JP2005509444A - 多価近接プローブにより近接プロービングするための方法およびキット - Google Patents

Abstract

本発明は、多価近接プローブを用いて溶液中の１以上の被検体を検出および／または定量するための高感度、迅速かつ簡便なアッセイ法に関する。近接プローブはそれぞれ、数個の結合性部分、たとえば抗体、および会合した核酸を含む。結合性部分がそれらの被検体に結合すると、対向する近接プローブ上の核酸が互いに相互作用し、この相互作用に基づいて信号が発生する。多価近接プローブは、高感度かつ特異的なタンパク質検出に特に有用である。

Description

本発明は、医療分野に属する。より詳細には本発明は、多価近接プローブを用いて溶液中の１以上の被検体を検出および／または定量するための高感度、迅速かつ簡便なアッセイ法に関する。

近接プロービング（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｐｒｏｂｉｎｇ）（近接ライゲーションとも呼ばれる）は、２つのいわゆる近接プローブの近接を検知できる技術であり、タンパク質などの高分子を特異的、高感度かつ迅速に検出するために用いられる。近接プローブは、結合性部分（ターゲット分子に対する特異的親和性をもつ）およびそれに対合した反応性核酸からなる。プローブは通常は対で作動し、それぞれが、互いに近接した際に他方と相互作用することができる（通常はライゲーションにより）対合核酸を含む。これらの核酸は反応性核酸と呼ばれることがある。２つのプローブがターゲット被検体上にある各プローブ結合部位と結合すると、プローブ間の近接が生じる。この近接により、プローブに結合している２つの核酸が互いに相互作用して新たな核酸配列を生成し、これを増幅によって容易に検出および定量できる。通常は、それぞれの核酸配列にプライマーを１つ配置して、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ（１）を検出に用いる。一価近接プローブを用いて溶液中で洗浄工程なしに行われる均一近接プロービングが、特許出願ＷＯ０１／６１０３７に記載されている。

アッセイは下記のように実施される。まず、被検体を含有する試料と共に近接プローブ対をインキュベートして、複合体を形成させる。次いで、核酸を相互作用させるのに適した試薬を含有する混合物を添加し、次いで反応生成物を増幅する。ライゲーションによる相互作用とそれに続くＰＣＲ増幅の場合、前記混合物はリガーゼ酵素、ＡＴＰ、ハイブリダイゼーション鋳型（スプリント（ｓｐｌｉｎｔ）またはライゲーション鋳型とも呼ばれる）、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ類、ＤＮＡポリメラーゼ類、およびリアルタイム検出のためのＴａｑＭａｎプローブを含有する。反応性核酸間の幾つかのタイプの近接依存性相互作用を利用でき、これらの若干例がＷＯ０１／６１０３７に記載されている。

発明の要旨

溶液中で一価近接プローブ対を用いて近接プロービングアッセイを実施する場合、アッセイの感度は近接プローブの結合性部分の親和性に直接依存することが見いだされた。反応性核酸のライゲーション効率はそれらの相対濃度に依存するので、過度のバックグラウンドライゲーションが生じないためには、プローブを低濃度でアッセイに添加しなければならない。プローブがターゲットを結合すると局部的に高濃度となり、これがライゲーション反応を誘発して信号を発生させるが、アッセイに添加するプローブの濃度が高すぎるとバックグラウンドが生じ、アッセイ感度が低下する。

最適なアッセイでは、高い信号を確保するために可能な限り多数のターゲット被検体を２つの近接プローブにより結合し、一方では低いバックグラウンドを保証するためにプローブ濃度を最低に保持する。結合度はターゲット被検体上のプローブ結合部位に対するプローブの親和性により決まる。下記の方程式によるプローブ−ターゲット相互作用に関する解離定数Ｋｄは、結合部位の５０％がプローブを結合した濃度の尺度となる：
Ｐ＝プローブの濃度
Ｂ＝結合部位の濃度
ＰＢ＝プローブ／結合部位複合体の濃度
Ｋｄ＝((Ｐ)^＊(Ｂ))／(ＰＢ)＝((Ｐ−ＰＢ)^＊(Ｂ−ＰＢ))／(ＰＢ)
ターゲットタンパク質に対する親和性の低い（高いＫｄ値）近接プローブを用いる場合、プローブが結合するターゲットは少ないであろう。均一近接プロービングではターゲットタンパク質を結合するのに２つの結合剤が必要であり、これらが両方とも低い親和性をもつ場合、この合わせた損失は大きくなるであろう。表１に、ターゲット被検体（部位ＡおよびＢを含む）１０ｐＭおよびそれらの各結合部位に対して等しい親和性をもつ近接プローブ２０ｐＭについて、２つの結合性部分の種々のＫｄに関する模擬結合効率の若干例を示す。２つの近接プローブが１つの同一ターゲット被検体に結合する確率は、１つのプローブが結合する確率の二乗である。このため、親和性の低い近接プローブは低いアッセイ感度を与える。

低親和性プローブの問題は、より高い濃度のプローブを添加することによっては克服できない。その場合、バックグラウンドが著しく増大するからである。バックグラウンドライゲーション効率は両プローブの濃度に依存するので、たとえばターゲット結合度を高めるために両方の近接プローブの濃度を２０ｐＭから１００ｐＭに高めると（５倍の増加）、バックグラウンドライゲーションは２５倍（５×５）になるであろう。ライゲーション反応は、効率が２つの反応体（近接プローブ）の濃度に依存する擬二次反応として挙動する。図１は、近接プローブ濃度を５倍増加させた際のバックグラウンド増大に関する若干の模擬データを示す。

国際特許出願公開ＷＯ０１／６１０３７には、高濃度の低親和性近接プローブを添加し、次いで試料を希釈することによる、この問題に対する１つの解決策が示されている。しかし、これはバックグラウンドと共に信号も低下させるであろう。

多くの場合、ターゲット被検体に対して高感度のアッセイを確保するのに十分なほど高い親和性をもつ近接プローブの結合性部分成分（たとえば抗体）を得るのは困難であろう。検出には被検体当たり２つの結合事象が必要であるという前記の理由で、１ｎＭ Ｋｄの抗体対（抗体としてはきわめて良好な親和性）についての計算では、ＷＯ０１／６１０３７の例に記載された一価近接プロービングに使用する結合性部分と比較して１００倍低い感度となるであろう。

きわめて高い親和性をもつ抗体および他のアフィニティー試薬が一般に重要である。抗体の親和性を高めるために、たとえばインビトロ熟成による幾つかの試みがなされた。これらの方法は時には有効であったが、多大な労力を要し、時間がかかる（２）。

本明細書に開示する本発明は、近接プローブの親和性に直接対処することにより、低親和性近接プローブ試薬の問題に対する新規な解決策を提供する。

本発明は、多価によって近接プローブの親和性を高める手段を提供し、かつ製造に際して近接プローブを精製するためのより容易な方法を提供する。

したがって第１態様において本発明は、溶液中の１以上の被検体を検出および／または定量する方法であって、
ａ）２以上の多価近接プローブを被検体上のそれぞれの結合部位に結合させ、その際、それら多価近接プローブは、フレキシブルリンカーにより連結した少なくとも２つ、好ましくは２〜１００の結合性部分およびそれらに会合した核酸（反応性核酸と呼ばれることもある）を含み；
ｂ）それらの結合性部分を数コピーの被検体に結合させて、それら核酸をそれらが互いに近接した場合に相互作用させ；そして
ｃ）核酸間の相互作用の程度を検出および／または定量する
ことを特徴とする方法を提供する。

結合性部分は、被検体上の同一部位または異なる部位に特異的であってよい。

核酸を近接プローブ上の結合性部分または他のいずれか、たとえばポリマー主鎖に結合させることができる。後記参照。

多価近接プローブの結合性部分は、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、核酸、たとえばアプタマー、可溶性細胞表面受容体、ファージ・ディスプレイもしくはリボソーム・ディスプレイからのコンビナトリアル由来のタンパク質、またはその組合わせ、ならびに被検体特異的結合性部分と反応性であるいずれかの官能基から選択される。

１態様においては、本発明方法の工程ａ）の前に、結合性部分をビオチニル化し、ストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと共にインキュベートする。

被検体は、生体分子、たとえばタンパク質、異なるタンパク質の複合体、同じタンパク質の凝集体、および／または核酸であってよい。

複合体中の２以上のタンパク質を検出するために、多価近接プローブの結合性部分は２以上の異なるタンパク質に対する特異性をもち、それらのタンパク質が互いに結合することによりまたは同一細胞膜内に位置するなど単に互いに接近することにより複合体を形成した場合にそれら多価近接プローブを近接させる。この場合、好ましくは３つの多価近接プローブを用いる。

万能プローブ
特定のタンパク質を間接検出するために、前記タンパク質の複合体は、まず被検体上の各結合部位に特異的な２つのアフィニティー試薬（たとえば抗体対）を被検体に結合させることにより形成することができる。次いで、これら２つの第１アフィニティー試薬それぞれに特異的な多価近接プローブ対を用いて、これらの間の近接を検出する。第１アフィニティー試薬が近接している場合、それらは被検体を結合しており、これにより被検体そのものが検出される。万能多価近接プローブ対を用いると、被検体特異的な第１アフィニティー試薬の定常Ｆｃ部を結合しうる数タイプの被検体を検出できる。

第２態様において本発明は、溶液中の１以上の被検体を検出および定量するためのキットであって、被検体に対する親和性をもつ少なくとも２つの結合性部分、好ましくは２〜１００の結合性部分を含み、互いに相互作用しうる核酸（反応性官能基）を備えた２以上の多価近接プローブを含むキットに関する。好ましい態様において、近接プローブと会合した１つの核酸は遊離３’末端をもち、他方（他方の近接プローブと会合したもの）は遊離５’末端をもち、これらはライゲーションにより結合できる。ライゲーション反応は、好ましくは共通のスプリントライゲーション鋳型オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより助成される。

キットにおいて、多価近接プローブの結合性部分は、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、核酸、たとえばアプタマー、可溶性細胞表面受容体、ファージ・ディスプレイもしくはリボソーム・ディスプレイからのコンビナトリアル由来のタンパク質、またはその組合わせから選択される。

キットの１態様においては、結合性部分がビオチニル化されており、キットはさらにストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、これは結合性部分と会合していてもよく、会合していなくてもよい。

キットにおいて、多価近接プローブはポリマー主鎖、たとえばポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、有機ポリマー、たとえばポリエチレングリコール、もしくは他のフレキシブルポリマー、またはその組合わせに付与されている。

キットには、所望により下記の成分を追加できる：
−核酸を結合させるためのリガーゼ；および
−多価近接プローブ対の反応性核酸それぞれにハイブリダイズするスプリントオリゴヌクレオチド；
−それぞれの核酸にハイブリダイズする、ＰＣＲ増幅に適したプライマー；
−被検体に特異的な１対の第１結合試薬、たとえば抗体：これに多価近接プローブが二次的に結合する。

１態様においてキットは、１対または１トリプレットのストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、これらはビオチニル化された結合性部分と結合して、対またはトリプレットとして使用するための多価近接プローブを形成でき、該オリゴヌクレオチドは近接した際に相互作用して検出可能な生成物を形成することができる。

他の態様においてキットは、数個の対またはトリプレットのストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、各対または各トリプレットはビオチニル化された結合性部分と結合して多価近接プローブを形成でき、各対または各トリプレットは近接依存性相互作用した際に多数の被検体を同時検出するためのユニークヌクレオチド配列を生成する。

他の態様において本発明は、下記の用途：
−リガンド−受容体相互作用アンタゴニストをハイスループットスクリーニング法でスクリーニングする；その際、多価近接プローブはリガンドと受容体の複合体を検出できる；
−溶液中において、多価近接プローブ対の近接を撹乱しうる既知または未知の被検体を競合検出および／または定量する；
−大規模ライブラリー中のリガンド候補をスクリーニングする；
−大規模ライブラリー中において、多価近接プローブ対の近接を撹乱しうる薬物候補をスクリーニングする；
−感染性因子を検出する；
のための本発明方法および／またはキットの使用に関する
標準的な多価の概念は、ターゲット分子に対する結合剤の親和性を増大させるために利用されることが多い（３）。この場合、数個の結合部位をもつあるターゲット分子に対する親和性が低い数個の結合剤を、親和性増大のために多量体化する。これはたとえば、数個の結合剤を高分子フレキシブル”主鎖”に共有結合させて、標準多価リガンドを生成することにより達成できる（図２）。結合剤は他の残留結合により近接状態を維持するので多価複合体中の個々の結合剤が解離すると速やかに再会合するという事実から、多価複合体の安定化が得られる。多価リガンドの再会合速度は拡散依存性ではない。この標準的な多価の概念を利用して、数個の結合部位をもつある分子に対する結合剤の親和性を増大させる。多価による結合強度は、きわめて高い親和性に達する可能性がある（４）。

多価の他の概念および使用を、近接プロービングに関して本発明に開示する。近接プローブ対の両メンバーに数個の結合性部分を取り込ませることにより、数コピーのターゲット分子と複合体形成した２つの多価近接プローブの親和性が増大し、アッセイ感度が向上する。数個の結合性部分（たとえば抗体など）を反応性核酸と共にポリマー分子にコンジュゲートさせることにより、そのような多価近接プローブを構築できる（図３）。数コピーの反応性核酸をポリマー主鎖に結合させることもできる。リガンド間のリンカーのフレキシビリティーおよび長さが重要である。多価によって親和性を増大させるためには、リガンドは比較的自由に動ける必要がある。ある結合事象が次の結合に影響や立体障害を与えてはならない。選択する際には、使用する主鎖ポリマーのタイプ、十分なフレキシビリティー、および結合性部分の間隔を考慮すべきである。

発明の詳しい記載

モノマー状のターゲット被検体に１つの多価近接プローブが結合することによって結合親和性が増大することはないであろう。結合の解離により被検体は近接プローブから自由に拡散するからである。しかし、被検体上の別個の部位に対する特異性をもつ両方の多価近接プローブが被検体と複合体形成すると、数コピーのターゲット被検体が多価近接プローブ間に”挟まれた”状態になる（図４）。数個のターゲットが結合するので、協同効果により多価プローブ−ターゲット−多価プローブ複合体の結合強度が大幅に増大して、アッセイ感度が増大する。個々の結合事象がそれぞれ他を安定化した一種の”ジッパリング（ｚｉｐｐｅｒｉｎｇ）”効果が得られる。多価近接プローブ対と被検体試料のインキュベーションを開始した時点では、種々の量の挟まれたターゲットを含む多数の複合体が生成するであろう。インキュベーション時間の経過に伴って、最も安定なタイプの複合体（数個の挟まれたターゲットを含むもの）が増加するであろう。

タンパク質凝集体、たとえばプリオンタンパク質凝集体を検出する場合、数個のターゲットが相互にも結合して多価プローブ−ターゲット−多価プローブ複合体の安定性をさらに高めるので、多価近接プローブの協同結合効果はいっそう増大するであろう（図５）。

ＩｇＧなど多くの抗体が本来二価であり、抗体分子当たり２つの抗原結合エピトープを露出させている。それらが抗原を結合する際にこの二価を利用する能力は、２つのエピトープを連結しているヒンジ部のフレキシビリティー、および抗体の各エピトープへの抗原結合に立体障害を及ぼす可能性のある幾何学的配列に依存する（５）。抗体を用いて多価近接プローブを作製する場合、プローブが確実に１個より多いターゲット分子を結合できるように、プローブ当たり少なくとも２つの抗体を、抗体を統合する十分な長さのフレキシブル主鎖リンカーと共に含むべきである。

核酸をタンパク質（たとえば抗体）にコンジュゲーションにより結合させることによって近接プローブを作製する場合、反応生成物（核酸を含む抗体）を基質（遊離核酸および遊離抗体）から精製する必要がある。残留する遊離核酸はアッセイのバックグラウンドノイズを増大させ、遊離している結合性部分（抗体）はターゲット被検体上の結合部位を占めることにより信号を低下させるので、精製は重要である。この精製は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過など幾つかの手段で行うことができる。しかし、反応生成物は基質にかなりよく似ているので、容易に精製するのは困難である。多価近接プローブを作製する場合、生成物と基質の物理化学的相異、特にサイズの相異はより大きく、たとえばサイズ排除クロマトグラフィーによる精製または遠心分離を用いるサイズ排除メンブランフィルトレーションによる精製がはるかに容易になるであろう。

多価近接プローブの構築例
幾つかのタイプの主鎖ポリマーを用いて、多価近接プローブを作製できる。若干例は、多糖類、たとえばデキストラン、ポリヌクレオチド、たとえばＤＮＡおよびＲＮＡ、ポリペプチド、たとえばタンパク質、または有機ポリマー、たとえばポリエチレングリコールである。ポリマーは、結合性部分および核酸が共有結合または非共有結合する、ある種の反応基をもたなければならない。当業者は、多価リガンドを作製する際に多数の化学的合成方法を選択および適用でき、若干例は（６、７、８、９、１０）である。結合性部分を分離するリンカーのフレキシビリティーおよび長さは重要である。多価によって親和性を高めるために、リガンドは可能な限り自由に動くことができなければならない。ある結合事象が次の結合に影響や立体障害を与えてはならない。選択する際には、使用する主鎖ポリマーのタイプ、十分なフレキシビリティー、および結合性部分の間隔を考慮すべきである。近接プローブが被検体を結合した際に反応性核酸が相互作用するためには、互いに接近するのに十分なほど長いことが必要なので、反応性核酸の長さも重要である。主鎖ポリマーとしてポリヌクレオチド配列を用いると、核酸は塩基対合による特異的ハイブリダイゼーションによって容易に結合できる。核酸をベースとする主鎖ポリマーは、アミノ修飾デキストランのような反応性ポリマーにり優れた幾つかの重要な利点をもつ。結合性部分が結合する部位の個数および間隔の長さは、主鎖中に適切な核酸配列を用いることによって容易に制御できる。その際、ハイブリダイゼーション部位を分離するヌクレオチドを増減させて主鎖ポリマーの核酸配列組成を変更することにより、結合性部分の最適間隔を最適化できる。そのような核酸をベースとするポリマーのフレキシビリティーは、二本鎖度を変更することによっても制御できる。二本鎖ＤＮＡはより剛性でフレキシビリティーの少ない構造をもつので、主鎖の二本鎖を増加させるほど、フレキシビリティーが低下する。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるだけで、主鎖核酸を二本鎖にすることができる。

図６に、多価近接プローブを構築できる方法の若干例を示す。これらの例を多様に組み合わせて利用することもできる。多価近接プローブは、いずれもターゲット分子を結合できる少なくとも２つの結合性部分、および少なくとも１つの反応性核酸を含み、これらはすべて共有結合または非共有結合により互いに連結している。多価近接プローブのサイズ、ならびに反応性核酸および結合性部分の個数は、それらが連結されるポリマーの結合部位の長さおよび個数により変更できる。多価近接プローブ当たり２〜１００個の結合性部分が好ましい。プローブ当たりの結合性部分の個数が多いほど、プローブ−ターゲット−プローブ複合体の結合強度は大きくなるであろう。

場合により、ポリマー自体が反応性核酸および／または結合性部分を含むこともできる。図６Ｅは、主鎖核酸ポリマーが近接依存性相互作用に用いられる反応性核酸でもある多価近接プローブの例を示す。多価近接プローブ主鎖ポリマーそれぞれの、いずれか一方の（５’−または３’−）末端または両方の（５’−および３’−）末端が、近接依存性相互作用に関与する。両端が近接依存性ライゲーションすると、環状核酸が形成され、これをローリングサークル型増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）により増幅および検出できる（１１）。ＳＥＬＥＸ由来のアプタマー（特異的核酸配列を含むターゲット結合性部分）を用いる場合、主鎖核酸ポリマー自体が結合性部分を含むことができる。アプタマー配列がコンカテマー状でポリヌクレオチドポリマー中に含有されてもよく、これに核酸もハイブリダイゼーションまたは共有結合により結合することができる（図６．Ｆ）。そのようなコンカテマー状ポリマーは、適切な配列要素（アプタマー、および反応性核酸ハイブリダイゼーション部位）を含む環状オリゴヌクレオチドのローリングサークル型複製（１１）により作製できる。

多価近接プローブを構築する際、結合効率の定量性の低さおよび主鎖ポリマーの長さの不均一さが原因で、結合性部分：反応性核酸：主鎖ポリマーの比率が異なる多数の生成物が得られるであろう。これらの複合体は相互精製が困難であり、近接プローブの不均一混合物が得られるであろう。しかし、アッセイ性能を向上させる最も重要な精製は、連結していない遊離結合性部分および連結していない遊離反応性核酸の除去である。構築生成物をアフィニティー精製するために、主鎖ポリマーをたとえばビオチニル化によりアフィニティー標識し、アビジン樹脂上で精製することもできる。

近接プローブの精製に際して除去できなかった遊離結合性部分が残留する問題（信号低下の可能性）は、多価近接プローブについては一価と比較して小さい。その理由は、残留する遊離結合性部分（一価である）の親和性が多価近接プローブと比較して低いからである。このため、残留する遊離結合性部分が被検体への結合に対して競合する可能性は低く、多価近接プローブが結合するのを遮断する可能性は低い。

多価近接プローブ構築の具体例
ここに記載するのは、図６Ｄにも示した多価近接プローブの構築方法である。最初に近接プロービング反応性核酸オリゴヌクレオチドを結合性部分（この場合は抗体）に結合させる。まず、ＰＢＳ緩衝液中、２０倍過剰のＳＭＰＢ（スクシンイミジル４（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート）で抗体を誘導体化して、チオール反応性マレイミド官能基を抗体に付与する。チオールで末端修飾したオリゴヌクレオチドをＤＴＴで還元し、過剰のＤＴＴをサイズ排除ゲルクロマトグラフィーにより除去し、このオリゴヌクレオチドを速やかに等モル量の抗体に添加する。抗体とオリゴヌクレオチドの間に共有チオエステル結合が形成される。この反応性オリゴヌクレオチドは、多量体化に用いる高分子主鎖核酸コンカテマーを結合するための配列、および近接プローブ対中の他方の反応性オリゴヌクレオチドと反応するための配列、および相互作用生成物を増幅するための配列を含む。０．５体積の飽和硫酸アンモニウムを添加して遠心分離することによる硫酸アンモニウム沈殿法で、過剰の未反応オリゴヌクレオチドを除去する。これにより抗体および抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのみが沈殿する。沈殿をＰＢＳに再溶解する。

コンカテマー状の主鎖オリゴヌクレオチドを添加する。これは２つの配列を含み、それぞれが、予め抗体に共有結合させた反応性オリゴヌクレオチドの１つにワトソン・クリック塩基対合により結合できる。２つのコンジュゲートが主鎖オリゴヌクレオチドそれぞれに確実にハイブリダイズするように、高分子主鎖オリゴヌクレオチドは、反応性オリゴヌクレオチド−抗体コンジュゲートと対比して等モル未満の量で添加される。この主鎖オリゴヌクレオチドはビオチン標識を保有し、反応性核酸を保有しない過剰の抗体を除去するためにアビジン樹脂上で洗浄した後、過剰の遊離ビオチンで溶離することにより精製できる。この状態で、この二価近接プローブは、そのパートナーとなる近接プローブと一緒に近接プロービングアッセイに使用できる。パートナーは同じ様式で構築されるが、ターゲット分子の他の部位に特異的な抗体、および第１の反応性核酸とたとえばライゲーションにより近接依存性相互作用しうる他の反応性核酸配列を含む。

ストレプトアビジンネットワークによる多価近接プローブの構築
インスリンおよびＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）を検出できる下記の多価近接プローブ構築方式（後記参照）は、目的ターゲット分子に対する特異性をもつ他の抗体を用いる例であって、高分子を検出するのに使用できる。抗体以外のアフィニティー試薬、たとえばＤＮＡ／ＲＮＡアプタマー、抗体フラグメント、タンパク質、可溶性細胞表面受容体、ファージ・ディスプレイもしくはリボソーム・ディスプレイからのコンビナトリアル由来のタンパク質、またはその組合わせも使用できる。

ストレプトアビジンは、４個のビオチン分子をきわめて高い親和性で結合できる４量体タンパク質であり、結合技術に広く利用されている。ビオチンはＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質など、多様な生体分子に結合でき、ストレプトアビジンを添加するとこれらの生体分子を多量体化できる。ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン当たり２個のビオチニル化分子を優先的に結合する。生体分子が数個のビオチンを含有すると、高度の多価構造体を形成できる。これには、結合インキュベーションに際して適切な比率のストレプトアビジンとビオチニル化分子が必要である。試薬のモル比に関連した多量体化効率は、広く研究されている（１２、１３、１４）。多重ビオチン標識基質とストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの間で、比率２：１（基質：ストレプトアビジン）が超分子構造体（凝集体とも呼ばれる）を形成することが見いだされた（１２）。この原理方式を利用して多価近接プローブを作製する際には、多量体化し、かつ近接プロービングにおける感度の高い試薬が生成する、適正なモル比を用いるように注意を払わなければならない。図７は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用により作製した多価近接プローブを例示した模式図を示す。結合インキュベーション後、多様なサイズおよび価数をもつ多数の生成物が形成される。好ましい生成物を、ゲル濾過などの分離法により単離できる。以下の実施例では、そのような分離を行わなかった。

下記により抗体型結合性部分をもつ一対の多価近接プローブを構築した。２つのモノクローナル抗体をＮＨＳ−エステル法（Ｐｉｅｒｃｅ）で過剰のビオチニル化試薬を用いてビオチニル化して、抗体当たり数個のビオチン分子を付与した。これら２つの抗体（１および２と呼ぶ）は、ヒトインスリン上の２つの別個の部位に結合する。

チオール修飾オリゴヌクレオチドをマレイミド誘導体化ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）に結合させることにより、ストレプトアビジンと２つの異なる反応性オリゴヌクレオチドとの２つのコンジュゲートを構築した。第１のストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは：

を含有していた。第２のストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは：

を含有していた。これら２つのオリゴヌクレオチドの近接は、下記のオリゴヌクレオチド：

を用いる近接プロービングプロトコルにより分析できる。

ビオチニル化抗体１を第１のストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと共に、また抗体２を第２コンジュゲートと共に、種々のモル比でインキュベートすることにより、インスリン検出感度が最高となる最適比を見いだした（図８）。１０ｎＭのストレプトアビジンコンジュゲートを種々の濃度のビオチニル化抗体とプレインキュベートし、次いで０．１％のＢＳＡ、ポリ−Ａ ＤＮＡ、および２．５ｕＭの遊離ビオチン（これは残留するストレプトアビジンコンジュゲートをクエンチングする）を含むＰＢＳ緩衝液中に１００ｐＭストレプトアビジン濃度に希釈した。このクエンチングにより、２つの異なるストレプトアビジンコンジュゲートが１つの同一ビオチニル化抗体に結合してターゲットと無関係な近接を生じることはできなくなる。次いで２つの抗体−ストレプトアビジン複合体を５ｕＬの体積で、０．２ｎＭのインスリンを含有する試料またはインスリンを含有しない試料と混合した。

３７℃で３０分間のインキュベーション後、リアルタイム検出を伴うライゲーションおよび増幅に必要な試薬すべてを含有するミックス４５ｕＬを添加した。この添加後、試料は５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．４単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、４００ｎＭのライゲーション鋳型オリゴヌクレオチド、８０μＭのＡＴＰ、ＲＯＸ内部蛍光標準、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭのプライマー、５０ｎＭのＴａｑＭａｎプローブ、および１．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（ＡＢＩ）を含有していた。試料をＡＢＩ ７０００において下記の温度循環で操作した：９５℃で１０分、次いで９５℃で１５秒および６０℃で６０秒を４５回反復。

高いインキュベーションモル比で信号が低下するのは機能性近接プローブがターゲットインスリンを結合するのを遊離抗体が遮断するためであると推定するであろう（図８）。しかしそうではなく、２．５：１より高いビオチニル化抗体モル比でみられた信号低下は、ストレプトアビジンコンジュゲートとビオチニル化抗体のインキュベーションに際して、最適未満の試薬が形成された結果である。これは、２．５：１のインキュベーションを遊離ビオチンでクエンチングし、次いで過剰のビオチニル化抗体を補充した、追加実験で証明される。これは、高いモル比でインキュベートした場合のような有意の負の影響を信号に与えなかった（図示していない）。２．５：１の比率が多価近接プローブの構築に最適であるという所見は、２：１の比率で多量体生成物を得た文献と一致する（１２）。多量体近接プローブを使用前にたとえばゲル濾過で精製することにより、感度をさらに高めることができる。

別の実験で、ポリクローナル抗ＶＥＧＦ抗体バッチを、ある容器内で第１ストレプトアビジンコンジュゲートと共に、他の容器内で第２ストレプトアビジンコンジュゲートと共に、２つの近接プローブの多価を生じる比率でインキュベートした。これらのインキュベーション試料を遊離ビオチンで希釈およびクエンチングして、インスリン検出と同じプロトコルによるＶＥＧＦの検出に用いた。ＶＥＧＦ上の異なる部位に結合でき、ＶＥＧＦに対して多様な特異性をもつ数種類の抗体からなるポリクローナル抗体バッチにより、検出が可能となる。ポリクローナル抗体は、タンパク質に対して容易に産生され、１バッチの抗体を必要とするにすぎないので近接プロービング試薬の調製が簡略化される。

用いる近接プローブ濃度を増大させた場合のバックグラウンド信号増大の模擬実験である。 ポリマーにより連結した数個の結合性部分をもつ標準多価リガンドが、それらの結合性部分に対する数個の結合部位をもつターゲット分子に結合したものである。 結合性部分、主鎖フレキシブルポリマー、および反応性核酸からなる、多価近接プローブの例である。 数個のターゲット被検体がプローブの数個の結合性部分間に”挟まれ”ている、多価近接プローブ対の例である。第１の多価近接プローブは被検体上の部位Ａに特異的な結合性部分をもち、第２の多価近接プローブは被検体上の部位Ｂに特異的な結合性部分をもつ。 プリオンタンパク質凝集体のような凝集した被検体に結合している、多価近接プローブ対の例である。 多価近接プローブ対の若干例である。記号ｎは多価を生じる結合性部分の追加反復単位数であり、１〜１００が好ましい。追加の結合性部分が１、すなわちｎ＝１であれば、２つの結合性部分をもつ二価近接プローブが得られる。記号ｍは反応性核酸の追加反復単位数であり、０〜１０００が好ましい。追加結合性部分が０であれば、たった１つの反応性核酸をもつ多価近接プローブが得られる。

６．Ａ） クロスリンカーが結合性部分を多量体化し、反応性核酸はクロスリンカーに結合している。反応性核酸は結合性部分に結合していてもよい。

６．Ｂ） 核酸をベースとする主鎖ポリマーであって、結合性部分が主鎖に結合し、反応性核酸が塩基対合により主鎖にハイブリダイズしている。核酸主鎖ポリマーはコンカテマー状であってもよい。

６．Ｃ） 短かいオリゴヌクレオチド（１０〜１００ヌクレオチド）をまず結合性部分に結合させておく。結合性部分を保有するこのオリゴヌクレオチドを塩基対合により核酸ポリマーに連結させる。反応性核酸も塩基対合により主鎖に連結させる。

６．Ｄ） 反応性核酸を結合性部分に結合させて一価近接プローブを形成しておく。結合性部分を保有するこの反応性核酸を核酸ポリマーにハイブリダイズさせて（好ましくは２〜１００反復単位）、多価近接プローブを形成する。核酸ポリマーの代わりに、たとえば結合性部分に連結した反応性核酸に対する２つのハイブリダイゼーション部位をもつオリゴヌクレオチドを用いて、二価近接プローブを形成することもできる。

６．Ｅ） 主鎖ポリマーが、多量体化のためのポリマーとして作用するだけでなく反応性核酸としても作用する核酸（ｒ）で作製された、多価近接プローブの例。結合性部分は、主鎖核酸にハイブリダイズしたコンジュゲートした連結用オリゴヌクレオチドにより結合している。

６．Ｆ） コンカテマー状の核酸主鎖ポリマーに含まれたＳＥＬＥＸアプタマーをベースとする結合性部分（特異的核酸配列ｎからなる）をもち、反応性核酸（ｍ）がヌクレオチド塩基対合により主鎖に結合している、多価近接プローブの例。
ストレプトアビジン−ビオチン相互作用をベースとする多価近接プローブ。多重ビオチン標識抗体に、ストレプトアビジン−ＤＮＡコンジュゲートが結合している。Ｘは、結合性部分とストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの追加反復単位の個数であり、１〜１００が好ましい。 それぞれビオチン−ストレプトアビジンネットワークによって多価に構築された２種類のモノクローナル抗体を用いた、ヒトインスリンの多価近接プロービング検出の結果。多重ビオチニル化抗体とストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲート間の結合比は多様である。最高信号は２．５：１の結合比で達成され、この場合、高度の多価凝集体が形成される。サイクル閾値が低いのは、反応性核酸間のライゲーション事象数が高いことを示し、これは高いインスリン検出効率に対応する。信号はインスリンを含むもの、バックグラウンドはインスリンを含まないものを表わす。結果を標準偏差付きで示す。

Claims (22)

1. 溶液中の１以上の被検体を検出および／または定量する方法であって、
   ａ）２以上の多価近接プローブを前記被検体上のそれぞれの結合部位に結合させ、その際、該近接プローブは２〜１００の結合性部分および会合して対合した核酸を含み；
   ｂ）該結合性部分を被検体に結合させ、該核酸をそれらが互いに近接するなら相互作用させ；そして
   ｃ）該核酸間の相互作用の程度を検出および／または定量し；
   ただし、それら結合性部分および被検体がすべて核酸を含むわけではない
   ことを特徴とする方法。
2. さらに、
   ｄ）相互作用した核酸を増幅し、増幅生成物を検出／定量する
   ことを含む、請求項１に記載の方法。
3. 多価近接プローブの結合性部分が、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、核酸、たとえばアプタマー、可溶性細胞表面受容体、ファージ・ディスプレイもしくはリボソーム・ディスプレイからのコンビナトリアル由来のタンパク質、またはその組合わせから選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 工程ａ）の前に、結合性部分をビオチニル化し、ストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと共にインキュベートする、請求項３に記載の方法。
5. 被検体がタンパク質、タンパク質凝集体、プリオンおよび／または核酸である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 多価近接プローブの結合性部分に対する結合部位が、１つの同一被検体上または２つの接近した被検体上にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 結合性部分に対合した核酸の相互作用が、共通のスプリント鋳型へのハイブリダイゼーションおよび核酸末端のライゲーションによる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程ａ）において３つの多価近接プローブを結合させることを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 溶液中の１以上の被検体を検出および定量するキットであって、被検体に対する親和性をもつ２〜１００の結合性部分を含む２以上の多価近接プローブを含み、２つの多価近接プローブそれぞれが、相互作用しうる核酸と会合しているキット。
10. 多価近接プローブの結合性部分が、抗体、抗体フラグメント、タンパク質、核酸、たとえばアプタマー、可溶性細胞表面受容体、ファージ・ディスプレイもしくはリボソーム・ディスプレイからのコンビナトリアル由来のタンパク質、またはその組合せから選択される、請求項９に記載のキット。
11. 結合性部分がビオチニル化されており、さらに、結合性部分と会合していてもよく会合していなくてもよいストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む、請求項１０に記載のキット。
12. 多価近接プローブの結合性部分がポリマー主鎖上に付与された、請求項９、１０または１１に記載のキット。
13. さらに、リガーゼ；および反応性核酸それぞれにハイブリダイズするプライマーを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
14. さらに、核酸を結合するためのスプリント鋳型を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のキット。
15. 被検体を間接的に検出するための、被検体に対する１対の抗体などの第１結合試薬、および第１結合試薬を結合しうる多価近接プローブ対を含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のキット。
16. １対または１トリプレットのストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、これらはビオチニル化された結合性部分と結合して、対またはトリプレットとして使用するための多価近接プローブを形成でき、該オリゴヌクレオチドは近接した際に相互作用して検出可能な生成物を形成できる、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキット。
17. 数個の対またはトリプレットのストレプトアビジン−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み、各対または各トリプレットはビオチニル化された結合性部分と結合して多価近接プローブを形成でき、各対または各トリプレットは近接依存性相互作用した際に多数の被検体を同時検出するためのユニークヌクレオチド配列を生成する、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキット。
18. リガンド−受容体相互作用アンタゴニストをハイスループットスクリーニング法でスクリーニングするための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法および／または請求項９〜１７のいずれか１項に記載のキットの使用。
19. 溶液中の既知または未知の被検体を競合検出および／または定量するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法および／または請求項９〜１７のいずれか１項に記載のキットの使用。
20. 大規模プール中のリガンド候補をスクリーニングするための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法および／または請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキットの使用。
21. 大規模ライブラリーから薬物候補をスクリーニングするための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法および／または請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキットの使用。
22. 感染性因子を検出するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法および／または請求項９〜１５のいずれか１項に記載のキットの使用。

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