JP2023524129A - 反応混合物からの過剰なオリゴヌクレオチドの除去 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸の分野に関する。より具体的には、本発明は、核酸を含むインビトロ反応の分野に関する。
核酸の短鎖(「オリゴヌクレオチド」)を利用する反応は、反応混合物中に残っている過剰なオリゴヌクレオチドで終了することが多い。これらのオリゴヌクレオチドは、互いに相互作用するかまたはオフターゲットのサンプル核酸と相互作用することによって下流プロセスを妨げることができる。そのような相互作用は、必須の試薬を枯渇させ、所望の反応を妨げる。
本発明は、反応混合物から過剰なオリゴヌクレオチドを二重ヘアピン核酸で捕捉し、隔離することによって除去する方法である。過剰なオリゴヌクレオチドは、二重ヘアピン構造に連結され、下流の用途に干渉しないトポロジー的に円形の閉じた核酸鎖を形成する。
「核酸」という用語は、ヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式(例えば、ハイブリダイズする)で機能することができる天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む。
Claims (17)
- 反応混合物から望ましくないオリゴヌクレオチドを除去する方法であって、
a.前記反応混合物を、
i.5’-末端の第1のヘアピン、
ii.3’-末端の第2のヘアピン、および、
iii.前記5’-末端と前記3’-末端との間の一本鎖領域であって、除去すべき前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる配列を含む一本鎖領域、
を有する単一核酸鎖を含む二重ヘアピン核酸と接触させること、
b.前記除去すべきオリゴヌクレオチドを前記二重ヘアピン核酸にアニーリングすること、
c.前記除去すべきオリゴヌクレオチドを前記二重ヘアピン核酸の末端に連結し、それにより、前記反応混合物から前記望ましくないオリゴヌクレオチドを除去すること、
を含む、前記方法。 - 工程cの前に前記反応混合物をリガーゼと接触させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記反応混合物が、工程aの前にリガーゼを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記二重ヘアピン核酸が5’-リン酸基を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記一本鎖領域が、単一の中間領域に隣接して、前記除去すべきオリゴヌクレオチドに対して相補性の2つの領域を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記中間領域が、非ヌクレオチドスペーサーである、請求項5に記載の方法。
- 前記中間領域が、イノシンヌクレオチドを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記除去すべきオリゴヌクレオチドが、複数のオリゴヌクレオチドの間で変化する単一のバーコード領域に隣接する2つの定常領域を有する複数のオリゴヌクレオチドを含む、請求項5に記載の方法。
- 反応混合物からオリゴヌクレオチドを捕捉するための二重ヘアピン核酸であって、前記二重ヘアピン核酸が、
a.5’-末端の第1のヘアピン、
b.3’-末端の第2のヘアピン、および、
c.前記5’-末端と前記3’-末端との間の一本鎖領域、
を有する単一核酸鎖を含み、
前記一本鎖領域が、除去すべき前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる配列を含む、前記二重ヘアピン核酸。 - 前記一本鎖領域が、単一の中間領域に隣接して、前記除去すべきオリゴヌクレオチドに対して相補性の2つの領域を含む、請求項9に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記中間領域が、非ヌクレオチドスペーサーである、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記中間領域が、イノシンヌクレオチドからなる、請求項10に記載のオリゴヌクレオチド。
- 反応混合物中の複数の細胞中の複数の標的を検出する方法であって、
a.複数の細胞中の前記標的に、それぞれが前記標的の1つに特異的な複数の固有の結合剤を結合させること、
b.複数のサブコードオリゴヌクレオチドを、スプリットプール合成の連続ラウンド中に、前記複数の細胞中の前記結合剤のそれぞれに順序付けられた方法で付加すること、ここで、各ラウンド中の前記サブコードオリゴヌクレオチドがアニーリング領域を介して前のラウンドからの前記サブコードオリゴヌクレオチドに隣接してアニーリングする、および、前記隣接してアニーリングしたサブコードオリゴヌクレオチドを互いに共有結合させて、各細胞中に固有の細胞起源ヌクレオチドコードを作製すること、
c.前記反応混合物を、5’-末端の第1のヘアピン、3’-末端の第2のヘアピン、および、前記サブコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる前記5’-末端と前記3’-末端との間の一本鎖領域、を有する単一核酸鎖を含む二重ヘアピン核酸と接触させることによって過剰なサブコードオリゴヌクレオチドを除去すること、
を含む、前記方法。 - 前記サブコードオリゴヌクレオチドが、2つのアニーリング領域に隣接するバーコード領域を含み、前記二重ヘアピン核酸の前記一本鎖領域が、前記サブコードオリゴヌクレオチド中の前記アニーリング領域にハイブリダイズすることができる2つの配列に隣接する前記バーコード領域と長さが等しいスペーサーを含む、請求項13に記載の方法。
- 過剰な増幅プライマーを含まない増幅された標的核酸の溶液を調製する方法であって、
a.核酸合成を支持する試薬の存在下で、標的核酸を含有する反応混合物を、フォワード増幅プライマーおよびリバース増幅プライマーならびに熱安定性核酸ポリメラーゼと接触させること、
b.前記反応混合物を、前記フォワード増幅プライマーおよび前記リバース増幅プライマーのアニーリングおよび伸長に適した熱サイクリングプロファイルに供すること、
c.前記熱サイクリングプロファイルの完了後に、前記反応混合物を、核酸リガーゼならびに
i.5’-末端の第1のヘアピン、
ii.3’-末端の第2のヘアピン、および、
iii.前記5’-末端と前記3’-末端との間の一本鎖領域であって、前記フォワード増幅プライマーまたは前記リバース増幅プライマーにハイブリダイズすることができる、一本鎖領域、
を有する単一核酸鎖からなる二重ヘアピン核酸と接触させること、
d.前記フォワード増幅プライマーおよび前記リバース増幅プライマーを対応する前記二重ヘアピン核酸に連結し、それにより、前記フォワード増幅プライマーおよび前記リバース増幅プライマーを前記増幅された標的核酸の溶液から除去すること、
を含む、前記方法。 - 過剰な増幅プライマーを含まない増幅された標的核酸の溶液を調製する方法であって、
a.標的核酸を含有する反応混合物を、前記標的核酸に隣接してハイブリダイズすることができる第1のプローブおよび第2のプローブ、ならびに連結を支持する試薬の存在下で熱安定性リガーゼと接触させること、
b.前記反応混合物を、前記第1のプローブおよび前記第2のプローブを互いにアニーリングおよび連結に適した熱サイクリングプロファイルに供すること、
c.前記熱サイクリングプロファイルの完了後に、前記反応混合物を
i.5’-末端の第1のヘアピン、
ii.3’-末端の第2のヘアピン、および、
iii.前記5’-末端と前記3’-末端との間の一本鎖領域であって、前記第1のプローブまたは前記第2のプローブにハイブリダイズすることができる、一本鎖領域、
を有する単一核酸鎖からなる二重ヘアピン核酸と接触させること、
d.前記第1のプローブおよび前記第2のプローブを対応する前記二重ヘアピン核酸に連結し、それにより、前記第1のプローブおよび前記第2のプローブを前記増幅された標的核酸の溶液から除去すること、
を含む、前記方法。 - 過剰なアダプター分子を含まない核酸のライブラリーを形成する方法であって、
a.核酸を含む反応混合物をアダプター分子およびリガーゼと接触させること、
b.前記アダプター分子を前記核酸の末端に連結すること、
c.前記反応混合物を、
i.5’-末端の第1のヘアピン、
ii.3’-末端の第2のヘアピン、および、
iii.前記5’-末端と前記3’-末端との間の一本鎖領域であって、前記アダプター分子にハイブリダイズすることができる、一本鎖領域、
を有する単一核酸鎖からなる二重ヘアピン核酸と接触させること、
d.前記アダプター分子を前記二重ヘアピン核酸に連結し、それにより、増幅された標的核酸の溶液から前記アダプター分子を除去すること、
を含む、前記方法。
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