CN114280041B

CN114280041B - 基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114280041B
Application number: CN202111427832.8A
Authority: CN
Inventors: 羊小海; 周渊; 栾雅楠; 罗磊; 向东流; 王柯敏; 王青
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2021-11-26
Filing date: 2021-11-26
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2041-11-26
Also published as: CN114280041A

Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统及其制备方法和应用，检测系统包括暗盒、托盘和微流控芯片生物传感器，暗盒的上壁为用于承载智能手机的遮光上壁，遮光上壁设有与智能手机摄像头匹配的通孔，暗盒的至少一侧壁设有插口，托盘穿过插口位于暗盒的底壁上，微流控芯片生物传感器设于托盘上，微流控芯片生物传感器包括由下至上依次设置的底片、中间片和盖片，中间片设有用于检测不同目标的梳形通道，制备方法包括先制备微流控芯片生物传感器，再组装成检测系统。本发明的检测系统特别适合于现场快速分析，适用于多种信号产生模式的检测，在诊所、家庭、野外等现场的多目标快速检测中具有重要意义和市场前景。

Description

基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统。

背景技术

多目标物的同时检测一方面可以提高分析检测的准确性，例如许多疾病的发生发展与多种生物标志物的变化密切相关，多种目标物的同时检测有助于提高临床检验的准确性。另一方面，多种目标物的同时检测提高了分析通量以及减少了样品和试剂的消耗，可以缩短检测时间、降低检测成本，例如当爆发食品污染公共事件时，多目标物的同时检测有助于快速确认食品污染源，阻止危害的蔓延。

目前已经有大量的多目标同时检测方法被开发，如高效液相色谱、质谱、荧光、表面增强拉曼、电化学等，这些方法具有高的灵敏度和特异性，然而它们通常需要使用大型的仪器和专业的操作人员，难以应用于现场多目标物的快速、准确分析，因此开发便携式的多目标同时检测系统仍然是非常必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种通用、便携、特别适合现场快速分析的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

一种基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统，包括暗盒、托盘和微流控芯片生物传感器，所述暗盒的上壁为用于承载智能手机的遮光上壁，所述遮光上壁设有与智能手机摄像头匹配的通孔，所述暗盒的至少一侧壁设有插口，所述托盘穿过所述插口位于所述暗盒的底壁上，所述微流控芯片生物传感器设于所述托盘上，所述微流控芯片生物传感器包括由下至上依次设置的底片、中间片和盖片，所述中间片设有用于检测不同目标的梳形通道。

上述的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统，优选的，所述梳形通道包括中心通道以及多条与所述中心通道连通的分支通道，各分支通道分别设有检测不同目标的核酸探针。

上述的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统，优选的，所述遮光上壁为深色不透明上壁，所述遮光上壁的构成材料包括聚乳酸、聚碳酸酯(PC)、丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物(ABS)、聚对苯二甲酸乙二醇酯-1,4-环己烷二甲醇酯(PETG)、聚乙烯醇(PVA)和尼龙中的一种或多种，所述中间片为PMMA板，即聚甲基丙烯酸甲酯板，所述底片和盖片为硅胶贴膜。

上述的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统，优选的，所述智能手机内安装有用于将颜色G/B比值转化为浓度的应用程序。

上述的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统，优选的，所述遮光上壁上设有限位部，所述限位部为弹性限位部。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的制备方法，包括以下步骤：

S1、在中间片上刻制梳形通道，将底片、中间片和盖片由下至上依次叠放贴合，将多巴胺盐酸盐溶液加入到梳形通道中，一次室温孵育过夜后用水洗净并干燥，得到聚多巴胺修饰的微流控芯片，然后将不同目标物的核酸探针分别加入到聚多巴胺修饰的微流控芯片梳形通道内设有的不同分支通道中，二次室温孵育，进行交联反应，经Tris缓冲液或HEPES缓冲液冲洗，向聚多巴胺修饰的微流控芯片中加入BSA缓冲液将梳形通道充满，室温封闭，再经Tris缓冲液或HEPES缓冲液冲洗，得到微流控芯片生物传感器；

S2、将上述所得微流控芯片生物传感器放置于托盘上，将托盘穿过插口放置于暗盒的底壁上，将智能手机放置于暗盒的上壁上，得到基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统。

上述的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的制备方法，优选的，步骤S1中，所述二次室温孵育的时间为3h～6h，所述室温封闭的时间为2h～4h，所述多巴胺盐酸盐溶液的pH值为8.5～9.5，所述Tris缓冲液的pH值为7.2～7.4，所述BSA缓冲液的pH值为7.2～7.4，所述HEPES缓冲液的pH值为7.0～7.4。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统或者上述的制备方法制得的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统在分析检测领域中的应用。

上述的应用，优选的，该应用方法适用于多种信号产生模式Turn on模式和Turnoff模式的检测。Turn on模式为信号增强的模式，即信号强度随着目标物浓度的升高而增强，Turn off模式为信号减弱的模式，即信号强度随着目标物浓度的升高而减弱。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)目前多目标物的同时检测主要有两种模式：多重标记和空间分辨。多重标记模式需要使用多种标签分子，其检测通量容易受标签分子(如荧光染料)种类的限制。本发明中，采用空间分辨模式，通过设计梳子形的微流控芯片，将样品分配在不同的分支通道并独立完成不同目标物的检测，其不受标签分子种类的限制，探针的设计更加便利。并且本发明的检测方法是一种通用的，适用于多种信号产生模式“Turn on”和“Turn off”的多目标检测方法。本发明的微流控芯片具有微型化和集成化的特点，多通道的设计可以完成样品和试剂的分配，从而实现空间分辨模式的多目标同时检测。智能手机广泛普及，并且具有强大的信号采集、处理和分享功能，有利于构建便携式的分析检测设备。

(2)由本发明中的微流控芯片生物传感器和暗盒，结合智能手机和自主开发的手机数据处理App能够实现多目标的便携化同时检测。整个检测过程无需大型仪器设备，操作简便，而且芯片成本低廉，易于批量制作。

(3)本发明的方法具有通用性，适用于“Turn on”和“Turn off”两种信号产生模式。微流控芯片通过毛细作用即可自驱动流体，无需泵等外接设备，特别适合于现场快速分析。智能手机便携、功能强大，能够方便地采集和处理检测信号。整套检测系统无需大型仪器设备，容易操作，在诊所、家庭、野外等现场的多目标快速检测中具有重要的实际意义和市场前景。目前，基于微流控芯片和智能手机构建的通用，适合多种信号产生模式(“Turnon”和“Turn off”)的多目标物便携化检测方法及系统是尚未报道的。

附图说明

图1为本发明实施例1的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的立体结构透视图。

图2为本发明实施例1的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统中微流控芯片生物传感器的结构示意图。

图3为本发明实施例1的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的制备流程图。

图4为本发明实施例1的微流控芯片生物传感器的制备流程图。

图5为本发明实施例1的带LED灯的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的立体结构示意图。

图6为本发明实施例2的p53目标DNA检测的标准曲线图。

图7为本发明实施例3的赭曲霉毒素检测的标准曲线图。

图8为本发明实施例3的黄曲霉毒素检测的标准曲线图。

图9为本发明实施例3的伏马毒素检测的标准曲线图。

图10为本发明实施例3的“Sens-Mycotoxins”APP操作流程示意图。

图11为本发明实施例2的微流控芯片检测单碱基突变的原理图。

图12为本发明实施例3的微流控芯片同时检测三中真菌毒素的原理图。

图例说明：

1、暗盒；2、托盘；3、微流控芯片生物传感器；4、遮光上壁；5、限位部；6、底片；7、中间片；8、盖片；9、中心通道；10、分支通道。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售，单位mM为mmol/L，单位μM为μmol/L，单位nM为nmol/L。

实施例1

一种本发明的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统，如图1和图2所示，包括暗盒1、托盘2和微流控芯片生物传感器3，暗盒1的上壁为用于承载智能手机的遮光上壁4，遮光上壁4设有与智能手机摄像头匹配的通孔用于拍照成像，暗盒1的至少一侧壁设有插口，托盘2穿过插口位于暗盒1的底壁上，微流控芯片生物传感器3设于托盘2上，微流控芯片生物传感器3包括由下至上依次设置的底片6、中间片7和盖片8，中间片7设有用于检测不同目标的梳形通道。

本实施例中，梳形通道包括中心通道9以及多条与中心通道9连通的分支通道10，各分支通道10分别设有检测不同目标的核酸探针。

本实施例中，中间片7为PMMA板，底片6和盖片8为硅胶贴膜。

本实施例中，智能手机内安装有用于将颜色信号G/B值转化为浓度的应用程序Sens-Mycotoxins。

本发明的检测系统的检测步骤简述如下：(1)从微流控芯片生物传感器3的中心通道9加入样品或试剂并充满所有芯片通道；(2)分支通道10中的溶液分别与不同的核酸探针反应并产生颜色信号；(3)将产生颜色信号后的芯片放到托盘2；(4)将托盘2插入暗盒1，利用智能手机采集并处理颜色信号。通过两类目标物的检测对本方法进行了验证，第一类是p53目标序列的单碱基突变区分，第二类是玉米粉中赭曲霉毒素(OTA)、黄曲霉毒素(AFB1)和伏马毒素(FB1)的同时检测。

一种本实施例的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的制备方法，如图3所示，包括以下步骤；

S1、微流控芯片生物传感器的制备

如图4所示，将底片6、中间片7和盖片8由下至上依次叠放，组成微流控芯片，盖片8和底片6为带有粘性的硅胶贴膜，中间片7为雕刻有梳形通道(也称梳形流道)的PMMA板，梳形通道由一中心通道9以及多条与该中心通道9连通的分支通道10组成，中心通道9的尺寸为56×2×1，单位：mm，分支通道10的尺寸为15×1×1，单位：mm。该带有梳形流道的PMMA板是使用激光切割机切割得到，激光切割机具体为大族激光CMA0604-CO2-30，切割机参数为：最大光强50％，最小光强15％，速度10mm/s，焦距4mm，用去离子水超声清洗带有梳形流道的PMMA板，然后60℃烘箱烘干。通过裁剪得到25×23×1.4mm³硅胶贴膜作为盖片8和66×30×1.4mm³硅胶贴膜作为底片6，将硅胶贴膜盖片、带有梳形流道的PMMA板和硅胶贴膜底片贴合在一起构成完整的芯片。

首先将2mg/mL、pH 8.5的多巴胺盐酸盐溶液(10mM Tris-HCl，)加入到微流控芯片的所有通道中，室温下孵育过夜后用超纯水洗净，并用氮气吹干，得到聚多巴胺修饰的微流控芯片，聚多巴胺修饰一方面在分支通道10固定探针，另一方面使所有通道亲水。然后将1μM不同目标物的核酸探针分别加入到聚多巴胺修饰的芯片的不同分支通道10，室温孵育3h，通过氨基和羰基反应交联到芯片上。接下来用pH＝7.2、Tris缓冲液(10mM，150mM NaCl)冲洗芯片三次。最后向芯片中加入pH＝7.2、1mg/mL BSA(10mM Tris缓冲液，150mM NaCl)将所有通道充满，室温封闭2h，并用pH＝7.2、Tris缓冲液(10mM，150mM NaCl)冲洗三次，即得到微流控芯片生物传感器3。

S2、便携式读取设备的制备

如图5所示，将微流控芯片生物传感器3放置于托盘2上，暗盒1为侧面设有插口的方形空腔结构，将托盘2穿过插口放置于暗盒1的底壁上，暗盒1的上壁为遮光上壁4，用于避免外部光线对检测的影响，具体为黑色聚乳酸上壁，上壁设有一个与智能手机摄像头匹配的通孔用于拍照成像，即得到基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统。可通过SolidWorks设计暗盒的三维建模图形，使用3D打印机(Raised 3D Pro 2，上海复志)以聚乳酸为材料打印制作暗盒。3D打印机参数为：均衡模式，热台温度60℃，加热温度215℃。可将LED灯安装在暗盒1的一个侧壁上，LED灯用于为智能手机成像提供稳定的光源。

实施例2

一种本发明的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的应用，可采用实施例1的检测系统实施，具体地，在制备微流控芯片生物传感器3时，关于修饰不同目标物的核酸探针的操作为：将1μM随机序列的DNA链(Capture-R)和四种捕获探针(Capture-A,Capture-T,Capture-C和Capture-G)分别加入到修饰了聚多巴胺的芯片的五个分支通道10中，使微流控芯片生物传感器3上可进行单碱基突变的检测，各探针序列如表1所示。该应用包括以下步骤：

(1)绘制p53目标DNA检测的标准曲线

配制一系列浓度0、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、500nM的p53目标DNA标准样品，然后使用上述检测系统进行检测，通过现有“Color Grab”App采集得到不同浓度p53目标DNA标准样品检测得到的R/G/B值，然后拟合G/B比值与p53目标DNA浓度的关系曲线，得到如图6所示的校准曲线G/B＝0.12c(p53)+0.99，c为p53目标DNA浓度值，R²＝0.97。

(2)对四种单碱基突变类型进行区分：

将1nM p53目标DNA序列待测样品，加入修饰有探针的微流控芯片生物传感器3中，室温孵育1h，然后用50％的去离子甲酰胺洗脱分支通道10中杂交不稳定的靶标。接下来向微流控芯片生物传感器3中依次加入100nM生物素化的报告探针和0.2U/mL链霉亲和素化的碱性磷酸酶，室温孵育1h后，用pH＝7.2的Tris-HCl(10mM，150mM NaCl)冲洗通道三次，最后加入1mg/mL的pNPP与0.05mg/mL次甲基蓝的混合显色底物，室温反应60min后，用智能手机拍照并分析通道中溶液的颜色变化，得到颜色变化值G/B，将颜色变化值G/B代入步骤(1)获得的校准曲线即可得到p53目标DNA的浓度。例如得到的G/B值为1.12，将其带入校准曲线G/B＝0.12c(p53)+0.99中，即得到p53目标DNA的浓度1.08nM。

实施例3三种真菌毒素的同时检测

一种本发明的基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的应用，可采用实施例1的检测系统实施，具体地，在制备微流控芯片生物传感器3时，制备的是可同时检测多种真菌毒素的微流控芯片生物传感器，关于修饰不同目标物的核酸探针的操作为：首先将1μM三种真菌毒素核酸适配体分别与1μM对应的cDNA在恒温金属振荡浴中退火杂交2h，分别得到赭曲霉毒素探针、黄曲霉毒素探针、伏马毒素探针，然后将赭曲霉毒素探针加入到修饰了聚多巴胺的微流控芯片生物传感器的1、2、3号分支通道，将黄曲霉毒素探针加入到4、5、6号分支通道，将伏马毒素探针加入到7、8、9号分支通道，室温孵育3h后，用HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.0，120mM NaCl，5mM KCl和5mM MgCl₂)冲洗三次，最后加入1mg/mL BSA(HEPES缓冲液)室温封闭2h，用HEPES缓冲液冲洗三次。各探针和适配体序列如表1所示。该应用包括以下步骤：

(1)绘制真菌毒素检测的标准曲线

配制一系列浓度的真菌毒素标准样品，赭曲霉毒素：0.00、0.50、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20ng/mL；黄曲霉毒素：0.00、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20、50ng/mL；伏马毒素：0.00、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100n/mL。然后使用本实施例的检测系统进行检测，通过“Color Grab”App采集得到不同浓度真菌毒素检测对应的G/B值，最后拟合G/B值与真菌毒素浓度的关系曲线得到如图7至图9所示的校准曲线，如图7所示的校准曲线G/B＝-2.82c(OTA)+2.82，c为赭曲霉毒素浓度值，R²＝0.92，如图8所示的校准曲线G/B＝-1.39c(AFB1)+2.84，c为黄曲霉毒素浓度值，R²＝0.98，如图9所示的校准曲线G/B＝-0.23c(FB1)+2.84，c为伏马毒素浓度值，R²＝0.93。

如图10所示，接下来使用“C++编译器”根据校准曲线来开发数据处理App“Sens-Mycotoxins”，具体地，通过APP“C++编译器”开发数据处理APP“Sens-Mycotoxins”，的开发代码如下，该APP可适用于大部分普通市场售卖手机。

软件开发代码如下所示：

#include<stdio.h> 编译预处理命令

int main() 声明整型主函数

{

float G1,B1,G2,B2,G3,B3,Y1,Y2,Y3,C1,C2,C3；声明浮点型变量printf(“Please enter values of G(OTA),B(OTA),G(AFB1),B(AFB1),G(FB1),B(FB1)(Separated by spaces):\n”)；输入值

scanf(“％f％f％f％f％f％f”,&G1,&B1,&G2,&B2,&G3,&B3)；将输入值赋予变量

Y1＝G1/B1；

Y2＝G2/B2；

Y3＝G3/B3；

If(Y1<1.41)printf(“Please measure OTA after dilution.\n”)；条件输出

else{C1＝(2.82-Y1)/2.82；

if(C1<0)printf(“OTA measure error,please re-measure.\n”)；条件输出

else printf(“Concentration of OTAis％.2f ng/mL.\n”,C1)；}；

if(Y2<1.45)printf(“Please measure AFB1 after dilution.\n”)；条件输出

else{C2＝(2.84-Y2)/1.39；

if(C2<0)printf(“AFB1 measure error,please re-measure.\n”)；条件输出

else printf(“Concentration of AFB1 is％.2f ng/mL.\n”,C2)；}；

if(Y3<1.69)printf(“Please measure FB1 after dilution.”)；条件输出

else{C3＝(2.84-Y3)/0.23；

if(C3<0)printf(“FB1 measure error,please re-measure.”)；条件输出

else printf(“Concentration of FB1 is％.2f ng/mL.”,C3)；}

}

(2)同时检测三种真菌毒素：

首先将真菌毒素阴性样品溶液加入到检测系统的微流控芯片生物传感器的1、4、7号分支通道，阳性样品溶液加入到芯片生物传感器的2、5、8号分支通道，待测样品溶液加入到芯片生物传感器的3、6、9号分支通道，室温孵育3h后用HEPES缓冲液冲洗三次。然后从芯片生物传感器的中心通道9加入0.2U/mL链霉亲和素化的碱性磷酸酶，室温孵育1h后，用HEPES缓冲液冲洗三次。最后从芯片生物传感器中心通道9加入1.5mg/mL对硝基苯磷酸二钠和0.5mg/mL次甲基蓝的混合底物溶液。室温反应60min后用智能手机拍照并分析通道中溶液的颜色变化，加入阴性样品的分支通道溶液为绿色，加入阳性样品的分支通道溶液为蓝色，加入待测样品的分支通道如果含有真菌毒素，溶液也为蓝色。最后，将检测得到的G和B的值输入数据处理App“Sens-Mycotoxins”，即可得到待测样品溶液。例如赭曲霉毒素A检测中G/B值为2.5，输入数据处理App后得到的浓度为0.11ng/mL。同理，黄曲霉毒素B1检测中的到的G/B为0.7，输入数据处理App后得到的浓度为1.52ng/mL，伏马毒素检测中G/B值为2.6，输入数据处理App后得到的浓度为1.08ng/mL。

本发明微流控芯片生物传感器的传感机理包括两种信号模式：

1、信号“Turn on”模式：

如图11所示，以单碱基突变检测为例展示了“Turn on”模式的工作原理。首先从微流控芯片生物传感器的中心通道9加入目标物(如p53-G)并使其与四种捕获探针杂交，然后使用去离子甲酰胺洗脱掉未完全杂交的目标物，接下来加入生物素化的报告探针和链霉亲和素化的碱性磷酸酶，只有在完全杂交(即核酸探针根据碱基互补配对原则完全互补)的分支通道形成酶标复合物，最后加入对硝基苯磷酸二钠(pNPP)和次甲基蓝(MB)的混合溶液，在完全杂交的分支通道中的溶液由蓝色变成绿色，而其他分支通道仍保持蓝色。

2、信号“Turn off”模式：

如图12所示，以真菌毒素的检测为例展示了“Turn off”模式的工作原理。微流控芯片生物传感器3的分支通道10通过互补链(即cDNA)固定赭曲霉毒素、黄曲霉毒素和伏马毒素的核酸适配体探针。每种真菌毒素的检测均设计有阴性对照、阳性对照和实验组，分别加入阴性样品、阳性样品和待测样品。阴性对照组由于不存在真菌毒素，核酸适配体仍与互补链结合，加入链霉亲和素化的碱性磷酸酶后形成酶标复合物，使混合底物溶液由蓝色变成绿色，而其他分支通道的混合底物溶液仍保持蓝色。

表1实施例2和实施例3中各探针和适配体的序列

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统及其制备方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(40)

<223> 根据实验要求而设计，作为捕获探针-R的核苷酸序列

<400> 1

ccctcctttc cttcgacgta gatctgctgc gttgttccga 40

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为捕获探针-A的核苷酸序列

<400> 2

gggcagagcc gcctcacaac c 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 根据实验要求而设计，作为捕获探针-T的核苷酸序列

<400> 3

gggcagtgcc tcacaacc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 根据实验要求而设计，作为捕获探针-C的核苷酸序列

<400> 4

gggcagcgcc tcacaacc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 根据实验要求而设计，作为捕获探针-G的核苷酸序列

<400> 5

gggcagggcc tcacaacc 18

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 根据实验要求而设计，作为突变型p53-A的核苷酸序列

<400> 6

ggttgtgagg cactgcccaa gcgagcactg cccaacaaca ccagc 45

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 根据实验要求而设计，作为突变型p53-T的核苷酸序列

<400> 7

ggttgtgagg ctctgcccaa gcgagcactg cccaacaaca ccagc 45

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 根据实验要求而设计，作为突变型p53-C的核苷酸序列

<400> 8

ggttgtgagg ccctgcccaa gcgagcactg cccaacaaca ccagc 45

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(45)

<223> 根据实验要求而设计，作为野生型p53-G的核苷酸序列

<400> 9

ggttgtgagg cgctgcccaa gcgagcactg cccaacaaca ccagc 45

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(27)

<223> 根据实验要求而设计，作为生物素修饰的报告探针的核苷酸序列

<400> 10

gctggtgttg ttgggcagtg ctcgctt 27

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223> 根据实验要求而设计，作为赭曲霉毒素核酸适配体的核苷酸序列

<400> 11

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36

<210> 12

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> 根据实验要求而设计，作为赭曲霉毒素核酸适配体的互补DNA的核苷酸序列

<400> 12

tgtccgatgc tc 12

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(51)

<223> 根据实验要求而设计，作为黄曲霉毒素核酸适配体的核苷酸序列

<400> 13

agttgggcac gtgttgtctc tctgtgtctc gtgcccttcg ctaggcccac a 51

<210> 14

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(14)

<223> 根据实验要求而设计，作为黄曲霉毒素核酸适配体的互补DNA的核苷酸序列

<400> 14

tgtgggccta gcga 14

<210> 15

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(96)

<223> 根据实验要求而设计，作为伏马毒素核酸适配体的核苷酸序列

<400> 15

ataccagctt attcaattaa tcgcattacc ttataccagc ttattcaatt acgtctgcac 60

ataccagctt attcaattag atagtaagtg caatct 96

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(15)

<223> 根据实验要求而设计，作为伏马毒素核酸适配体的互补DNA的核苷酸序列

<400> 16

agattgcact tacta 15

Claims

1.一种基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统在分析检测领域中的应用，其特征在于，该应用方法适用于多种信号产生模式Turn on模式和Turn off模式的检测，

在Turn on模式时：首先从微流控芯片生物传感器(3)的中心通道(9)加入目标物并使其与四种捕获探针杂交，然后使用去离子甲酰胺洗脱掉未完全杂交的目标物，接下来加入生物素化的报告探针和链霉亲和素化的碱性磷酸酶，只有在完全杂交的分支通道形成酶标复合物，最后加入对硝基苯磷酸二钠和次甲基蓝的混合溶液，在完全杂交的分支通道中的溶液由蓝色变成绿色，而其他分支通道仍保持蓝色；该模式用于对四种单碱基突变类型进行区分；

在Turn off模式时：微流控芯片生物传感器(3)的分支通道(10)通过互补链固定赭曲霉毒素、黄曲霉毒素和伏马毒素的核酸适配体探针，每种真菌毒素的检测均设计有阴性对照、阳性对照和实验组，分别加入阴性样品、阳性样品和待测样品，阴性对照组由于不存在真菌毒素，核酸适配体仍与互补链结合，加入链霉亲和素化的碱性磷酸酶后形成酶标复合物，使混合底物溶液由蓝色变成绿色，而其他分支通道的混合底物溶液仍保持蓝色；

所述基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统包括暗盒(1)、托盘(2)和微流控芯片生物传感器(3)，所述暗盒(1)的上壁为用于承载智能手机遮光上壁(4)，所述遮光上壁(4)设有与智能手机摄像头匹配的通孔，所述暗盒(1)的至少一侧壁设有插口，所述托盘(2)穿过所述插口位于所述暗盒(1)的底壁上，所述微流控芯片生物传感器(3)设于所述托盘(2)上，所述微流控芯片生物传感器(3)包括由下至上依次设置的底片(6)、中间片(7)和盖片(8)，所述中间片(7)设有用于检测不同目标的梳形通道；

所述梳形通道包括中心通道(9)以及多条与所述中心通道(9)连通的分支通道(10)，各分支通道(10)分别设有检测不同目标的核酸探针；中心通道(9)的尺寸为56×2×1，单位：mm，分支通道(10)的尺寸为15×1×1，单位：mm；

所述遮光上壁(4)为深色不透明上壁，所述遮光上壁(4)的构成材料包括聚乳酸、聚碳酸酯、丙烯腈-苯乙烯-丁二烯共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯-1,4-环己烷二甲醇酯、聚乙烯醇和尼龙中的一种或多种，所述中间片(7)为PMMA板，所述底片(6)和盖片(8)为硅胶贴膜；

所述智能手机内安装有用于将颜色G/B比值转化为浓度的应用程序。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述遮光上壁(4)上设有限位部(5)，所述限位部(5)为弹性限位部。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统的制备方法，包括以下步骤：

S1、在中间片(7)上刻制梳形通道，将底片(6)、中间片(7)和盖片(8)由下至上依次叠放贴合，将多巴胺盐酸盐溶液加入到梳形通道中，一次室温孵育过夜后用水洗净并干燥，得到聚多巴胺修饰的微流控芯片，然后将不同目标物的核酸探针分别加入到聚多巴胺修饰的微流控芯片梳形通道内设有的不同分支通道(10)中，二次室温孵育，进行交联反应，经Tris缓冲液或HEPES缓冲液冲洗，向聚多巴胺修饰的微流控芯片中加入BSA缓冲液将梳形通道充满，室温封闭，再经Tris缓冲液或HEPES缓冲液冲洗，得到微流控芯片生物传感器(3)；

S2、将上述所得微流控芯片生物传感器(3)放置于托盘(2)上，将托盘(2)穿过插口放置于暗盒(1)的底壁上，将智能手机放置于暗盒(1)的上壁上，得到基于微流控芯片和智能手机的便携式多目标同时检测系统。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤S1中，所述二次室温孵育的时间为3h～6h，所述室温封闭的时间为2h～4h，所述多巴胺盐酸盐溶液的pH值为8.5～9.5，所述Tris缓冲液的pH值为7.2～7.4，所述BSA缓冲液的pH值为7.2～7.4，所述HEPES缓冲液的pH值为7.0～7.4。