CN108753929A - 一种微流体芯片及其改性方法和在检测食品细菌数量上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微流体芯片及其改性方法和在检测食品细菌数量上的应用，包括：将微流体芯片上的微流管道内表面的–CH3基团改性为‑OH基团；再向微流管道内通入氨基硅烷试剂；干燥之后，向微流管道内通入表面经由‑COOH改性过的树枝状聚合物；将5’末端氨基化的适配体RCA的引物与其锁式探针的杂交连接产物嫁接到微流管道内表面上的树枝状聚合物上，其中锁式探针为待测目标致病菌的核酸适配体的互补序列，再将RCA反应试剂通入微流管道内，使适配体RCA启动生产串联长链适配体。本发明将两种不同功能的RCA反应结合使用，并采用树枝状聚合物对芯片内表面进行改性，提高检测过程中的目标识别抓取和信号增强，方便实现一体化检测。

Description

一种微流体芯片及其改性方法和在检测食品细菌数量上的 应用
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种微流体芯片及其改性方法和在检测食品细菌数量上的应用。
背景技术
近些年来，由食物引起的疾病越来越引起人们的重视。因此对于食品卫生检验领域，快速和灵敏的检测设备是十分重要的。同样对于食品加工企业和食品监测部门，如果能够快速的检测食品中的目标细菌数量，就可以提高食品质量的监控，从而有效实施对公共食品卫生与安全的保障。
目前用于检测食源性致病菌的常规方法主要有生化鉴定法、免疫学检测技术(ELISA)、PCR技术等。但这些方法均存在一定不足，如样品前处理和DNA提取等步骤操作复杂，检测周期长，检测灵敏度低等，亟待研发经济方便、快速灵敏的检测技术。而基于微流体芯片的生物传感器技术，凭借其高通量、微型化、自动化和易集成等优点成为研究开发的热点。
由于微流体芯片可以把复杂的化学过程集成在一个芯片中，近些年来也出现了不少以微流体芯片为基础快速检测的设备。例如电化学微流体芯片，阻抗微流体芯片等。这些芯片的检测原理大多是通过测量微流体设备在检测到目标细菌前后的电流或者电阻的变化来最终达到检测细菌数量的目的。这种设备的优势是能够分析极低数量的细菌，但是这种设备不易操作，而且设备整体的价格相对昂贵。
以微流体为基础的检测中的另一种设备是以光学(荧光染色，或者颜色的变化)作为检测原理的。这种检测机理的优点是检测信号能够很直观的观察并检测到，从而实现对目标细菌的定量。虽然此种方法设备相对便宜，但是为了减少食品样品中其他非目标粒子产生的噪音信号和对检测信号的干扰，这种方法对微流体材料的表面改性要求较高。
滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)技术是基于核酸扩增的信号放大技术，已用于检测细胞、蛋白质、核酸或其他小分子等。其工作原理是以环状DNA为模板，通过一个与锁式探针(可形成环状模板)两端互补的DNA引物，在DNA聚合酶的催化下将脱氧核苷酸(dNTPs)转变成单链DNA产物。RCA产物包含成百上千个与模板互补的DNA片段。相对于PCR(Polymerase chain reaction)，RCA作为恒温扩增核酸的一种，反应高效且条件温和，仪器运行成本低。滚环扩增用于食源性致病菌检测中的信号放大环节，有效提高检测信号。但客观上该技术仍需要通过提高对目标物的识别和抓取等方面的改进以提高检测灵敏度。
在基因芯片技术中，核酸适配体(aptamers)常被用于识别和抓取检测目标物。相比于抗体，适配体筛选获得后更容易体外大量合成，重复性好、稳定性高且易于贮存、成本较低，配合标记荧光后不影响适配体活性，且靶标广泛，包括农药、组织、细胞、病毒、蛋白质、毒素、维生素和过敏原等。常规用于微流体芯片的核酸适配体通常以单层连接到检测区，但是由于适配体体积较小，不利于接触和识别完整的细菌细胞等体积较大的目标物，其抓取效率低。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种微流体芯片的改性方法，利用RCA技术在微流体芯片内部表面原位生产长链串联适配体，对现有微流体芯片进行改性，制备得到一种可快速检测食品细菌数量的微流体芯片。
本发明的技术方案为一种微流体芯片的改性方法，包括以下步骤：
(1)将微流体芯片上的微流管道内表面的–CH3基团改性为-OH基团；
(2)所述步骤(1)反应完成之后，向所述微流管道内通入氨基硅烷试剂，进行氨基硅烷反应；
(3)干燥之后，向所述微流管道内通入表面经由-COOH改性过的树枝状聚合物，进行偶联反应；
(4)所述步骤(3)反应完成之后，将5’末端氨基化的适配体RCA的引物与其锁式探针的杂交连接产物嫁接到所述微流管道内表面上的树枝状聚合物上，其中所述锁式探针为待测目标致病菌的核酸适配体的互补序列，再将RCA反应试剂通入所述微流管道内，使适配体RCA启动产生串联长链适配体，反应完成后通过加热终止RCA反应，最后用磷酸盐缓冲液通入微流管道内进行清洗。
本发明中树枝状聚合物对微流体芯片内部的表面改性为适配体RCA提供大量的结合位点，并降低检测样品中杂质的非特异性吸附。本发明中RCA产物的序列由模板决定，因此可通过编辑模板序列得到含有目标序列的RCA产物，将目标物的核酸适配体的互补序列作为RCA的环形模板序列，可产生串联的核酸适配体。这种可产生串联核酸适配体的RCA反应，方便在微流体芯片上进行原位合成长链串联适配体，使抓取的适配体在数量上和空间分布上显著增大，提高抓取待测目标致病菌的效率，达到完整细胞检测，因此本发明不需要DNA或蛋白质等大分子物质的提取过程，且可显著提高目标细胞的抓取效率。
本发明中树状聚合物的选择可以有多种，作为优选，所述步骤(3)中树状聚合物为聚乙二胺树枝状聚合物。
作为优选，所述步骤(4)包括：
(4-1)以50μl反应体系为例，将2μM适配体RCA的引物和2μM锁式探针于95℃加热5min后迅速冷却至室温，放置37℃水浴30min后加入10U T4DNA连接酶，5μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，于室温下反应30min，然后加热至65℃并保持10min终止反应，得到适配体RCA的引物与其锁式探针的杂交连接产物；
(4-2)将所述杂交连接产物通过氨基羧基缩合反应嫁接到微流管道内表面之后，通入RCA试剂。以100μl反应体系为例，RCA试剂包括10U phi29DNA聚合酶，10μl phi29DNA聚合酶缓冲液，4μl dNTPs(10mM)，整个反应体系在37℃下反应10小时后，加热至65℃并保持10min终止反应。
作为优选，所述适配体RCA引物的序列为：SEQ ID No.1。
作为优选，所述适配体RCA引物的锁式探针的序列为：SEQ ID No.2。
本发明还提供了上述的改性方法改性得到的微流体芯片。
本发明还提供了一种上述的微流体芯片在检测食品细菌数量上的应用。
作为优选，包括以下步骤：
(1)将待测样品溶液通入所述微流管道内，当待测样品溶液中的目标致病菌被改性的微流体芯片的微流管道内表面识别并捕捉后，将信号放大RCA的适配体-引物复合物和锁式探针通入微流管道内，识别和吸附在目标致病菌表面；
(2)将与信号放大RCA特异性识别的荧光探针通入微流管道内，信号放大RCA反应激发后产生荧光探针结合位点；
(3)将微流体芯片反应区在荧光显微镜下观察拍照，所得荧光图片经图片处理软件转化为量化的荧光信号，并将检测信号与标准曲线进行对比达到定量检测食源性致病菌的目的。
本发明设计了可产生特定序列核酸适配体的RCA反应，并将其与信号放大RCA和树枝状聚合物结合，达到细菌检测的“三重”放大效果，可以提高以下检测效果：
(1)树枝状聚合物对微流体芯片内部的表面改性为适配体RCA提供大量的结合位点，并降低检测样品中杂质的非特异性吸附；
(2)适配体RCA产生大量重复串联的长链适配体，使抓取的适配体在数量上和空间分布上显著增大，提高抓取目标物的效率；
(3)信号放大RCA将被识别和抓取的目标物转化为荧光信号，进一步提高检测灵敏度。
作为优选，所述信号放大RCA的适配体-引物复合物的序列为：SEQ ID No.3；
所述信号放大RCA的适配体-引物复合物对应的锁式探针的序列为：SEQ ID No.4。
作为优选，所述荧光探针的序列为：SEQ ID No.5。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在:
(1)本发明使用RCA序列在微流体芯片内部原位生产长链串联的适配体，使适配体在数量上成倍增加，从而使捕捉目标细菌效率提高。此外，适配体长度上的显著增加也同时提高了适配体与目标细菌细胞的接触面积，从而提高识别和抓取效率，增强检测的灵敏度。
(2)本发明中适配体RCA反应在芯片内部原位生产适配体并直接使用，简化改性步骤，降低了检测成本。
(3)本发明将两种不同功能的RCA反应结合使用，并采用树枝状聚合物对芯片内表面进行改性，同时提高检测过程中的识别抓取和信号增强，方便实现一体化检测。
附图说明
图1为本发明中的工作原理示意图。
图2为本发明中细菌检测微流体芯片内部表面改性过程以及适配体RCA生产串联适配体示意图。
图3为本发明中RCA信号放大原理示意图。
图4为本发明的双层RCA用于微流体芯片以及现有的微流体芯片用于检测大肠杆菌E.coli O157:H7的荧光信号强度对比图。
具体实施方式
实施例1
第一部分：微流体芯片内部表面的改性。
首先，将表面羧基化的聚乙二胺树枝状聚合物(第七代，Generation 7)通过等离子处理嫁接到微流管道的内表面。微流管道由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)制成，并用3-氨丙基三甲氧基硅氧烷((3-aminopropyl)-trimethoxysilane，APTMS)氨基化。此过程为氨基羧基的缩合反应。(图2，步骤1-3，嫁接树枝状聚合物)此过程采用现有的方法，在此不做详细阐述。
然后，将5’末端氨基化的适配体RCA引物(primer 1)与其锁式探针(padlockprobe 1)杂交连接产物通过氨基羧基缩合嫁接到微流体芯片内表面上的树枝状聚合物上，再将RCA反应试剂通入，启动适配体RCA反应生产串联长链适配体，反应完成后通过加热终止RCA。将改性的微流体芯片内部管道用磷酸盐缓冲液清洗备用(图2，步骤4-5，原位生产串联的适配体产物)。
上述适配体RCA反应条件：
(1)以50μl反应体系为例，将适配体RCA的引物(2μM)和锁式探针(2μM)于95℃加热5min后冷却至室温，放在37℃水浴30min后加入10U T4DNA连接酶，5μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，于室温下反应30min，然后置于65℃并保持10min终止反应。此过程引物和锁式探针杂交连接成环状模板。
(2)以上连接产物嫁接到微流体芯片内表面后，通入RCA试剂。以100μl反应体系为例，RCA试剂包括10U phi29DNA聚合酶，10μl phi29DNA聚合酶缓冲液，4μl dNTPs(10mM)。整个反应体系在37℃下反应10小时后，然后置于65℃并保持10min终止反应。
第二部分：目标识别和检测信号放大
当目标致病菌被改性的微流体芯片内表面识别并捕捉后，将RCA反应试剂通入微流体从而启动RCA反应以产生长链RCA产物进一步放大信号。反应完成后通过加热至65℃并保持10min用以终止此RCA反应。
信号放大RCA反应条件：
(1)以50μl反应体系为例，将信号放大RCA的适配体-引物复合物(200nM)和锁式探针(200nM)于95℃加热5min后冷却至室温，放在37℃水浴30min后加入10U T4DNA连接酶，5μl 10×T4DNA连接酶缓冲液，于室温下反应30min，然后置于65℃并保持，10min终止反应。此过程适配体-引物复合物和锁式探针杂交连接形成环状模板。
(2)以上连接产物通入微流体芯片内部识别固定到待测目标致病菌的表面后，通入RCA试剂。以100μl反应体系为例，RCA试剂包括10U phi29DNA聚合酶，10μl phi29DNA聚合酶缓冲液，4μl dNTPs(10mM)。整个反应体系在37℃下反应2小时后终止反应(65℃，10min)。
最后，为了识别检测信号，将与RCA产物特异性识别的荧光探针通入上述微流管道，使其与信号放大RCA产物杂交，并用磷酸盐缓冲液冲洗管道内未结合的多余的荧光探针。
第三部分：荧光信号收集和处理
将微流体芯片反应区在荧光显微镜下观察拍照，所得荧光图片经图片处理软件转化为量化的荧光信号，并将检测信号与标准曲线进行对比达到定量检测食源性致病菌的目的。
上述适配体RCA和信号放大RCA的引物以及对应的锁式探针见表1。
表1双层RCA用于微流体芯片检测大肠杆菌E.coli O157:H7案例
本实施例的检测原理图如图1所示，图中从下往上：首先是微流体芯片内部表面的改性，改性时首先嫁接树枝状聚合物(其功能是提供大量的DNA序列结合位点和降低背景信号)到微流体芯片内表面，然后在树枝状聚合物基础上接枝适配体RCA的引物和环状模板，从而使RCA反应激发后可生产长链串联的适配体以提高对检测目标物的识别和抓取效率；当目标细胞被识别和抓取后，信号放大RCA的适配体-引物复合物和环状模板被通入并识别和吸附在目标细胞表面。信号放大RCA反应激发后产生大量荧光探针结合位点，与荧光探针杂交结合从而达到最终信号放大目的。
序列表
<110> 绿城农科检测技术有限公司
<120> 一种微流体芯片及其改性方法和在检测食品细菌数量上的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 1
tttttttttt gaaggactta gttactgtcg agcgat 36
<210> 2
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 2
aactaagtcc ttcatacggg agccaacacc atcttgtaca aatcgtcttg atatctgcac 60
atttgataga gcaggtgtga cggatatcgc tcgacagt 98
<210> 3
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 3
atccgtcaca cctgctctat caaatgtgca gatatcaaga cgatttgtac aagatggtgt 60
tggctcccgt attttttttt gtccgtgcta gaaggaaaca gttac 105
<210> 4
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 4
tagcacggac atatatgatg gaccgcagta tgagtatctc ctatcactac taagtggaag 60
aaatgtaact gtttccttc 79
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(unkown)
<400> 5
ttttagtatg agtatctc 18

Claims (10)

1.一种微流体芯片的改性方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将微流体芯片上的微流管道内表面的–CH3基团改性为-OH基团；
(2)所述步骤(1)反应完成之后，向所述微流管道内通入氨基硅烷试剂，进行氨基硅烷反应；
(3)干燥之后，向所述微流管道内通入表面经由-COOH改性过的树枝状聚合物，进行偶联反应；
(4)所述步骤(3)反应完成之后，将5’末端氨基化的适配体RCA的引物与其锁式探针的杂交连接产物嫁接到所述微流管道内表面上的树枝状聚合物上，其中所述锁式探针为待测目标致病菌的核酸适配体的互补序列，再将RCA反应试剂通入所述微流管道内，使适配体RCA启动生产串联长链适配体，反应完成后通过加热终止RCA反应，最后用磷酸盐缓冲液通入微流管道内进行清洗。
2.如权利要求1所述的微流体芯片的改性方法，其特征在于，所述步骤(3)中树状聚合物为聚乙二胺树枝状聚合物。
3.如权利要求1所述的微流体芯片的改性方法，其特征在于，所述步骤(4)包括：
(4-1)以50μl反应体系为例，将2μM适配体RCA的引物和2μM锁式探针于95℃加热5min后迅速冷却至室温，放置于37℃水浴30min后加入10U T4 DNA连接酶，5μl 10×T4 DNA连接酶缓冲液，于室温下反应30min，然后加热至65℃并保持10min后终止反应，得到适配体RCA的引物与其锁式探针的杂交连接产物；
(4-2)将所述杂交连接产物通过氨基羧基缩合反应嫁接到微流管道内表面之后，通入RCA试剂，以100μl反应体系为例，RCA试剂包括10U phi29 DNA聚合酶，10μl phi29 DNA聚合酶缓冲液，4μl/10mM dNTPs，整个反应体系在37℃下反应10小时后，再置于65℃下保持10min后终止反应。
4.如权利要求1～3任一所述的微流体芯片的改性方法，其特征在于，所述适配体RCA引物的序列为：SEQ ID No.1。
5.如权利要求4所述的微流体芯片的改性方法，其特征在于，所述适配体RCA引物的锁式探针的序列为：SEQ ID No.2。
6.一种如权利要求1～5任一所述的改性方法改性得到的微流体芯片。
7.一种权利要求6所述的微流体芯片在检测食品细菌数量上的应用。
8.如权利要求7所述的微流体芯片在检测食品细菌数量上的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样品溶液通入所述微流管道内，当待测样品溶液中的目标致病菌被改性的微流体芯片的微流管道内表面识别并捕捉后，将信号放大RCA的适配体-引物复合物和锁式探针通入微流管道内，使其识别并特异性吸附在目标致病菌表面；
(2)将与信号放大RCA特异性识别的荧光探针通入微流管道内，信号放大RCA反应激发后产生荧光探针结合位点；
(3)将微流体芯片反应区在荧光显微镜下观察拍照，所得荧光图片经图片处理软件转化为量化的荧光信号，并将检测信号与标准曲线进行对比达到定量检测食源性致病菌的目的。
9.如权利要求8所述的微流体芯片在检测食品细菌数量上的应用，其特征在于，所述信号放大RCA的适配体-引物复合物的序列为：SEQ ID No.3；
所述信号放大RCA的适配体-引物复合物对应的锁式探针的序列为：SEQ ID No.4。
10.如权利要求8或9所述的微流体芯片在检测食品细菌数量上的应用，其特征在于，所述荧光探针的序列为：SEQ ID No.5。
CN201810370194.2A 2018-04-24 2018-04-24 一种微流体芯片及其改性方法和在检测食品细菌数量上的应用 Pending CN108753929A (zh)

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