以用增强分析物结合的试剂处理固体支持物。表面还可以包含特异性结合或捕获靶标分析物的结合剂,例如抗体或其片段。
术语“样品”指的是来自任何合适来源的感兴趣的化合物、组合物和/或混合物。样品通常包括至少一种可能存在于样品中的靶标分析物。样品在其自然状态下(如收集和/或改变的状态下)分析,例如,后续储存、保藏、提取、裂解、稀释、浓缩、纯化、过滤、与一种或多种试剂混合、分配或其中的任意组合。
样品可能是用于任意合适目的的任意合适类型。临床样品可包括鼻咽清洗液、血液、血浆、无细胞血浆、血沉棕黄层、唾液、尿液、粪便、痰液、粘液、伤口拭子、组织活检、乳液、吸出液、拭子(例如鼻咽拭子)和/或组织等。环境样品可包括水、土壤、气溶胶和/或空气等。研究样品可包括培养的细胞、原代细胞、细菌、孢子、病毒、小生物体、上面列举的任何临床样品等。其他样品可包括食品、武器部件、用于测试生物威胁剂的生物防御样品和可疑污染物。
收集样品可用于诊断目的(例如,临床分析物如传染物的定量测量)或用于监测目的(例如,确定感兴趣的环境分析物如生物威胁剂已超过预定阈值)。
生物样品可以从任何合适的生物有机体获得或可以包含任何合适的生物有机体,例如至少一种动物、植物、真菌、细菌或其他有机体,或其至少一部分(例如,一种或多种来自其中的细胞或蛋白质)。在一些实施方式中,该生物样品来自动物,例如哺乳动物(例如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(例如鸡)、或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织和/或体液,例如血液,血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、红细胞等),痰液或唾液,组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织);培养的细胞,例如原代培养物,外植体,和转化的细胞,干细胞,粪便,尿液等。生物样本可获取自活检物。生物样品也可获取自保存的或存档的样品,例如FFPE样品、储存在液氮中的样品或点样并在卡片上干燥的样品。
在一些实施方式中,样品是环境样品,例如空气、水或土壤样品。样品可以来源自特定的环境来源,例如特定的湖泊、地区、蓄水层、流域或特定的生态系统或地理区域。或者,可以从区域、物体或空间擦、刮等获得样品。例如,其可以是来自病房、床或其他物理物体的空气或水样品,或擦拭或刮擦。
可以制备样品以提高对靶标的高效识别。例如,可对样品进行纯化、破碎、分离、匀浆或超声处理。在一些实施方式中,可以从样品(例如,生物样品)中提取或分离一种或多种靶标。在一些实施方式中,富集样品中存在的一种或多种靶标。在一些实施方式中,用亲和法(例如免疫亲和富集)富集样品中的靶标。例如,通常通过免疫亲和、离心或其他本领域已知方法富集样品中的生物颗粒/靶标,或颗粒/靶标的特定类型以捕获和/或分离颗粒/靶标。
在一些实施方式中,用尺寸选择(例如,除去小/短的分子和/或大/长的分子)富集样品中的靶标。
“靶标”指的是感兴趣的分析物(或其区域)。靶标与分析物可互换作为术语使用。通常通过试验检测靶标,例如本文所述的多重试验,并且可包含在样品中。靶标可以是分子(靶分子)或两种或更多种分子的装配体或复合物(靶装配体/复合物)。靶标可以是分子的部分(或全部)或装配体/复合物的部分(或全部)。示例性靶标包括核酸、核酸序列、蛋白质(例如,抗体、酶、生长因子、凝血因子、磷蛋白等)、蛋白质序列(例如表位/半抗原)、碳水化合物、代谢物和生物颗粒。
如本文所用,“核酸”意指包含核苷酸单体链的分子/装配体。有天然结构的核酸,即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),通常具有交替的戊糖基团和磷酸基团的骨架。每个戊糖基团与核碱基(例如嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(T))或嘧啶(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)))连接。具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物,并且可以,例如,通过改变天然主链的戊糖和/或磷酸基团和/或一个或多个核碱基产生。示例性人工核酸包括乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸等。
术语“核酸”包括DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于给核酸配体碱基或核酸配体整体提供化学基团的那些修饰,所述化学基团引入附加电荷、极化性、氢键、静电相互作用、连接点和官能团。这类修饰包括但不限于,肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如,硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、具有可光裂解键的间隔子(例如,来自集成DNA技术公司(IntegratedDNA Technologies(IDT))、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸还可以包含非天然碱基,例如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰,例如用荧光团(例如,量子点)、荧光猝灭剂、FRET受体或供体、生物素或其它部分加帽。
核酸单链可由合适数目的核苷酸构成,例如至少2、5、10、20、50、100、200、500或1000个核苷酸等。通常,核酸链的长度对应于其来源,合成的核酸(例如,引物和探针)通常较短,而生物学/酶促产生的核酸(例如,核酸分析物)通常较长。“核酸”指的是多个核酸,其具有不同序列、长度、类型或其组合等。
核酸的序列由核碱基沿主链排列的顺序定义。该序列通常决定核酸通过氢键特异性结合伴侣链(或形成分子内双链体)的能力。具体地,腺嘌呤与胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对,鸟嘌呤与胞嘧啶配对。通过与另一条链或区域形成连续的这种碱基对串,可以以反平行方式与另一条核酸链或区域结合的核酸链或区域被称为“互补的”。
“寡核苷酸”指的是长度短于500、200或100个核苷酸的核酸。寡核苷酸可以是化学合成的,可选地没有被酶催化。寡核苷酸可以用作例如引物或探针。
“检测试剂”指的是促进或能够用合适的检测器(例如,光学检测器)检测靶标分析物的存在或不存在和/或量的试剂。一组检测试剂可用于本文所述的方法中。该组检测试剂可包含至少一种结合剂,其仅特异性结合待测定的靶标之一和/或非特异性地结合待测定的靶标中的每一个。结合伴侣可包括标记物和/或可以是发光的(和/或具有发光形式)。
“标记物”或“可检测标记物”指的是与本文所述化合物、靶标分析物或核酸连接、附接或偶联或整合的识别和/或区分标志物或标示符。
“连接”到标记物上的分子或其他实体(例如,对于如本文所述标记的探针)是通过一种或多种化学键共价连接(“偶联”)到标记物上,或非共价连接到标记物上的分子或其他实体,例如通过一种或多种离子键、范德华力、静电和/或氢键,从而可以通过检测标记物的存在来检测分子的存在。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用,指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物、非天然存在的氨基酸聚合物和其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。
术语“接头”是指将两个不同分子彼此连接或附接的化合物。例如,接头可以包括生物素和/或链霉亲和素、蛋白A、蛋白G或蛋白A/G。接头还可以包括天然的和合成的蛋白质或蛋白质结构域,其共价或非共价地连接和/或组合(即spy-catcher/spytag(参见HatlemD,等.,捕获SPY:使用SpyCatcher-SpyTag和相关系统用于标记和定位细菌蛋白质(Catching a SPY:Using the SpyCatcher-SpyTag and Related Systems for Labelingand Localizing Bacterial Proteins.)Int J Mol Sci.2019;20(9):2129.2019年4月30日发表.doi:10.3390/ijms20092129);Profinity eXxactTM(伯乐实验室(Bio-RadLaboratories))。化学接头包括碳水化合物接头、脂质接头、脂肪酸接头、核酸接头和聚醚接头,如PEG。例如,聚(乙二醇)接头可获自阿拉巴马州汉茨维尔的谢氏聚合物有限公司(Shearwater Polymers,Inc.)。这些接头可任选地具有酰胺接头、巯基接头或杂双官能接头。
术语“独特序列”是指不同于(即,不相同于)其他核酸序列的核酸序列。独特序列可以包含在与本文所述的结合剂连接的单链核酸分子中。独特序列可以与其他核酸序列有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸或核碱基的不同。
发明详述
I.引言
本申请提供了用于循序地检测样品中靶标分析物存在的方法和组合物。样品中的分析物可固定于固体支持物上。该方法和组合物提供了与现有试验相关的问题的解决方案,并提供了优于现有方法的优点,例如快速、灵敏、温和地探测以及具有超过当前多色荧光检测能力的高水平多重分析物的检测。在蛋白质印迹的情况下,该方法不需要剥离和重探测,大大加速了对印迹上多重蛋白质的检测,从几天缩短到几小时。该方法与化学发光法、荧光和其他检测模式相容。另一个优点是该方法可简化并减少仪器费用,因为可使用单色作为可检测标记物进行多重检测,替代了现有试验使用的多重激光和过滤器组。成本的降低可导致该领域科学家更广泛地采用该方法。此外,通过将该方法和传统多色荧光染料的使用相结合,可进一步提高通量。例如,还可以使用多色检测以包括在每个循环中在单独成像通道上检测的内部对照。其他优势包括使用单链核酸分子,例如寡核苷酸,其允许从单个样品中进行高水平的多重化,减少凝胶中跨泳道归一化的需要。
本文描述了用于循序多重蛋白质印迹和循序多重ELISA试验的方法和组合物。在一些实施方式中,该方法使用与包含可检测标记物的核酸分子相连的结合剂。在一些实施方式中,连接到每个结合剂上的核酸分子包含独特序列。在一些实施方式中,膜或Elisa孔或板同时与对感兴趣的靶标分析物特异的一种或多种结合剂接触,然后使用包含可检测标记物的核酸分子循序地检测。成像后,第一可检测标记物被温和地除去、猝灭或灭活以减小或消除其对应信号,且在一些实施方式中,同时探测下一个分析物。对每个被评估的靶标分析物重复该循环。
在一些实施方式中,靶标分析物与结合剂接触,结合剂与包含可检测标记物、可检测探针或可检测部分的核酸分子连接或偶联。在一些实施方式中,标记的核酸分子是单链DNA或RNA分子,它们循序地和样品中的靶标分析物接触。在一些实施方式中,靶标分析物首先和含有与标记的单链核酸分子互补的单链核苷酸分子的结合剂接触。在检测、鉴定和/或定量第一靶标分析物之后,可检测标记物可快速地、选择性地、温和地猝灭、失活或去除,允许在重复循环中鉴定下一个靶标分析物而并不明显损失固体表面的抗原。
在一些实施方式中,结合剂包含检测手段,例如本文所述的可检测标记物。在一些实施方式中,该方法包括用于检测样品中靶标分析物的手段,例如用于检测本文所述的包含结合至靶标分析物的可检测标记物的结合剂的手段。
II.方法
本文描述了用于循序地检测样品(例如生物样品)中靶标分析物存在的方法。在一些实施方式中,该方法包括含有一种、两种或更多(例如多种)靶标分析物的样品与本文所述结合剂接触。靶标分析物可固定于固体支持物。样品与一种、两种或更多(例如多种)结合剂接触,其特异性地结合样品中的分析物(指作为分析物特异性结合剂)。在一些实施方式中,样品或固体支持物与多个特异性结合样品中不同分析物的分析物特异性结合剂接触。在一些实施方式中,样品或固体支持物同时与多个特异性结合样品中不同分析物的分析物特异性结合剂接触。
在一些实施方式中,固体支持物是表面,例如膜、多孔板的表面或微米或纳米颗粒。可以封闭固体表面以防止结合剂的非特异性结合。在一些实施方式中,固体表面是用于蛋白质印迹分析的膜,且该膜用双链DNA、tRNA、硫酸肝素、硫酸葡聚糖或阴离子聚合物封闭。
在一些实施方式中,每个分析物特异性结合剂与包含独特序列的核酸分子(例如第一核酸分子)连接或偶联,因而每个分析物特异性结合剂包含不同的独特序列。例如,结合分析物A的结合剂可与包含独特序列A’的核酸分子偶联,而结合分析物B的结合剂可与包含独特序列B’的核酸分子偶联。在一些实施方式中,核酸分子与结合剂共价连接。在一些实施方式中,核酸分子与结合剂非共价连接。
在一些实施方式中,与结合剂连接或偶联的核酸分子是单链分子,例如寡核苷酸(也称为“捕获寡核苷酸”)。核酸分子可以是DNA、RNA或可包括人工核苷酸或其类似物。例如,核酸分子可包含对外切酶活性有抗性的锁核苷酸。
在一些实施方式中,在每个分析物特异性结合剂与包含独特序列的核酸分子连接后,合并两种或更多种不同的结合剂并同时与样品接触。样品可包含固定于固体支持物的分析物。
在一些实施方式中,在足以使互补核酸链之间杂交的条件下,然后包含靶标分析物的样品与包含与连接至分析物特异性结合剂(例如第一分析物特异性结合剂)的独特序列互补的核酸序列的核酸分子(例如,第二核酸分子)接触。在一些实施方式中,第二或互补核酸分子包含可检测标记物或探针(也称作“互补探针寡核苷酸”或“探针寡核苷酸”)。互补序列的杂交导致可检测标记物或探针与结合剂连接。在一些实施方式中,包含互补核酸序列的核酸分子和连接至分析物特异性结合剂的独特序列形成双链体区域(例如,在捕获寡核苷酸和探针寡核苷酸之间的双链体)。双链体区域可以仅沿着连接至或偶联至结合剂的核酸分子部分延伸,使得核酸分子包含双链体区域和单链区域。在一些实施方式中,单链区域紧邻可检测标记物或探针的3’,如图2所示。
然后使用本领域已知的方法或体系检测连接至结合剂的可检测标记物或探针产生的信号。例如,标记物或探针可以用能够检测信号的装置成像。在一些实施方式中,标记物是荧光标记物,可以用配备有用于测量和定量标记物或探针发射的荧光波长的合适滤光器的装置来检测信号。其他实例包括作为标记物的酶,其产物是可检测的。酶标记物的实例包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶和β-半乳糖苷酶。酶标记物可以与连接至本文所述结合剂的核酸分子偶联。下面描述了可检测标记物的其他实例。
在检测了样品中的第一靶标分析物之后(通过检测连接至第一分析物特异性结合剂的可检测标记物),来自可检测标记物的信号被减小或消除。可以使用不去除或减少固体支持物上靶标分析物的量的温和方法来减小或消除信号,即不使用苛性试剂如去污剂、还原剂或低pH值,和/或不在检测循环之间使用高温(加热)的方法。该方法也不需要耗时的剥离和重新探测固体支持物以在检测到可检测标记物后去除结合剂。该方法允许使用单个可检测标记物来检测样品中存在的所有靶标分析物(单色多重化),这大大简化并降低了检测每个靶标分析物的多个不同标记物所需的仪器成本。
在一些实施方式中,来自可检测标记物的信号被猝灭减小,例如,使用动态猝灭和/或静态猝灭机制。动态猝灭的实例包括福斯特共振能量转移或荧光共振能量转移(FRET),和德克斯特电子转移(也称为交换或碰撞能量转移)。荧光猝灭剂的其他实例包括暗猝灭剂。
在一些实施方式中,使用在彼此相邻结合时表现出FRET的邻近依赖性杂交探针对来猝灭信号。在一些实施方式中,使用与杂交到位于可检测探针3’的单链区域的寡核苷酸连接的猝灭剂分子猝灭信号。在一些实施方式中,使用包含荧光团和猝灭剂的发夹核酸分子猝灭信号,例如分子信标探针(“信标”)。在一些实施方式中,信标被设计为与捕获寡核苷酸退火,从而展开并分离荧光标记物和猝灭剂分子,产生可检测信号。任何未与靶标结合的信标都会使另一端的荧光标记物猝灭。为了去除信号,可以添加也与捕获寡核苷酸互补的未标记的寡核苷酸,其取代结合的信标,允许发夹重新形成并猝灭其信号。未标记的寡核苷酸可被设计为与捕获寡核苷酸结合更紧/稳定,以确保信标出局。
在一些实施方式中,通过将包含可检测标记物的核酸与切割或消化该核酸以释放标记物的限制酶接触,通过洗涤去除该标记物。在一些实施方式中,限制酶是四(4)-碱基切割剂,例如CviQI或CviAII,其在环境温度下具有最大活性(可从新英格兰生物实验室公司(New England Bio Labs)获得),避免检测循环之间的苛刻条件,否则这些条件可能从表面去除分析物。
在一些实施方式中,捕获和/或探针寡核苷酸包含一个或多个尿嘧啶碱基,使用USERTM(尿嘧啶特异性切除剂)酶减小信号,该酶在尿嘧啶残基位置产生单核苷酸缺口(可从新英格兰生物实验室公司获得)。USERTM酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶裂解酶核酸内切酶VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切除,形成无碱基(无嘧啶)位点,同时保留磷酸二酯骨架完整。核酸内切酶VIII的裂解酶活性破坏无碱基位点的3’和5’侧的磷酸二酯骨架,从而释放无碱基脱氧核糖。USERTM酶有效地切割寡核苷酸,或产生在环境温度下容易解离的较短链,或在单链区域内切割的情况下直接释放,从而释放可以被洗掉的标记物。
在一些实施方式中,互补核酸分子包括可光裂解间隔子。为了减小可检测标记物的信号,可光裂解间隔子可暴露于长波UV光下,其水解核酸骨架并释放可检测的探针。
在一些实施方式中,可检测标记物的信号通过光漂白减小(例如,描述于SchubertW.等.Nat.Biotech,2006;24:1270-78,其通过引用纳入本文)。
在一些实施方式中,可检测标记物的信号通过链置换方法减小。链置换的实例是本领域公知的,包括粘性末端介导的链置换(Zhang,DY等.2012,Nature Chem 4,p208-214,“优化核酸杂交的特异性”(“Optimizing the specificity of nucleic acidhybridization.”);Pallikkuth,S,等.2018,PLOS One,1-11,“使用DNA链置换的循序超分辨率成像”(“Sequential super-resolution imaging using DNA stranddisplacement.”))和RNA/DNA聚合酶介导的链置换活性。在一些情况下,分离的互补寡核苷酸(粘性末端寡核苷酸)是与捕获或探针寡核苷酸的单链区域部分退火,随后沿着邻近区域迁移形成新的双链体,从捕获寡核苷酸上置换并释放原始探针寡核苷酸,使得它可以被洗掉。如果单链粘性末端区域在探针寡核苷酸上,那么未被占据的捕获寡核苷酸可以被再生,以便如果需要,可以多次探测相同的分析物。在一些实施方式中,引物寡核苷酸可以与捕获或探针寡核苷酸的单链区域退火,并且通过使用聚合酶和核苷酸,探针寡核苷酸被置换并能够被洗掉。在其他实施方式中,探针寡核苷酸可包含具有3’末端的发夹,使得聚合酶不需要单独的引物来延伸序列和置换标记物。
连接到第一结合剂上的标记物的信号减小或消除后,可以检测样品中的另一种分析物。在一些实施方式中,在足以使互补核酸链之间杂交的条件下,样品与另一个(不同的或第三)核酸分子接触,其包含与不同的分析物特异性结合剂连接的独特序列互补的核酸序列。如上,在一些实施方式中,互补的核酸分子包含可检测标记物或探针。可检测标记物或探针可以与试验中的其他结合剂(或其他互补核酸分子)相连的可检测标记物或探针相同或不同。
在一些实施方式中,第一可检测标记物猝灭,同时或一起,样品与下一条互补的核酸分子接触。
以上步骤可被重复以检测样品中的其他分析物,从而产生样品中靶标分析物的循序检测。
在一些实施方式中,可检测标记物包括基于酶的检测试剂。在这些实施方式中,可以通过抑制剂使酶失活,例如不可逆抑制剂。
在一些实施方式中,捕获寡核苷酸可以被制造为抵抗核酸酶降解的,而检测寡核苷酸可被制造为易被核酸酶水解的,从而在降解时释放探针标记物。
在一些实施方式中,捕获寡核苷酸通过5’末端与有生物素的结合剂相连。捕获寡核苷酸也可以通过其3’末端连接到结合剂上(例如,利用生物素-SA或直接连接到结合剂上)。为了减小来自可检测标记物的信号,包含可检测标记物的探针寡核苷酸在其5’末端退火形成单链区。可通过将引物寡核苷酸与探针寡核苷酸的单链区域退火(类似于图2中猝灭寡核苷酸的退火),然后加入DNA聚合酶和dNTP来延长引物,从而释放检测寡核苷酸来去除可检测标记物,所述引物不能与包含捕获寡核苷酸的双链结合。在一些实施方式中,可通过依赖于所使用聚合酶的5’->3’外切核酸酶活性或链置换降解捕获寡核苷酸。
在一些实施方式中,CRISPR系统可适于切割或置换探针链。
III.结合剂
结合样品中特定靶标分析物的结合剂可包括蛋白质(例如,抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架、受体、配体、受体-配体对),直接针对不同碳水化合物的凝集素,肽,肽适配体,核酸适配体和小分子。结合剂的其他实例可在蛋白质结合数据库中(例如,结合数据库,bindingdb.org)找到,其中列举了数千种蛋白靶标和小分子。
在一些实施方式中,结合剂是抗体或其抗原结合片段,其特异性地结合样品中的靶标分析物(例如,抗原)。抗体和抗原结合片段的实例包括任何同种型的免疫球蛋白分子(例如,IgG和IgM分子)、Fab、双抗体(例如,与轻链可变结构域在同一多肽上的重链可变区域,它们通过短肽接头连接)、Fab′、F(ab′)2、Fv结构域抗体和单链抗体(例如,scFv分子)。在一些实施方式中,抗体是“嵌合”抗体,包含来自两个不同抗体的部分。抗体可包含两条全长重链和两条全长轻链或其衍生物、变体或片段,或可仅包含重链,例如骆驼科产生的抗体。其他实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、微小抗体、单域抗体、合成抗体(“抗体模拟物”)、人源化抗体、人抗体、肽抗体和其抗原结合片段。
IV.核酸
本文所述结合剂可连接或偶联到核酸分子上。核酸分子可包括DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。在一些实施方式中,核酸分子是单链分子。
在一些实施方案中,核酸包括化学修饰。化学修饰的实例包括但不限于给核酸配体碱基或核酸配体整体提供化学基团的那些修饰,所述化学基团引入附加电荷、极化性、氢键、静电相互作用、连接点和官能团。这类修饰包括但不限于:肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如,硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺修饰、4-硫尿核苷取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶取代、骨架修饰、甲基化、稀有碱基配对组合如异碱基(isobase)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸还可以包含非天然碱基,例如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰,例如用荧光团(例如,量子点)、猝灭剂、生物素或其它部分加帽。
在一些实施方式中,核酸分子可包括人工结构或天然核酸的类似物(例如,非天然核酸)。示例性人工核酸包括乙二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯和2-O-甲基核糖核苷酸。在一些实施方式中,核酸分子在5’或3’末端被封闭以防止或抑制外切核酸酶降解。
在一些实施方式中,核酸分子连接或偶联至本文所述的可检测标记物。
在一些实施方式中,核酸分子长度短于约100个核苷酸,例如长度为10-90、10-80、10-70、10-50、10-40、15-90、15-80、15-70、15-60、15-50或15-40个核苷酸。核酸通常被设计成允许在用于单链之间杂交的温度下稳定退火。在一些实施方式中,温度是环境温度(例如,20-25℃)。可以使用本领域已知和可用的软件来设计核酸序列并预测在不同缓冲液、温度和盐条件下的稳定性、二聚体和发夹结构。
V.核酸偶联到结合剂
可以使用G.T.Hermanson,《偶联技术》(Bioconjugate Techniques),第三版,学术出版社(Academic Press)(2013);Maerle A.V.等.,“通过免疫PCR检测IgE和IgM抗体的共价抗体-DNA偶联物技术的发展”(“Development of the covalent antibody-DNAconjugates technology for detection of IgE and IgM antibodies by immuno-PCR,”)PLoS One.2019;14(1):e0209860;和Shahi,P.等.,Scientific Reports,7:44447“Abseq:超高通量单细胞蛋白质分析与液滴微流体条码”(“Abseq:Ultrahigh-throughputsingle cell protein profiling with droplet microfluidic barcoding;”)中描述的方法将本文所述的核酸分子偶联至结合剂,其通过引用纳入本文。也可以使用市售寡核苷酸偶联试剂盒,例如来自Expedeon的PLUS寡核苷酸偶联系统(OLIGOCONJUGATION SYSTEM)。
在一些实施方式中,单链核酸分子(例如,捕获寡核苷酸)通过5’磷酸基团、胺基、羧基、羟基或巯基与结合剂相连。巯基反应性化学基团包括卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰胺、芳基化剂、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇和二硫化物还原剂。许多巯基反应性化学基团通过烷基化(例如,硫醚键的形成)或二硫键交换(二硫键的形成)与巯基偶联。
在一些实施方式中,核酸分子使用碳二亚胺交联剂化学偶联至结合剂,其中羧基反应性化学基团与羧酸(-COOH)交联,其存在于蛋白质和许多其他生物分子中。碳二亚胺化合物例如EDC和DCC可用于通过酰胺键的形成将羧酸交联到伯胺上。硫代-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)修饰也可用于将羧基转化为胺反应性NHS酯,以将核酸与本文所述的结合剂偶联。
在一些实施方式中,单链核酸分子(例如,捕获寡核苷酸)使用点击化学方法与结合剂连接,例如铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC),张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)。
在一些实施方式中,使用合适的接头将核酸分子与结合剂偶联。合适的接头包括但不限于生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G和蛋白L。在一些实施方式中,接头包含生物素和/或亲和素或链霉亲和素(SA)。例如,结合剂(例如抗体)可偶联至SA,核酸可偶联至生物素,或者反之亦然。在一些实施方式中,接头是化学接头,例如同或异双功能接头。
VI.可检测标记物
本文所述的结合剂或核酸可与可检测“标记物”连接。该标记物可以通过任何合适的方法检测,包括光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理方法。合适的标记物包括荧光团、化学发光反应、辣根过氧化物酶(HRP)、发光团、生色团、放射性同位素(例如,32P、3H)、电子致密试剂、酶和特异性结合伴侣。连接可检测标记物与结合剂的方法是熟知的。例如,常见蛋白质标记技术的综述可参见《生物化学技术:理论和实践(BiochemicalTechniques:Theory and Practice)》,John F.Robyt和BernardJ.White,维弗兰德出版公司(Waveland Press,Inc.)(1987);R.Haugland,《生物聚合物的激发状态(Excited Statesof Biopolymers)》,Steiner编,普莱南出版社(Plenum Press)(1983);《荧光探针设计与合成:技术指南(Fluorogenic Probe Design and Synthesis:A Technical Guide)》,PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996);以及G.T.Herman,《生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)》,第三版,学术出版社(Academic Press)(2013),其全部通过引用纳入本文。
本文所述的结合剂或核酸可以通过一个或多个化学键共价连接(“偶联”)或非共价连接到标记物上,例如通过一种或多种离子、范德华、静电、和/或氢键,从而可以通过检测标记物的存在来检测分子的存在。
可检测标记物可以具有任何合适的结构和特征。例如,标记物可以是探针,包含寡核苷酸和与寡核苷酸相连的发光团(例如和与寡核苷酸偶联的发光团)以标记寡核苷酸。可检测标记物也可以是pDot(聚合物点),其具有极其明亮和稳定的信号。探针还可包括发光团的能量转移伴侣,例如猝灭剂或另一种发光团。示例性标记的探针包括EclipseTM探针、分子信标探针、当彼此相邻结合时表现出FRET的邻近依赖性杂交探针对或双杂交探针。
在一些实施方式中,可检测标记物的信号被减小或消除。可以通过以邻近依赖性方式猝灭信号(例如,来自荧光团的光发射)减小或消除信号。在一些实施方式中,当相关的寡核苷酸(连接至荧光团)与互补核酸链结合时,检测到来自荧光团的光。通过杂交连接至猝灭剂分子的互补寡核苷酸和连接至荧光探针的单链核酸,使得猝灭剂分子和荧光探针非常接近,可以减小信号。在一些实施方式中,可检测标记物被猝灭(不可检测)直到核酸分子结合互补核酸链,并且在结合时可以检测到信号。对于每个荧光团,猝灭剂可以是相同的或不同的。在一些实施方式中,猝灭剂分子是IAbRQSp或黑洞猝灭剂。在其他实施方式中,通过切割连接至可检测标记物的核酸减小或消除信号,例如通过上述用限制酶消化核酸。在其他实施方式中,通过链置换(例如粘性末端介导的或聚合酶介导的过程)减小或消除信号。
在一些实施方式中,可检测标记物包括HRP。在一些实施方式中,HRP是偶联到互补核酸上的,其与连接到结合剂的核酸分子杂交。
在一些实施方式中,标记物包括可光裂解间隔子或与可光裂解间隔子连接。
在一些实施方式中,两种或更多标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号,该可检测信号在所述多种标记物缺失其一或其中多个时不会生成。例如,在一些实施方式中,各标记物是酶,且这些酶的活性联合生成可检测信号。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验,例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验;以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的NAD(P)H的化学发光试验。参见例如,Maeda等,J Biolumin Chemilumin 1989,4:140-148。
VII.组合物
还提供了本文所述包括结合剂的组合物。在一些实施方式中,组合物包括连接至固定在固体支持物上的一种或多种靶标分析物的一种或多种结合剂。靶标分析物可直接或间接地固定在固体支持物上。例如,靶标分析物可直接连接(固定)到固体支持物上,或间接连接到固体支持物上。在一些实施方式中,使用固定在固体支持物上的抗体将靶标分析物间接连接到固体支持物上,且该分析物与抗体结合,导致分析物在固体支持物上的间接固定。在一些实施方式中,结合剂与包含独特序列和可检测标记物的核酸分子偶联。在一些实施方式中,核酸分子包含沿着至少部分核酸分子的双链体。在一些实施方式中,核酸分子包含连接结合剂的第一单链核酸分子(例如,第一寡核苷酸或捕获寡核苷酸),和包含杂交至第一寡核苷酸的可检测标记物的第二单链核酸分子(例如,第二寡核苷酸或探针寡核苷酸)。在一些实施方式中,一种或多种结合剂或每种结合剂与不同的第一单链核酸分子连接,每种包含独特序列。例如,每种结合剂可连接至不同的包含独特序列的捕获寡核苷酸。
在组合物的一些实施方式中,第一单链核酸分子或寡核苷酸通过5’磷酸基团、胺基、羧基、羟基或巯基与结合剂相连。在一些实施方式中,第一单链核酸分子或寡核苷酸使用点击化学与结合剂连接,例如铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC),或张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)。
在一些实施方式中,使用合适的接头将第一单链核酸分子或寡核苷酸与结合剂连接。合适的接头包括但不限于生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。在一些实施方式中,结合剂与链霉亲和素偶联,且第一寡核苷酸包含生物素,其与链霉亲和素结合,从而将第一寡核苷酸连接至结合剂。
组合物还可以包括第一组单链核酸分子(例如,一组捕获寡核苷酸),其中该组的每一个成员包含不同、独特的序列。在一些实施方式中,每种分析物特异性结合剂与不同的第一单链核酸分子组(例如,一组捕获寡核苷酸)成员连接,其中该组的每一个成员包含不同、独特的序列。
组合物也可包括第二组单链核酸分子(例如,一组探针寡核苷酸),其中该组的每个成员包含在适当条件下与第一组单链核酸分子(例如,捕获寡核苷酸组)成员杂交(或能够杂交)的序列。
在一些实施方式中,结合剂包括抗体或其抗原结合片段、适配体、受体、配体、肽或小分子。
还描述了产生本文所述组合物的方法。在一些实施方式中,该方法包括将本文所述一种或多种结合剂与一种或多种同源靶标分析物接触,其中一种或多种靶标分析物被直接或间接地固定在固体支持物上。
该分析物可直接或间接地固定在固体支持物上。间接固定的实例包括夹心型排列,其中能够结合分析物的抗体被固定到固体支持物上。在包含一种或多种靶标分析物的样品与固体支持物接触后,固定的抗体与分析物结合。然后,具有独特序列的结合剂可结合相同分析物,但是结合分析物上的不同位置。
VIII.试剂盒
还提供了包含本文所述组合物的试剂盒。例如,试剂盒可包含一种或多种结合剂,其结合(或能够结合)一种或多种样品中的靶标分析物(“分析物特异性结合剂”)。在一些实施方式中,试剂盒包含一种或多种与单链核酸分子连接的分析物特异性结合剂,和/或用于连接单链核酸分子和分析物特异性结合剂的试剂,其中单链核酸分子(例如,“捕获寡核苷酸”)包含独特序列。在一些实施方式中,试剂盒包括一组第一单链核酸分子(例如,一组捕获寡核苷酸),其中该组的每一个成员包含不同的、独特的序列。在一些实施方式中,每种分析物特异性结合剂与不同的包含独特序列的单链核酸分子连接。在一些实施方式中,每种分析物特异性结合剂与不同的第一单链核酸分子组(例如,一组捕获寡核苷酸)成员连接,其中该组的每一个成员包含不同、独特的序列。如上所述该试剂盒可进一步包括互补的(例如,第二)单链核酸分子,或一组互补的(例如,第二)单链核酸分子,其包含与每种结合剂连接的第一单链核酸分子互补的序列。互补的(例如,第二)单链核酸分子或一组互补的(例如,第二)单链核酸分子可包括本文所述可检测标记物(例如,“探针寡核苷酸”)。
该试剂盒可进一步包括用于使核酸分子与结合剂偶联的试剂,和/或用于将可检测标记物与核酸分子偶联的试剂。在一些实施方式中,该试剂盒可包括用于作为猝灭剂使用的第三寡核苷酸组,或用于去除可检测标记物的引物。
实施例
实施例1.
该实施例描述了在蛋白质印迹试验中靶标蛋白质的循序检测。
方法:
链霉亲和素与抗体偶联。抗-hGAPDH、hPCNA和hPARP抗体(购自伯乐公司,参见下表1)被浓缩并用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.4洗涤两次。根据制造商的说明,使用Lynx快速链霉亲和(伯乐公司,#LNK161STR)和100μg Ab将链霉亲和素偶联至每种抗体。每100μl Ab溶液中加入10μl修饰试剂,然后将体积转移到冻干的链霉亲和素小瓶中。除去对照样品(10μl)并立刻加入1μl猝灭试剂。室温(RT)下孵育反应3小时,然后向每个反应中加入10μl猝灭试剂并孵育30分钟。在还原和非还原条件下使用Experion Pro260试验分析反应,以测定偶联水平。第一抗体-SA浓度为0.5-1.0mg/ml。
表1:
蛋白质印迹膜制备
HEK293裂解物(经重建得到1mg/ml于1X利姆里(Laemmli)+40mM DTT)在100℃加热5分钟。将10μg(或4μl)裂解物上样至TGX 4-20%凝胶,并在相邻泳道上样双色精确蛋白质标准品。凝胶在250伏特下电泳22分钟,然后使用TBT(1.3A下7分钟)转到PVDF膜上。膜在1XPBST、3%BSA中封闭60分钟,然后在1X PBST(0.1%)、1%BSA、100μg/ml已剪切的鲑鱼精子DNA(赛默科技公司)、5mM EDTA中封闭30分钟。
循序多重蛋白质印迹方案
制备分离抗体-链霉亲和素(SA)-生物素-捕获寡核苷酸混合物并在RT孵育30分钟。每个混合物包含:
a.4μl的抗体-链霉亲和素偶联物,4ug Ab,0.027nmol Ab。
i.假设1-2SA/IgG=0.11-0.22nmol生物素结合位点。
b.2μl100μM生物素化的捕获寡核苷酸,0.2nmol。
c.2μl TE缓冲液,pH 7.5。
所有的Ab-SA-生物素-捕获寡核苷酸混合物被合并到5ml Ab稀释缓冲液(1X PBS,1%BSA,0.1%吐温20,5mM EDTA,50μg/ml已剪切的鲑鱼精子dsDNA)中。将溶液加样至正方形皮氏培养皿中的印迹膜上并在4℃振荡孵育过夜。用10ml洗涤缓冲液(1X PBS,0.1%吐温20,5mM EDTA)洗涤印迹4次,每次洗涤5分钟。在5ml探针缓冲液中用50nM BP1检测探针寡核苷酸1(5’Cy5.5标记的)探测膜,然后在RT振荡孵育15分钟。用10ml洗涤缓冲液洗涤印迹4次,每次洗涤5分钟。使用ChemiDoc Touch Cy5.5通道膜成像。50nM猝灭探针1(BQ1)和50nM检测探针2(BP2)被合并到5ml探针缓冲液(1X PBS,1%BSA,0.1%吐温20,5mM EDTA,5μg/ml已剪切的鲑鱼精子dsDNA),并与膜在RT孵育15分钟,以同时猝灭BP1探针并使用BP2探针检测负载了捕获探针2的抗原靶标。然后如上述洗涤印迹。印迹条带在ChemiDoc Touch Cy5.5通道上重新成像。重复步骤以检测每个其他靶标。
结果:
代表性方法如图1所示。使用LYNX快速链霉亲和素抗体偶联试剂盒(伯乐)将一抗(Ab's)与链霉亲和素(SA)偶联,产生1-3的SA∶Ab比例。按照生物素-寡核苷酸:SA位点为1∶1的摩尔比(或略过量),独特的生物素-捕获寡核苷酸与SA-偶联的一抗在单独的试管中混合并孵育30分钟,如方法中所述,膜封闭30-60分钟。
然后合并一抗,在5mL Ab稀释缓冲液中稀释作为第二次封闭,并在RT孵育2小时或在4℃孵育过夜。
通过在5mL探针缓冲液中用互补的探针寡核苷酸在室温孵育印迹15分钟检测第一Ab(与第一靶标分析物结合)。洗涤印迹然后如方法中所述成像。检测第二Ab(与第二靶标分析物结合),并通过将印迹与第二捕获寡核苷酸的互补探针寡核苷酸和第一探针寡核苷酸互补的猝灭寡核苷酸在室温下孵育15分钟,同时猝灭与第一靶标Ab结合的可检测标记物的信号。印迹被洗涤并成像。为了测试每一个后续抗体-靶标分析物结合对重复该循环。
表2显示了代表性的捕获-探针和猝灭寡核苷酸。
参考:
(1).Zhang,DY等.2012,Nature Chem 4,p208-214.优化核酸杂交的特异性.(Optomizing the specificity of nucleic acid hybridization.)
(2).Pallikkuth,S,等.2018,PLOS One,1-11.使用DNA链置换的循序超分辨率成像.(Sequential super-resolution imaging using DNA strand displacement.)
图3A-3C显示循序多重蛋白质印迹试验的代表性结果。图3A显示了使用寡核苷酸编码的抗-PCNA mAb和抗-PARP mAb以及单次膜条带的代表性循序多重蛋白质印迹实验。Precision Plus蛋白质双色标准品(伯乐实验室,4ul)和HEK293裂解物(VLY001,伯乐实验室,10ug)加样至4-20%mini-PROTEAN TGX凝胶(伯乐实验室)的交替泳道中,通过SDS-PAGE分离,并使用Trans-Blot Turbo(伯乐实验室)转移到PVDF膜上。用1X PBS,0.1%吐温20,3%BSA封闭膜60分钟,然后用1X PBS,0.1%吐温20,1%BSA,5mM EDTA,100ug/mL已剪切的鲑鱼精子DNA(赛默飞世尔科技公司(Thermo-Fisher Scientific))封闭膜30分钟。封闭后,膜被剪成五条,包含1个标准品和1个裂解物泳道。
PCNA(VMA00016,29kDa)和PARP(VMA00018,116kDa)的荧光检测使用的小鼠单克隆抗体购自伯乐实验室,首先使用LYNX快速链霉亲和素抗体偶联试剂盒(也购自伯乐实验室)用链霉亲和素(SA)标记抗体。在单独的试管中,将4ug的每种抗体与大约等摩尔量(基于生物素结合位点的数目)的独特生物素化捕获寡核苷酸混合。然后将抗体-SA-寡核苷酸复合物一起稀释在含有1x PBST,1%BSA,5mM EDTA,50ug/ml DNA的5ml抗体稀释剂中,并在4C轻柔振荡孵育过夜。
第二天用1X PBST,5mM EDTA洗涤膜条。对条带进行循序探测,首先,通过在含有5ug/mL鲑鱼DNA(探针稀释剂)的5mL洗涤缓冲液中室温下孵育15分钟,将50nM cy5.5-标记的探针寡核苷酸(BP2)与PCNA mAb上的对应捕获寡核苷酸(BC2)退火。在PBST,5mM EDTA中再次洗涤膜4次每次5分钟,使用ChemiDoc Touch成像仪(伯乐公司)的Cy5.5通道(左侧条带成像)以检测PCNA。成像后,将探针寡核苷酸BP1和猝灭寡核苷酸BQ2各50nM加入5mL探针稀释剂中,孵育15分钟以同时猝灭BP2的信号并检测与BP1 cy5.5标记的寡核苷酸和与PARPmAb通过链霉亲和素偶联的互补BC1捕获寡核苷酸退火相关的信号。在额外的洗涤步骤之后,条带被重新成像,其中显示PCNA信号(BP2)被猝灭并观察到PARP信号(BP1)(中间条带图像)。最后,在5ml探针稀释剂中加入50nM BQ1猝灭寡核苷酸,洗涤并成像产生右侧条带图像,其中PARP信号被猝灭。
图3B显示了左侧和中间条带(顶部)以及中间和右侧条带(底部)的线轮廓重叠(使用ImageJ生成)。
图3C显示了对照图像,以确认当使用传统的蛋白质印迹方案和化学发光(Clarity底物,伯乐实验室)时,一抗可以检测预期分子量的靶标。未偶联的小鼠抗-PARP和小鼠抗-PCNA一抗(1∶1000稀释,在10ml 1xPBST,3%BSA中10ug)加上山羊-抗-小鼠-HRP(在1xPBST,3%BSA中1∶10,000稀释)用于从同一印迹中检测其他条带中的相同靶标。
图4显示了使用寡核苷酸编码的抗-PCNA mAb和抗-GAPDH mAb(VMA00046,伯乐公司,37kDa)以及单次膜条带的代表性循序多重蛋白质印迹实验结果。在该实验中,印迹与4ug抗-PCNA-SA-BC1寡核苷酸加抗-GAPDH-SA-BC2寡核苷酸的5ml探针稀释剂在4C下孵育过夜。应注意,在本实验中,PCNA-SA抗体包含BC1捕获寡核苷酸,而不是之前实验中使用的BC2捕获寡核苷酸。通过用50nM cy5.5-标记的BP1寡核苷酸孵育印迹15分钟检测PCNA(左侧成像)。随后,检测GAPDH,通过用50nM cy5.5-标记的BP2寡核苷酸和50nM BQ1猝灭寡核苷酸孵育同一条带15分钟以同时猝灭PCNA信号并检测GAPDH信号(中间成像)。相同印迹与BQ2猝灭寡核苷酸的最后15分钟孵育消除了来自GAPDH靶标的信号(右侧图像)。在每个探针/猝灭寡核苷酸孵育和图像记录之间,在1X PBST,5mM EDTA中洗涤印迹4次每次5分钟。
图5A和5B显示使用循序多重方法检测PCNA蛋白质印迹的信噪比在至少10次探针-洗涤-检测-猝灭-洗涤循环期间稳定。含有双色标准品和10ug HEK293裂解物交替泳道的4-20%TGX凝胶进行电泳,印迹到PVDF上并切成5条,每个条带有一条标准品泳道和一条裂解物泳道。膜条用1X PBST(0.1%吐温20),3%BSA封闭30分钟,然后用1X PBST,1%BSA,5mMEDTA,100ug/ml鲑鱼精子DNA封闭,然后放入单独的托盘中。将小鼠抗-PCNA抗体-链霉亲和素偶联物(4ug)与200pmol生物素捕获寡核苷酸BC2孵育30分钟以形成抗体-寡核苷酸复合物。然后将反应稀释到5ml封闭缓冲液中,并在4℃下孵育过夜。用1X PBST,5mM EDTA洗涤条带4次每次5分钟。
为了模拟循序多重方法,用5ml探针缓冲液(1X PBST,5mM EDTA,1%BSA,5ug/mlDNA)中的50nM BP2-cy5.5寡核苷酸探测一个条带15分钟,其与印迹上的靶标结合的PCNA抗体相关的捕获寡核苷酸退火。其余条带用相同的缓冲液模拟处理相同的时间,但没有探针寡核苷酸。在探针步骤之后,将条带再洗涤4次,然后使用Chemidoc Touch(伯乐公司)使用cy5.5设置进行成像。然后将剩余的条带在探针缓冲液中再孵育15分钟,然后洗涤4次每次5分钟以模拟该方法的后续猝灭/探针洗涤步骤。该过程总共重复10个循环,通过特定的BP2-寡核苷酸检测PCNA,而不是在循环4、7和10使用3个其他条带进行模拟检测。
图5A显示了在循环1、4、7和10中使用BP2-cy5.5在相同曝光时间对PCNA的检测以及在循环1的重复测试。图5B显示了不同循环的信号(条形)和信噪比(线)图。
总之,上述实施例证明了在蛋白质印迹试验中靶标蛋白质的循序检测。
实施例2.
本实施例描述了减少来自可检测标记物的信号的不同方法。
图6显示了循序多重蛋白质印迹分析的代表性结果,其中使用限制酶(CviQI(G∧TAC,新英格兰实验室公司#R0639)在室温下温和地去除来自靶标的信号。包含双色标准品和HEK293裂解物(10ug)的一对PVDF蛋白质印迹条带(对照和测试)与5ml 0.8ug/ml寡核苷酸编码的抗-GAPDH-SA-BC4B抗体-寡核苷酸复合物4C孵育过夜。洗涤后,用探针缓冲液中的50nM Cy5.5标记的BP4B寡核苷酸探测印迹15分钟以检测GAPDH(37kDa)靶标。随后,将膜与1ml NEB3.1缓冲液(Cntl,左侧图像)或NEB3.1缓冲液中的1ml 500U/ml CviQI限制性内切酶(新英格兰生物实验室公司#R0639)(右侧图像)室温孵育20分钟,然后在ChemiDoc Touch(伯乐实验室公司)的cy5.5通道上成像0.5秒。该图显示,与缓冲液对照对比,CviQI限制性内切酶有效地去除了97%以上的GAPDH荧光信号。
图7显示,在一些实施方式中,表面可以是磁性颗粒,并且可以使用酶去除或降低靶标信号,例如单独的限制性内切酶或与其他酶例如USER(尿嘧啶特异性切除试剂,新英格兰生物实验室公司)组合。在一个例子中,靶标IL-6人类抗原(标准稀释剂中0.17至177pg/ml,伯乐实验室公司,#171DK0001)被捕获到含有抗-IL6抗体的磁性颗粒上,然后使用含有50nM独特寡核苷酸序列(5′-生物素-BC4B)的第二人类IL-6特异性mAb-链霉亲和素偶联物进行探测。等体积的1mg/ml IL6-Ab-SA和100uM 5′生物素-BC4B寡核苷酸在室温下孵育30分钟,以制备Ab-SA:寡核苷酸复合物。在使用磁体聚集珠子并使用ChemiDoc MP(伯乐实验室)成像后,通过杂交互补寡核苷酸-5′-HRP偶联物(BP4D-HRP)和使用清晰度最大(伯乐实验室)的化学发光底物来检测免疫复合物。然后使用CviQI(400U/ml)限制性内切酶或CviQI(400U/ml,三角形)加USER(20U/ml,X)在1X NEB3.1缓冲液中室温孵育15分钟去除靶标信号并重复化学发光反应。如图7所示,包含CviQI和USER的酶混合物比单独使用限制性内切酶更大程度地去除了靶标信号。在靶标抗原的最高浓度下仍然存在残留信号,但可以通过进一步优化来减小或消除这种信号。用缓冲液(菱形)孵育的对照没有导致信号丢失。
IL-6捕获颗粒的制备使用标准EDC/NHS化学方法,将小鼠抗-人IL-6单克隆捕获抗体(伯乐实验室,#1001228,批号100002765,3ug)与6-8um绝对Mag羧基磁性颗粒(创造性诊断公司(Creative Diagnostics),#WHM-S034)偶联。简而言之,首先用2.7mg/ml磺基-NHS(赛默飞世尔科技公司,PG82071)和2.4mg/ml EDC(赛默飞世尔科技公司,PG82079)在室温下在50ul 0.1M磷酸钠pH 6.0缓冲液中活化2.7e07洗涤颗粒20分钟。然后在pH 6.0的0.1MMES缓冲液中洗涤颗粒并用含有3ug抗体的50ul相同缓冲液重悬。偶联在室温下进行1小时,然后洗涤珠子,然后使用含有1%BSA的PBST缓冲液封闭表面30分钟。最终的珠制备物在含有0.02%叠氮化钠的TBST中4℃储存。
IL-6链霉亲和素偶联物的制备
如上所述,使用来自伯乐实验室(LNK161STR)的Lynx快速链霉亲和素偶联试剂盒将抗-人IL-6单克隆检测抗体(伯乐实验室,#1003064,批次100003303)与链霉亲和素偶联。
BP4D-HRP偶联物的制备
5′-二硫醇寡核苷酸BP4D与EZ-连接的马来酰亚胺激活的辣根过氧化物酶(HRP)(赛默飞世尔科技公司,#31485)在含有5mM EDTA的pH 7.2的0.1M磷酸钠缓冲液中偶联。简而言之,在70C下用80mM DTT还原5’二硫醇寡核苷酸(IDT)5分钟,然后在相同的缓冲液中使用Pierce 3K过滤旋转单元(赛默飞世尔科技公司,#88512)进行缓冲液交换。还原的寡核苷酸和马来酰亚胺活化的HRP,两者在同一缓冲液中以寡核苷酸:mal-HRP大约3∶1的比例混合,并在室温下孵育2小时以进行反应。通过Experion电泳(伯乐实验室)确认偶联程度,将溶液制成50%甘油并储存在-20C。偶联物无需进一步纯化即可使用。
图8显示在一些实施方式中,表面可以是磁性颗粒并且可以使用粘性末端交换链置换寡核苷酸探针去除靶标信号。数据显示,在1um Dyna珠上形成的来自链霉亲和素:生物素-寡聚核苷酸cy5.5标记的双链体的cy5.5荧光信号,可以通过使用互补粘性末端探针有效去除,该探针首先通过7个碱基的单链区域与探针寡核苷酸链退火,而脱靶非互补对照寡核苷酸和缓冲液对照未能破坏标记的双链体。
连接至珠的链霉亲和素:BC15-2:BP15A Cy5.5标记的SA:寡核苷酸双链体制备
在试管中,30uL(120pmol生物素结合位点)的1mg/ml链霉亲和素涂覆的1umDynabeads(赛默飞世尔科技公司,#65601)用0.5ml 1x PBS,5mM EDTA缓冲液洗涤4次,每次洗涤用磁性歧管浓缩珠。用75ul缓冲液重悬珠,并将1.5ul 100uM BC15-25′-生物素捕获寡聚核苷酸加入到SA-珠中,并在RT下孵育15分钟,同时在1000rpm下振摇,以形成SA珠:BC15-2寡核苷酸复合物。然后用1x PBS,5mM EDTA,10ug/ml已剪切的鲑鱼精子DNA(PE5D10缓冲液)洗涤珠4次,并用75uL缓冲液重悬。然后,加入5′-Cy5.5标记的BP15A寡核苷酸至终浓度2uM,并在室温下振摇孵育15分钟。再次用PE5D10缓冲液洗涤珠4次,然后用700ul缓冲液重新悬浮。
粘性末端链置换试验
为了测试作为去除信号手段的粘性末端链置换,将50uL的Cy5.5标记的SA:寡核苷酸双链体珠粒化,然后用50uL的PE5D10缓冲液(对照)、50uL的50uM的脱靶粘性末端寡核苷酸(阴性对照)或50uL的50uM的RP15-2互补粘性末端寡核苷酸重悬,并在室温下以1000rpm孵育60分钟。孵育结束时,用PE5D10缓冲液洗涤珠3次,并重新悬浮在50ul相同的缓冲液中。反应的等分样(2uL)点了一式三份,在使用设置在DyeLight680通道上的ChemiDoc MP成像仪(Bio-Rad Labs)成像之前,使用磁性歧管浓缩珠。测定并比较各点的体积强度。
总之,上述实施例证明,来自可检测标记物的信号在蛋白质印迹或磁性颗粒上被减小。本说明书中引用的所有专利、专利申请、序列登录号(例如,Genbank登录号)和其它公开的参考材料都通过引用全文纳入本文。
序列表
<110> 生物辐射实验室股份有限公司 (BIO-RAD LABORATORIES, INC.)
<120> 循序多重蛋白质印迹
<130> 094260-1163921-116210PC
<140>
<141>
<150> 62/785,389
<151> 2018-12-27
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 1
aaaaacaaac aagacccttg ag 22
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的探针
<400> 2
gtctgtcgtg cgaactcttc tcaagggtct tgtttg 36
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 3
gagttcgcac gacagac 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 4
catacccgta atagcgt 17
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的探针
<400> 5
atgcgaataa ttggtttacg ctattacggg tatg 34
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 6
accaattatt cgcat 15
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 7
catacctgta ccgtaatagc gt 22
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的探针
<400> 8
atgcgaataa ttggtttacg ctattacggt acaggtatg 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<220>
<223> 合并的DNA/RNA分子描述:合成的寡核苷酸
<400> 9
atgcgaataa ttggutuacg cuattacggt acaggtatg 39
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 10
ttgcatccag tacttcaata c 21
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的探针
<400> 11
aaaaagacgt agggtattga agtactggat gcaa 34
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 12
ttgcatccag tacttcaata ccctacgtc 29
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成的寡核苷酸
<400> 13
tttcgtttgc ctgctttatc tctgttctac tatttccg 38
Claims (35)
1.一种用于循序地检测样品中靶标分析物的存在的方法,其包括:
i)将包含固定在固体支持物上的两种或更多分析物的样品与特异性结合样品中分析物的两种或更多结合剂接触,其中每种分析物特异性结合剂结合不同的分析物并连接至包含独特序列的单链核酸分子;
ii)使样品和核酸分子接触,所述核酸分子包含第一可检测标记物和具有互补区的序列,其与第一分析物特异性结合剂相连的所述独特序列结合;
iii)检测来自第一可检测标记物的信号;
iv)减小所述第一可检测标记物的所述信号;
v)使所述样品与核酸分子接触,所述核酸分子包含第二可检测标记物和具有互补区的序列,其与第二分析物特异性结合剂相连的独特序列结合;且
vi)检测来自第二可检测标记物的信号,
从而循序地检测两种或更多分析物的存在。
2.如权利要求1所述的方法,其进一步包括为了固定于所述固体支持物上的各其他靶标分析物重复步骤(iv)-(vi)。
3.如权利要求1所述的方法,其中步骤(iv)和步骤(v)同时发生。
4.如权利要求1所述的方法,其中减小所述可检测标记物的所述信号包括猝灭、失活或去除所述信号或可检测标记物。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述去除包括消化所述包含所述可检测标记物的核酸。
6.如权利要求4所述的方法,其中所述去除包括使用粘性末端探针或聚合酶活性的链置换。
7.如权利要求4所述的方法,其中减小所述可检测标记物的所述信号不从所述固体支持物上去除靶标分析物。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述第一和第二可检测标记物是相同或不同的。
9.如权利要求1所述的方法,其中所述包含所述可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的所述独特序列形成双链体。
10.如权利要求1所述的方法,其中所述单链核酸分子通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与所述结合剂相连。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述接头包括生物素、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。
12.如权利要求1所述的方法,其中所述结合剂包括抗体或其抗原结合片段、适配体、受体、配体、肽或小分子。
13.一种用于循序地检测样品中两种或更多种靶标分析物的存在的方法,其包括:
i)使包含有至少两种不同靶标分析物固定其上的固体支持物与至少特异性结合样品中的第一种靶标分析物的第一结合剂和至少特异性结合样品中的第二靶标分析物的第二结合剂接触,其中所述第一分析物特异性结合剂与包含独特序列的第一核酸分子相连,所述第二分析物特异性结合剂与包含独特序列的第二核酸分子相连;
ii)使所述第一核酸分子与包含第一可检测标记物的核酸分子及结合所述第一核酸分子的序列接触;
iii)检测来自所述第一可检测标记物的信号;
iv)减小所述第一可检测标记物的所述信号;
v)使所述第二核酸分子与包含第二可检测标记物的核酸分子及结合所述第二核酸分子的序列接触;且
vi)检测来自所述第二可检测标记物的信号;
从而循序地检测样品中的不同靶标分析物。
14.如权利要求13所述的方法,其中所述第一和第二核酸分子是单链的。
15.如权利要求13所述的方法,其中结合所述第一核酸分子的序列与所述第一核酸分子的所述独特序列区域互补,且结合所述第二核酸分子的序列与所述第二核酸分子的所述独特序列区域互补。
16.如权利要求13所述的方法,其中包含所述第一可检测标记物的所述核酸分子沿着至少部分的所述第一核酸分子形成双链体,包含所述第二可检测标记物的核酸分子沿着至少部分的所述第二核酸分子形成双链体。
17.如权利要求13所述的方法,其中所述第一和第二可检测标记物是相同或不同的。
18.如权利要求13所述的方法,其进一步包括为了固定于所述固体支持物上的其他靶标分析物重复步骤(iv)-(vi)。
19.如权利要求13所述的方法,其中减小所述可检测标记物的所述信号包括猝灭、失活或去除信号或可检测标记物。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述去除包括消化包含所述可检测标记物的所述核酸。
21.如权利要求19所述的方法,其中所述去除包括使用粘性末端探针或聚合酶活性的链置换。
22.如权利要求13所述的方法,其中包含所述可检测标记物的所述核酸分子沿着至少部分的所述第一核酸分子、第二核酸分子或两者形成双链体。
23.如权利要求13所述的方法,其中所述第一核酸分子、所述第二核酸分子或两者通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与所述结合剂相连。
24.如权利要求23所述的方法,其中所述接头包括生物素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。
25.如权利要求13所述的方法,其中所述结合剂包括抗体或其片段、适配体、受体、配体、肽或小分子。
26.如权利要求13所述的方法,其进一步包括用结合样品中不同靶标分析物的其他结合剂重复步骤(iv)-(vi)。
27.如权利要求13所述的方法,其中所述结合剂包括抗体或其片段、适配体、配体、肽或小分子。
28.一种组合物,包括与固定于固体支持物上的一种或多种靶标分析物连接的一种或多种结合剂,其中所述结合剂与包含独特序列的核酸分子偶联。
29.如权利要求28所述的组合物,其中所述核酸分子包含沿着至少部分所述核酸分子的双链体。
30.如权利要求29所述的组合物,其中所述核酸分子包含连接至所述结合剂的第一寡核苷酸和包含杂交到所述第一寡核苷酸的可检测标记物的第二寡核苷酸。
31.如权利要求30所述的组合物,其中所述第一寡核苷酸通过5’磷酸基、胺基、羧基、羟基、巯基、点击化学、铜(I)-催化的叠氮化物-炔环加成(CuAAC)、张力促进的叠氮化物-炔环加成(SPAAC)、张力促进的炔-硝酮环加成(SPANC)或接头与所述结合剂相连。
32.如权利要求31所述的组合物,其中所述接头包括生物素、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。
33.如权利要求28所述的组合物,其中所述结合剂包括抗体或其片段、适配体、受体、配体、肽或小分子。
34.一种用于产生如权利要求28所述的组合物的方法,其包括:
将所述结合剂与固定在所述固体支持物上的所述靶标分析物接触。
35.一种试剂盒,其包含如权利要求28-33所述的组合物。
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