CN107003295A - 测定分析物电荷的设备和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了包括孔和施加的电场的传感器，其能够检测分析物诸如核酸。根据各个实施方式，传感器包括流体室，其具有其间有隔膜的电相反部分，隔膜提供适合于电解质在流体室的电相反部分之间通过的孔并具有在孔附近束缚的至少一种带电分析物；第一电路，其配置为施加能够使电解质穿过孔和牵拉至少一种带电分析物进入孔的电场；和第二电路，其配置为测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。还提供了使用该传感器例如测序核酸分子的方法。

Description

测定分析物电荷的设备和方法
交叉引用
本申请要求2014年6月19日提交的美国临时专利申请序号62/014,595以及附录A-C的权益；该专利文件通过引用全部并入本文中。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明由美国政府支持在美国国立卫生研究院(NIH)的合同号NIH P01HG000205下完成。
背景技术
在生物技术领域内对核酸传感器存在极大兴趣，核酸传感器可以代替目前流行的基于光学的生物传感器。虽然在核酸研究中已经有众多理论进展，但是执行研发的方法(无论是诊断患者的疾病还是研究致病性状)的成本经常妨碍它们进入临床情况的选用。例如，虽然人基因组测序的成本已经从$30亿大幅地降低至$2万，但是这对用于常规临床环境依然太过昂贵。基于光学的感测(其往往操作耗时，需要改性的荧光试剂，需要庞大的光源和需要昂贵的成像仪器)被视为降低基因组学成本的主要瓶颈。虽然集成的电传感器似乎提供了许多优于光学传感器的优势，但是最近的方法或者在可制造性上具有限制或者已经显示差的稳健性。
发明内容
本文认识到，需要用于检测分析物诸如核酸的改进的传感器(如，其更加灵敏，更加稳健，和/或更加容易制造)。在各个方面中，本公开内容提供了这样的传感器和使用传感器例如测序核酸分子的方法。
本公开内容的各个方面涉及用于检测带电分析物的传感器和使用传感器的方法。传感器包括具有其间有隔膜的电相反部分(如，顶部分和底部分)的流体室。隔膜提供孔，其适合于电解质在流体室的电相反部分之间通过(如，从顶部分至底部分)并且具有在孔附近束缚的至少一种带电分析物；第一电路，其配置为施加能够使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔的电场。传感器进一步包括第二电路，其配置为在至少一种带电分析物被牵拉进入孔后测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。
第二电路任选地包括用于测量信号的感测电极，其中感测电极以远离至少一种带电分析物的距离定位。该距离可以是与至少一种带电分析物相关的德拜长度的至少2倍。使用德拜休克尔方程式：计算德拜长度，其中AD＝德拜长度，ε＝电常数，k＝玻耳兹曼常数，T＝温度，以及C0＝离子浓度。在各个实施方式中，各自的孔的大小或直径(和/或形状)可以按需改变，以使带电分析物的某些类型(具有对应大小)穿过。作为一个实例，当使用具有50nm和3μm之间的厚度的隔膜时，某些带电分析物可以适合于直径大小在25nm和2000nm之间的孔。对于其他分析物，诸如较小大小的分析物，孔具有至少大约10纳米(nm)的直径。电场可以具有至少大约105伏每米(V/m)的强度。至少一种带电分析物可以具有围绕其的电双层(EDL)并且电场可以能够去屏蔽(de-screening)EDL。进一步，隔膜和孔的壁可以具有围绕它们的EDL并且电场可以能够去屏蔽EDL。电场可以能够产生非平衡传输条件。隔膜可以是电绝缘的。进一步，隔膜可以由石墨烯、氧化铝(Al2O3)、二氧化硅(SiO2)或氮化硅(Si3N4)组成(如，其是和/或可以是电绝缘材料)。第一电路可以包括在流体室的第一电相反部分(如，顶部分)中的第一电极和在流体室的第二电相反部分(如，底部分)中的第二电极。第二电路可以包括在孔附近嵌入隔膜的电极。第二电路可以包括能够放大信号的放大器。放大器可以在距离孔大约5000μm内。信号可以与至少一种带电分析物的电荷成线性比例。至少一种带电分析物可以是核酸分子。进一步，至少一种带电分析物可以具有至少大约40e-的净电荷。然而，至少一种带电分析物可以具有低于或高于大约40e-的净电荷。电解质可以具有大约100μM至大约1M的离子强度。进一步，至少一种带电分析物可以通过分子结构被束缚在孔附近和/或被固定。进一步，传感器可以具有多个孔，多个带电分析物被牵拉进入其中。进一步，多个带电分析物可以是纯系的(clonal)。在另一方面，公开了一种装置，其中装置具有本文中详细说明的多个传感器。
其他相关实施方式涉及用于检测带电分析物的工具盒。工具盒包括至少一种带电分析物，和传感器。传感器包括具有其间有隔膜的电相反部分(如，顶部分和底部分)的流体室，隔膜提供(或限定)孔，其适合于电解质在流体室的电相反部分之间通过(如，从顶部分至底部分)并且具有在孔附近束缚的至少一种带电分析物(如，充分靠近孔用于本文中描述的电场相互作用)。传感器还包括第一电路，其配置为施加能够使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔的电场。传感器还包括第二电路，其配置为在至少一种带电分析物被牵拉进入孔后测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。隔膜可以是电绝缘的。进一步，隔膜可以由石墨烯、氧化铝(Al2O3)、二氧化硅(SiO2)或氮化硅(Si3N4)组成。第一电路可以包括在流体室的第一电相反部分(如，顶部分)中的第一电极和在流体室的第二电相反部分(如，底部分)中的第二电极。第二电路可以包括在孔附近嵌入隔膜的电极。第二电路可以包括能够放大信号的放大器。放大器可以在距离孔大约5000μm内。信号可以与至少一种带电分析物的电荷成线性比例。至少一种带电分析物可以是核酸分子。进一步，至少一种带电分析物可以具有至少大约40e-的净电荷。然而，至少一种带电分析物可以具有低于或高于大约40e-的净电荷。电解质可以具有大约100μM至大约1M的离子强度。进一步，传感器可以具有多个孔，多个带电分析物被牵拉进入其中。进一步，多个带电分析物可以是纯系的。
根据其他相关实施方式，本公开内容的方面涉及用于检测带电分析物的方法。方法包括提供具有介于隔膜两边的电相反部分(如，顶部分和底部分)的流体室，电相反部分之一(如，顶部分)具有电解质，隔膜提供孔，其适合于电解质在流体室的电相反部分之间通过(如，从顶部分至底部分)并且具有在孔附近束缚的至少一种带电分析物。方法进一步包括施加电场以使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔；和在至少一种带电分析物被牵拉进入孔后测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。方法任选地包括牵拉至少一种带电分析物至孔的周围附近的位置。在该方法中，第一电路可以施加电场。第二电路可以测量信号。
本公开内容的另一相关方面涉及一种方法，其包括提供具有介于隔膜两边(如，由隔膜分开)的电相反部分(如，顶部分和底部分)的流体室，其中电相反部分之一(如，顶部分)包括电解质，隔膜提供适合于电解质在流体室的电相反部分之间通过(如，从顶部分至底部分)的孔；在孔附近束缚至少一个核酸分子；邻近至少一个核酸分子的第一位置使核酸引物杂交至至少一个核酸分子；施加电场以使电解质穿过孔并牵拉至少一个核酸分子进入孔；测量指示至少一个核酸分子和核酸引物的电荷的信号；和用与至少一个核酸分子的下个位置互补的核苷酸延伸核酸引物，由此增加核酸引物的电荷的大小。可以重复前面涉及施加、测量和延伸的步骤，来测序核酸分子。第一电路可以施加上面提到的电场。第二电路可以测量上面提到的信号。
另一相关方面涉及用于检测核酸分子的方法。方法包括提供具有由隔膜分开的顶部分和底部分的流体室，顶部分包括电解质，隔膜提供适合于电解质从流体室的顶部分通过至底部分的孔；在孔附近束缚至少一种带电分析物；施加电场以使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔；和在至少一种带电分析物被牵拉进入孔后测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。第一电路可以施加上面提到的电场。第二电路可以测量上面提到的信号。
通过下面详细的描述，本公开内容的额外的方面和优势对本领域技术人员将容易变得清楚，其中仅显示和描述本公开内容的说明性实施方式。应当认识到，本公开内容能够有其他和不同的实施方式，并且其若干细节能够有在各个明显的方面的修改，全部都不背离本公开内容。因此，附图和描述实质上被看作说明性的，而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体地和单独地指示通过引用并入一样。
附图说明
在所附权利要求中具体地叙述了本发明的新特征。通过参考下面的叙述了其中利用本发明的原理的说明性实施方式的详细描述以及附随的附图或图(本文中也为“图(FIG.和FIGs)”)将获得对本发明的特征和优势的更好的理解，其中：
图1A显示了本公开内容的传感器的横截面剖视图的实例；
图1B显示了本公开内容的传感器的额外的实例；
图2显示了使用本公开内容的传感器执行夹心免疫测定的实例；
图3显示了使用本公开内容的传感器执行分析物-抗体或肽-抗体结合测量的实例；
图4显示了本公开内容的封装的传感器的横截面剖视图的实例；
图5A显示了本公开内容的无源传感器的实例；
图5B显示了具有多个孔的本公开内容的传感器的额外的实例；
图6显示了具有暴露的感测电极的本公开内容的传感器的实例；
图7A显示了本公开内容的有源传感器的实例；
图7B-E显示了本公开内容的有源传感器的多个实例；
图8显示了使用本公开内容的传感器执行杂交测量的实例；
图9A显示了在使用本公开内容的传感器执行合成测序(sequencing-by-synthesis)(SBS)法中的初始步骤的实例；
图9B显示在使用本公开内容的传感器执行SBS法中的随后的步骤的实例；
图9C显示使用本公开内容的传感器执行SBS反应的方法的额外的实例；
图10显示了将核酸分子附接至本公开内容的传感器的表面的实例；
图11显示了本公开内容的传感器以及其操作的实例；
图12A显示了本公开内容的装置的电子显微镜图像的实例；
图12B显示了本公开内容的孔的电子显微镜图像的实例；
图13显示了本公开内容的传感器及其操作的实例；
图14A显示了用于模拟其操作的本公开内容的装置的实例；
图14B-D显示了操作图14A的装置的模拟；
图15显示了本公开内容的传感器的等效电路模型的实例；
图16显示了从操作本公开内容的传感器获得并用于确定图15的等效电路模型的电路元件的数据的实例；
图17显示了具有设计的感测区域的本公开内容的传感器的实例；
图18显示了与印刷电路板配接(interface)的本公开内容的传感器的实例；
图19显示了集成有本公开内容的传感器的流体池的实例；
图20显示了用于操作本公开内容的传感器的装置的实例；
图21A显示了本公开内容的集成的传感器阵列的电路的实例；
图21B-C显示了用于本公开内容的集成的传感器阵列的额外的电路的实例；
图22显示了在本公开内容的传感器中去屏蔽的物理学实例；和
图23显示了用于操作本公开内容的传感器的计算机系统的实例。
具体实施方式
虽热在本文中已经显示并描述了本发明的各种实施方式，但是本领域技术人员将清楚这样的实施方式仅以示例的方式提供。本领域技术人员可以想到众多变体、变化和替代，而不背离本发明。应当理解的是，可以采用本文中描述的对本发明的实施方式的各种替换方式。
本公开内容的实例感测方法基于经由施加的电场将带电分析物递送至电荷传感器，施加的电场还抑制通过薄隔膜(大约100nm)的孔的约束的几何结构中的电荷屏蔽(electricalcharge-shielding)。因为跨越装置的静电势降受孔支配，所以在它内部可以容易产生高电场(大约106～107V/m)。得到的通过孔的离子电流可以破坏感测区域中分子的静电屏蔽，使得远离数百纳米检测它们的电荷是可能的。由于在平衡条件下德拜休克尔屏蔽模型预测电荷感测仅可能在距离目标分析物几个德拜长度的距离内(在生理条件下，德拜长度λD为～1nm)，所以这是令人惊讶的效果。
在离子电流流动存在于纳米约束的几何结构中的情况下，有效离子屏蔽长度可以大幅增加。通过跨越水性孔施加电偏压，由于带电分析物的存在，存在电扩散电流流动，具体地沿径向方向。该电流显著地抑制电荷屏蔽效应。该发现作为我们提出的装置的工作原理，其可以感测在大约10至大约100倍德拜长度λD的距离处的分析物(如，生物分子)的电荷。
在水性环境中经由电子电荷传感器的电荷感测的两个主要挑战包括由于分析物电荷的电双层(EDL)的屏蔽的过多的约束需求和捕获分析物用于感测的困难。本公开内容的方面涉及非平衡传输现象连同分析物的策略性固定以规避对水性环境中基于电荷的传感器的挑战。新的物理学能够将装置用于各种应用。因为电荷是核酸的固有特性，本公开内容的各个方面能够快速、无标记检测核酸，用于成本有效的分析。与放射性同位素标记的分析物感测相比，涉及基于光学的感测方法的本公开内容的方面可以大幅降低执行核酸和蛋白质研究的进入壁垒。从不使用放射源的调节简化已经提供了大量的商业分析工具(如，下一代测序、DNA微阵列、实时PCR等)。以与从放射性同位素感测至基于光学的感测的过渡的作用类似的方式，涉及电子感测方法的本公开内容的方面可以降低执行核酸和蛋白质研究的进入壁垒。
本公开内容的各个方面涉及集成的电荷传感器芯片，其可以包括源极跟随器(SF)放大器和紧靠静止在薄SixNy隔膜上的感测电极。这样的集成的电荷传感器可以是无源的(非有源传感器)。在一些情况中，传感器是有源传感器(如，具有集成的信号放大器)。
一个方面涉及用于检测带电分析物的传感器。术语“分析物”包括但不限于核酸，如本领域技术人员所理解的。传感器包括具有由隔膜分开的电相反部分(如，顶部分和底部分)的流体室。隔膜包括适合于电解质通过的孔，诸如从流体室的顶部分至底部分。传感器进一步包括第一电路，其配置为施加能够使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔的电场。传感器进一步包括第二电路，其配置为当至少一种带电分析物被牵拉进入孔时测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。在众多实施方式中，至少一种带电分析物被束缚在孔附近，同时牵拉至少一种带电分析物进入孔。
第二电路可以包括用于测量信号的感测电极，其中感测电极以远离至少一种带电分析物的距离定位。距离可以是与至少一种带电分析物相关的德拜长度的至少2倍。使用德拜休克尔方程式：计算德拜长度，其中AD＝德拜长度，ε＝电常数，k＝玻耳兹曼常数，T＝温度，以及C0＝离子浓度。在一些实施方式中，孔具有至少大约10纳米(nm)的直径。电场可以具有至少大约105伏每米(V/m)的强度。至少一种带电分析物可以具有围绕其的电双层(EDL)并且电场可以能够去屏蔽(de-screening)EDL。进一步，隔膜和孔的壁可以具有围绕它们的EDL并且电场可以能够去屏蔽EDL。电场可以能够产生非平衡传输条件。隔膜可以是电绝缘的。进一步，隔膜可以包括石墨烯、氧化铝(Al2O3)、二氧化硅(SiO2)或氮化硅(Si3N4)。第一电路可以包括在流体室的顶部分中的第一电极和在流体室的底部分中的第二电极。第二电路可以包括在孔附近嵌入隔膜的电极。第二电路可以包括能够放大信号的放大器。放大器可以在距离孔大约5000μm内。信号可以与至少一种带电分析物的电荷成线性比例。至少一种带电分析物可以是核酸分子。进一步，至少一种带电分析物可以具有至少大约40e-的净电荷。然而，至少一种带电分析物可以具有低于或高于大约40e-的净电荷。电解质可以具有大约100μM至大约1M的离子强度。进一步，传感器可以包括多个带电分析物，其被束缚在孔附近。进一步，传感器可以具有多个孔，多个带电分析物被牵拉进入其中。进一步，多个带电分析物可以是纯系的。在另一方面，公开了一种装置，其中装置具有本文中详细说明的多个传感器。
另一相关方面涉及用于检测带电分析物的工具盒。工具盒包括至少一种带电分析物，和传感器。传感器包括具有由隔膜分开的顶部分和底部分的流体室，隔膜包括适合于电解质从流体室的顶部分通过至底部分的孔。传感器还包括第一电路，其配置为施加能够使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔的电场(如，当至少一种带电分析物被束缚在孔附近时)。传感器还包括第二电路，其配置为在至少一种带电分析物被牵拉进入孔后测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。隔膜可以是电绝缘的。进一步，隔膜可以由石墨烯、氧化铝(Al2O3)、二氧化硅(SiO2)或氮化硅(Si3N4)组成。第一电路可以包括在流体室的顶部分中的第一电极和在流体室的底部分中的第二电极。第二电路可以包括在孔附近嵌入隔膜的电极。第二电路可以包括能够放大信号的放大器。放大器可以在距离孔大约5000μm内。信号可以与至少一种带电分析物的电荷成线性比例。至少一种带电分析物可以是核酸分子。进一步，至少一种带电分析物可以具有至少大约40e-的净电荷。然而，至少一种带电分析物可以具有低于或高于大约40e-的净电荷。电解质可以具有大约100μM至大约1M的离子强度。进一步，传感器可以包括多个带电分析物，其被束缚在孔附近。进一步，传感器可以具有多个孔，多个带电分析物被牵拉进入其中。进一步，多个带电分析物可以是纯系的。
另一相关方面涉及用于检测带电分析物的方法。方法包括提供具有由隔膜分开的顶部分和底部分的流体室，顶部分包括电解质，隔膜包括适合于电解质从流体室的顶部分通过至底部分的孔。方法进一步包括在孔附近束缚至少一种带电分析物；施加电场以使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔；和在至少一种带电分析物被牵拉进入孔后测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。方法可以包括牵拉至少一种带电分析物至孔的周围附近的位置。在该方法中，第一电路可以施加电场。第二电路可以测量信号。
孔可以具有任意适合的厚度，包括以下厚度(如，隔膜和感测电极的厚度)：大约10纳米(nm)、大约20nm、大约40nm、大约60nm、大约80nm、大约100nm、大约125nm、大约150nm、大约200nm、大约250nm、大约300nm、大约350nm、大约400nm、大约500nm、大约600nm、大约800nm、大约1微米(μm)、大约2μm、大约4μm、大约6μm、大约8μm、大约10μm、大约20μm、大约40μm、大约60μm、大约80μm、大约100μm、大约200μm、大约400μm、大约600μm、大约800μm、大约1000μm或更大。在一些实施方式中，孔具有以下厚度(其也可以被称为深度)：至少大约10纳米(nm)、至少大约20nm、至少大约40nm、至少大约60nm、至少大约80nm、至少大约100nm、至少大约125nm、至少大约150nm、至少大约200nm、至少大约250nm、至少大约300nm、至少大约350nm、至少大约400nm、至少大约500nm、至少大约600nm、至少大约800nm、至少大约1微米(μm)、至少大约2μm、至少大约4μm、至少大约6μm、至少大约8μm、至少大约10μm、至少大约20μm、至少大约40μm、至少大约60μm、至少大约80μm、至少大约100μm、至少大约200μm、至少大约400μm、至少大约600μm、至少大约800μm或至少大约1000μm。在一些实施方式中，孔具有以下厚度：至多大约10纳米(nm)、至多大约20nm、至多大约40nm、至多大约60nm、至多大约80nm、至多大约100nm、至多大约125nm、至多大约150nm、至多大约200nm、至多大约250nm、至多大约300nm、至多大约350nm、至多大约400nm、至多大约500nm、至多大约600nm、至多大约800nm、至多大约1微米(μm)、至多大约2μm、至多大约4μm、至多大约6μm、至多大约8μm、至多大约10μm、至多大约20μm、至多大约40μm、至多大约60μm、至多大约80μm、至多大约100μm、至多大约200μm、至多大约400μm、至多大约600μm、至多大约800μm或至多大约1000μm。
如上面所讨论，孔可以具有任意适合于使带电分析物穿过并作用于带电分析物的直径，例如，较大/较小的孔适合于较大/较小的带电分析物(类似地，10nm孔直径可以适合用于带电的DNA/RNA分析物，25nm孔直径用于带电的肽分析物，50nm用于带电的蛋白质/病毒分析物，1μm用于带电的细菌分析物，10μm用于带电的血液细胞分析物，等等)。
本公开内容的各个方面涉及集成的、可制造的、固态电荷传感器，例如，测序和DNA微阵列应用。比如，本公开内容的方面涉及设备、方法和系统，其包括容纳带电分析物例如生物分子的具有顶部分和底部分的流体室。进一步，设备、方法和系统可以包括分开流体室的顶部分和底部分的隔膜。隔膜包括开孔，以提供流体室的顶部分和底部分之间的途径。额外地，设备、方法和系统可以包括第一电路，其施加电场以束缚生物分子簇。进一步，设备、方法和系统可以包括传感器和集成电路，其在束缚生物分子簇的同时确定生物分子的电荷。
在某些实施方式中，带电分析物为DNA分子和RNA分子中的一种或多种。额外地，在某些实施方式中，带电分析物为无机毒素(如，镉、氟化物、汞、铅、砷、有毒元素盐)、药物、肽、蛋白质、其他毒素——包括有机毒素、真菌孢子、细菌、病毒、重金属、和其他类似带电分析物中的一种或多种。本公开内容的其他实施方式进一步特征在于具有隔膜的外部分，其包括多个衔接头(adapter)，该衔接头提供将单独或与其他方法结合使用的固定，其他方法诸如通过传感器和集成电路感测的电荷分析物的固相扩增。额外地，在某些实施方式中，隔膜的外部分包括多个衔接头，其提供固相扩增以制造纯系DNA簇。进一步，聚合酶链反应(PCR)引物可以被附接至DNA的尾部。
本公开内容的某些实施方式包括隔膜和开孔的壁，其形成电双层(EDL)。在这样的实施方式中，第一电路产生非平衡传输条件，用于EDL的去屏蔽。在其他实施方式中，响应电场，第一电路将锚定的带电分析物例如DNA分子枢轴转动进入孔。额外地，传感器和集成电路可以确定带电分析物的电荷以感测带电分析物的碱基掺入。进一步，第一电路可以还包括流体室内的阴极和阳极，以施加电场。阳极和阴极中的一个在流体室的顶部分中，并且阳极和阴极中的另一个在流体室的底部分中。在其他实施方式中，第一电路固定带电分析物的簇，使得带电分析物与孔的壁分开，并且传感器和集成电路被配置和布置以确定带电分析物的电荷。额外地，某些实施方式可以包括生物感测装置的阵列。本公开内容的方面可以代替目前利用光学、利用化学或利用放射性完成的任何感测。额外地，应用包括但不限于DNA、RNA或蛋白质测序、DNA微阵列、肽微阵列和免疫测定。
本公开内容的传感器的实例应用包括核酸测序和核酸微阵列。
测序技术中许多是基于合成测序(SBS)。方法中大部分是基于聚合酶克隆测序(polony sequencing)。SBS反应呈现如下：
其中DNA(n)为具有n个碱基的DNA分子，dNTP为脱氧核苷酸三磷酸和PPi为焦磷酸。因此，对于SBS，存在三个可以由多种传感器检测的项目。碱基自身的添加，在合成期间释放的质子，和在合成期间释放的焦磷酸。聚合酶克隆可以包括100或更多个待测序的DNA分子的相同拷贝。由并行在聚合酶克隆中合成的相同的个体DNA分子放出的倍增的信号可以增强呼叫(calling)(阅读)碱基的完整性。
基于固相PCR扩增(桥式扩增)，测序平台可以使用光学以检测荧光修饰的碱基的添加(DNA(n)至DNA(n+1)的增加)。虽然修饰对于非自然发荧光的DNA是必须的，但是这样的修饰可以破坏聚合酶的自然功能并导致增加的错误掺入，其在统计学上出现在聚合酶克隆的部分中。一旦这样的错误掺入出现，分子不再产生正确的信号并造成该整个聚合酶克隆的阅读错误。当聚合酶克隆中足够数目的DNA分子已经被毁坏(即，“中断期(off phase)”)，聚合酶克隆损失准确呼叫碱基的能力。这可以将阅读长度限制在大约100至大约300个碱基之间。进一步，光源是庞大的和获取测序结果的图像的照相机可以是慢的且生成大数据文件。最近光学检测的发展已经受到性能上增量提高的限制，意味着其成熟的发展状况。
焦测序(pyrosequencing)检测焦磷酸——合成反应的副产物(参见：本文中方程式1)——的释放。其为基于光学的技术，其中在微流体约束的反应室中完成一系列反应以经由生物发光观察焦磷酸的存在。挑战可以来源于标度从反应井至传感器的信号转导的困难，其中光纤电缆束可以用于信号转导。然而，焦测序合成反应不需要改性的试剂。结果是对相误差有适应力，阅读长度为1000个或更多个碱基，其是大于已经超越普及的焦测序的技术的数量级。
固态pH传感器也已经被用于检测碱基掺入后由聚合物克隆释放的质子，H+离子。因为传感器是基于固态装置测序技术，其大幅快于光学传感器的测序技术。然而，由于其感测的是pH，每个试剂的pH必须仔细校准并且反应室不能是强缓冲的。这可导致脆弱的初始化过程，其耗时且易于失败。当质子扩散开时，传感器中和周围的局部pH变化也可以是短暂的，并且合成结果通常不能多次获取，导致其后必须采集数据的固定窗口。进一步，由于基于pH的传感器检测DNA合成中特定分子生物事件的副产物，可以实现SBS。
通过限定，pH传感器对pH的对数性质操作。用于pH检测的固态传感器可以基于离子敏感场效应晶体管(ISFET)技术。ISFET具有响应pH变化的线性输出(大约50mV/pH)。pH对数依赖于核苷酸的合成。装置尺寸的微型化是频繁使用的成本降低和半导体微制造性能增加的方法。基于pH的测序方法具有非常明显的劣势，在于其确定随机出现在DNA序列中的均聚物长度的差的准确度。为了确保各种长度的均聚物是可区别的，在传感器中，pH测序方法可以需要大量的纯系DNA分子，其妨碍微型化它们的能力。因此，使用常规的微型化方法以获得基于pH的测序上的性能增加和成本效益是困难的。
可以采用长距离相互作用(如，大于大约100nm)用于感测和致动包括核酸的带电生物分子。根据本公开内容，各种传感器检测磷酸主链中的电荷。在一些实施方式中，电固态传感器能够实现核酸测序和/或微阵列的快速阅读操作。对于核酸测序，不同于感测pH，感测磷酸主链中的电荷可以导致对掺入的碱基数目的线性响应，因此不受在确定均聚物序列中准确度减低的影响。信号也可以永久地固定并可以多次获取以减少误差(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次)。
由于在它们的磷酸主链中核酸具有一电子(1e-)净电荷，所以核酸分子上的净电荷与其中的碱基的数目成正比例。因此，监测核酸分子上电荷的量的能力可以能够实现监测分子中碱基的数目。关于DNA或RNA分子中碱基数目的知晓又能够实现测序的合成事件或微阵列的杂交事件的检测。
阅读核酸分子自身中固有的磷酸主链中的电荷可以极大地简化测序化学。因此，与本公开内容的各个方面一致，电荷传感器可以不需要改性的试剂(如，核苷酸、聚合酶)或额外的用于检测的试剂(如，ATP硫酸化酶、荧光素酶)。因此，本文中描述的电荷传感器可以提供目前感测方法的简单代替，同时保持各种优势。额外地，基于本文中描述的传感器的测序平台可以具有焦测序的长阅读长度、固态测序的速度和通常与光学感测相关的稳健性。因此，通过使用能够直接检测DNA分子的固有电荷的变化的可制造固态传感器，可以规避困扰当前和新兴的下一代测序平台的许多问题。固态集成电荷传感器可以不依赖pH起作用，可以快速阅读碱基掺入，具有高效的数据存储，以及还具有不太昂贵的标度成本和较好的均聚物分辨率。
众多实施方式涉及一种方法。该方法包括提供具有由隔膜分开的顶部分和底部分的流体室，顶部分包括电解质，隔膜包括适合于电解质从流体室的顶部分通过至底部分的孔；在孔附近束缚至少一个核酸分子；邻近至少一个核酸分子的第一位置使核酸引物杂交至至少一个核酸分子；施加电场以使电解质穿过孔并牵拉至少一个核酸分子进入孔；测量指示至少一个核酸分子和核酸引物的电荷的信号；和用与至少一个核酸分子的下个位置互补的核苷酸延伸核酸引物，由此增加核酸引物的电荷大小。可以重复前面涉及施加、测量和延伸的步骤，来测序核酸分子。第一电路可以施加上面提到的电场。第二电路可以测量上面提到的信号。
在其他相关实施方式中，方法包括检测核酸分子。方法包括提供具有由隔膜分开的顶部分和底部分的流体室，顶部分包括电解质，隔膜包括适合于电解质从流体室的顶部分通过至底部分的孔；在孔附近束缚至少一种带电分析物；施加电场以使电解质穿过孔并牵拉至少一种带电分析物进入孔；和在至少一种带电分析物被牵拉进入孔时测量指示至少一种带电分析物的电荷的信号。第一电路可以施加上面提到的电场。第二电路可以测量上面提到的信号。
现在转向附图，图1A显示了与本公开内容的各个方面一致的剖视图中传感器的实例示意。传感器可以被用于检测核酸0105。传感器包括嵌入设置在衬底0102上的孔0104中的电极0101，其可以由光刻法制作。在一些情况中，孔具有大约100和大约300nm之间的直径。来自电极的信号可以通过紧靠传感器集成的薄膜单位增益源极跟随器(SF)放大器阅读(未示出，例如参见图7、图11和图13)。待检测的核酸分子可以被固定在传感器上，使得通过在偏压电极0103上施加合适的偏压，可以将带负电的核酸拉入孔用于感测0106。偏压电极可以是Ag/AgCl、Pt或Au电极。在一些情况中，隔膜0100(如，大约100至大约400nm厚)提供电约束以产生电双层(EDL)的去屏蔽所需的非平衡传输条件。图1B显示了本公开内容的传感器的额外的附图。孔0107具有连接至放大器0109的嵌入电极0108。待检测的核酸分子0110可以被固定在传感器上，使得通过在偏压电极0111上施加合适的偏压，可以将带负电的核酸拉入孔用于感测0112。
本公开内容的传感器可以被用于检测任意分析物，诸如核酸、蛋白质、糖类、代谢物、细胞、有机或无机分子、药物和/或候选药物(drug candidate)。分析物自身不需要具有电荷。例如，图2显示了使用传感器用于夹心免疫测定的实例。探针抗体(probe antibody)0200可以靠近孔0205入口被固定在隔膜0204的表面上。分析物(靶抗原)0201可以结合至探针抗体，其也被结合至第二抗体0202。第二抗体202可以包括与带电标记缀合的抗体，当通过偏压电极0206施加跨隔膜偏压时该带电标记可以被牵拉入孔0203用于感测。在一些情况中，带电标记为核酸分子。
在另一实施方式中，图3显示了用于分析物-抗体相互作用的分析的芯片结构。分析物分子0300(如，蛋白质)靠近孔0304被附接至隔膜0303。具有缀合的带电标记0301的抗体可以结合至分析物并且当通过偏压电极0305施加偏压时被牵拉进入孔0302用于检测。
传感器可以被封装并与电子和/或流体连接(如，用于装置内操作)集成。图4显示了封装的芯片的横截面示意图的实例。封装的芯片具有底部流体池0400、顶部流体池0401和中部流体池0402。顶部外电极0403和底部外电极0404可以被附接至外电极导线(分别地0405和0406)。传感器芯片0407可以由传感器芯片输入/输出0408电寻址。
传感器可以为有源传感器(即，具有集成信号放大器)或无源传感器(即，不具有集成信号放大器)。在一些情况中，无源传感器集成有外部信号放大器(即，没有在结构上嵌入孔传感器自身的放大器)。在一些例子中，有源传感器消耗电力并且需要电源。当作为无源或有源传感器操作时，本公开内容的传感器可以设计为具有任意适合高的信噪比(SNR)。在一些实施方式中，SNR可以在1-100的范围内(如，为大约1.1、大约1.2、大约1.5、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约15、大约20、大约25、大约30、大约40、大约50、大约100；至少大约1.1、至少大约1.2、至少大约1.5、至少大约2、至少大约3、至少大约4、至少大约5、至少大约6、至少大约7、至少大约8、至少大约9、至少大约10、至少大约15、至少大约20、至少大约25、至少大约30、至少大约40、至少大约50、或至少大约100)。
图5A显示了用于增强传感器的SNR的一个策略。传感器可以具有无源的嵌入感测电极0500、孔0501和在孔附近固定的带电分析物0502。在一些情况中，存在多个纯系的带电分析物，但是这不是必须的。在一些实施中，可以利用单个孔感测一组不同的带电分析物，然而，不具有区分带电分析物的能力。在一些情况中，对于带电分析物的每个集落，在传感器中仅存在一个孔。然而，本公开内容的传感器可每个带电分析物集落具有多个孔0503。与单个孔相比，多个孔可以通过增加信号和/或降低噪音来增强SNR。在一些实施方式中，每单独的带电分析物存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、50、100、500或1000个孔。在一些实施方式中，每单独的带电分析物存在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少30、至少50、至少100、至少500或至少1000个孔。在一些情况中，传感器采用多个孔/分析物重复，其在传感器上不一定布置在彼此附近。然而，多个孔也可以布置在单独的带电分析物的集落附近和/或共享共同的感测电极0500。通过共同的感测电极使多个孔被寻址可以简化传感器的设计和/或促进传感器阵列的微型化。图5B显示了具有多个孔0504的本公开内容的传感器的实施方式。传感器具有包括二氧化硅(SiO2)的顶部绝缘体0505、包括氮化硅(Si3N4)的底部绝缘体0506和设置在硅(Si)衬底0508上的铂(Pt)电极0507。在一些实施方式中，电极具有大约75纳米(nm)的厚度(如，70nm Pt和5nm钛(Ti))，隔膜具有80nm氮化硅(Si3N4)和70nm SiO2的厚度。多个孔可以通过光刻法限定。多个孔可以被用于增强递送至传感器的净电荷(如，在专用集成放大器不存在的情况中)。
在一些实施方式中，传感器具有暴露的电极。如图6中所示，暴露的电极0600可以起到感测电极和衬底两者的功能，带电分析物0601可以被固定至其上。
图7A显示了两个有源传感器的剖视图。该设计包括用于有源传感器的嵌入感测电极0700，包括专用放大器的有源晶体管0701，和用于有源装置的互连0702。在另一实施方式中，嵌入感测电极0703可以与薄膜晶体管(TFT)有源放大器0704配接并且具有用于有源装置的互连0705。此处显示的两个实施方式能够检测带电分析物0706。
图7B显示了本公开内容的有源传感器的额外的细节，其具有封闭的顶部和底部流体沟道以及它们各自的集成入装置的电极。感测电极被夹在隔膜中，集成的放大器在附近。这样的结构可以降低由感测电极产生的噪音。输入/输出(I/O)电路的其余部分可以置于硅晶片上。传感器可以具有集成的顶部电极0707、顶部流体腔0708、如图7A中所描述的集成的感测放大器0709、底部流体腔0710、底部电极0711和衬底上的外围电路0712。在一些情况中，衬底是硅。如本文中一般所用，任何提及“顶部”或“底部”仅是说明性的，这是由于传感器可以关于重力以任何方式取向。
图7C-7E显示了本公开内容的有源传感器的额外的实施方式。图7C具有远离硅衬底中的感测电极的放大器，其可以降低由放大器产生的噪音。该实施方式包括顶部流体沟道0713、分析物0714、感测电极0715、孔感测区域0716、底部流体沟道0717、光电管放大器(cell amplifier)0718、顶部流体电极0719、底部流体电极0720、I/O电路0721、绝缘体0722和硅0723。
图7D具有开放的顶部流体沟道和封闭的底部流体沟道，其可以取消执行复杂结合过程的需要。所有的有源零件在主硅衬底上，其可以允许稳健操作，但需要较大的芯片面积来实施。该实施方式可以包括绝缘体0724、I/O电路0725、顶部流体沟道0726、光电管放大器0727、分析物0728、感测电极0729、孔感测区域0730、底部流体沟道0731、底部流体电极0732和硅衬底0733。
图7E显示了开放的顶部和底部流体沟道，其可以能够实现外部沟道电极的使用。所有的有源零件在主硅衬底上，其可以允许稳健操作，但需要较大的芯片面积来实施。该实施方式可以包括绝缘体0734、I/O电路0735、顶部流体沟道0736、光电管放大器0737、分析物0738、感测电极0739、孔感测区域0740、底部流体沟道0741和硅衬底0742。
传感器可以被用于执行本领域内通常已知的许多分析或测量。在一些情况中，与现有技术相比，本公开内容的传感器能够实现改进的方法或其性能。例如，本文中描述的是杂交测定(即，微阵列)，其可以被用于检测单核苷酸多态性(SNP)。如图8中所示，传感器具有电荷感测孔0800，集成电荷感测电极0801在固定的杂交探针0802附近。在一些情况中，杂交探针是核酸分子，其与分析物0803杂交。分析物可以是具有与杂交探针互补的序列的第二核酸分子。根据本文中描述的方法，施加跨越孔的偏压可以将杂交探针和分析物(探针-分析物缀合物)牵拉进入孔用于检测0804。在一些情况中，本公开内容的装置包括传感器的阵列，每个具有孔，每个孔具有在孔附近附接的单独的杂交探针。因此，每个孔-传感器对可以检测不同的分析物。然而，在一些情况中，靠近任意给定的孔固定的杂交探针不必是相同的(即，纯系的)。给定的孔可以具有与其相关联的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同类型的杂交探针。在一些情况中，不同的杂交探针中每个具有结合至其的不同的分析物，同时每种分析物具有不同的电荷。以该方式，给定的孔可以检测和/或区分2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的分析物。
本文中描述的传感器可以被用于确定分析物(如，核酸分子)的序列。图9A和图9B描绘了可以用于执行合成测序(SBS)的操作，其中图9B的操作以迭代的方式遵循图9A的操作进行。如所示，方法使用电荷感测孔0900和电荷感测电极0901。待测序的核酸0902被固定在孔附近，例如固定至涂布在适于固相扩增的孔的圆周上的衔接头，如图10中所示。核酸可以是核酸的文库之一，每一个附接至单独的传感器附近的单独的衔接头。可以使用固相聚合酶链反应(PCR)来扩增核酸分子以形成纯系核酸分子的集落，也附接至孔附近的传感器，例如，如国际专利申请号PCT/AU1992/000587中所描述，其公开内容通过具体引用并入本文，用于该相关公开内容。寡核苷酸引物0903可以与待测序的核酸杂交，然后清洗掉未杂交的引物。施加电场可以将核酸-引物复合体拉入孔0904，用于参比电荷的测量(即，在测序之前)。参比电荷可以被存储。该高电场既可以牵拉固定的核酸进入传感器又可以帮助去屏蔽EDL。
继续图9B，可以通过在随后的碱基位置0906处掺入与待测序的核酸分子互补的核苷酸0905延伸引物0903来执行SBS(即，鸟嘌呤(G)用胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)用胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))。过量的或未掺入的核苷酸可以被清洗掉和/或降解(如，利用腺苷三磷酸双磷酸酶)。核苷酸的掺入在核酸-引物复合体上增加了一电子负电荷(相对于参比电荷和/或在先前迭代处测量的电荷)，其可以通过施加适于牵拉核酸-引物复合体进入孔的跨越孔的电压被感测0907。感测的电荷可以与参比和/或先前的电荷(其任选地存储在传感器中)比较以产生碱基判定(base call)。本文中描绘的SBS过程可以通过连续地以任意顺序利用四种碱基A、G、C、T(或在RNA的情况中U)迭代地攻击系统来继续。利用不与随后的碱基位置互补的碱基攻击系统的情况将不导致电荷的变化。在一些情况中，电荷的变化归因于生长引物链的磷酸主链的增加的长度，其中每个碱基位置一个负电荷。本领域技术人员将理解，可以在适合的缓冲剂存在的情况下，利用聚合酶执行核苷酸的掺入，适合的缓冲剂包括镁和/或锰离子。
图9C显示了使用本公开内容的传感器进行SBS的方法的另一描绘，并且类似于关于图9A和图9B描述的步骤。如所示，方法使用电荷感测孔0908。待测序的核酸0909被固定在孔附近，例如固定至涂布0910在适于固相扩增的孔的圆周上的衔接头。核酸可以是核酸的文库之一，每一个附接至单独的传感器附近的单独的衔接头。可以使用固相聚合酶链反应(PCR)来扩增核酸分子以形成纯系核酸分子的集落0911。寡核苷酸引物0912可以与待测序的核酸杂交，然后清洗掉未杂交的引物。施加电场可以将核酸-引物复合体拉入孔0913，用于测量参比电荷(即，在测序之前)。可以通过在随后的碱基位置处掺入与待测序的核酸分子互补的核苷酸0914延伸引物(即，鸟嘌呤(G)用胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)用胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))来执行SBS。过量的或未掺入的核苷酸可以被清洗掉和/或降解(如，利用腺苷三磷酸双磷酸酶)。核苷酸的掺入在核酸-引物复合体上增加了一电子负电荷(相对于参比电荷和/或在先前迭代处测量的电荷)，其可以通过施加适于牵拉核酸-引物复合体进入孔的跨越孔的电压被感测0915。
可以向传感器提供密集居群固定的DNA以及可以执行固相PCR扩增或桥式扩增。可以利用(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷(APTMS)的分子气相沉积来执行芯片表面的气相硅烷化。使用交联剂N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)，可以将作为PCR引物的硫醇修饰的寡核苷酸附接至芯片表面。存在可以使用的多种其他交联剂。
图10显示了共价附接核酸至电荷传感器表面的方法的实例，与本公开内容的各个方面一致。包括羟基基团1001(和/或羟基化的)的SiO2表面1000可以被硅烷化(如，使用氨基硅烷1002)。硅烷化可以在气相中执行。交联剂(如，PMPI 1003)可以被用于连接硅烷上的氨基和5'硫醇-修饰的引物1004上的巯基。得到的本文中描述的表面化学的产物显示在1005。
实践中，感测芯片被等离子清洁、再水化和使用化学气相沉积系统利用(3-氨基丙基)-三甲氧基硅烷(APTMS)官能化。通过在氩气气氛下，在40℃下，在无水甲苯中暴露至2.3mM的N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)溶液2小时，氨基官能化的表面随后被转化为硫醇-反应性基团。随后利用无水甲苯清洗表面并在氩气流中干燥，随后使用硫醇化的寡核苷酸进行DNA固定。在固定之前，使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)作为还原剂还原硫醇化的寡核苷酸并使用自旋柱(MWCO＝3000)脱盐。可以在控制的气氛下，在1M的NaCl缓冲溶液中，以10μM的浓度直接将硫醇化的寡核苷酸点样至感测芯片上持续6小时，随后大量的清洗。各种表面修饰步骤之后进行X射线光电子能谱法，并且预期成分的存在和峰位移确认感测表面的转化。桥式PCR扩增自身通过在标准PCR管中连同合适的试剂和先前制备的900个碱基对(bp)模板热循环传感器芯片来进行。附着化学的结果是共价键牢固地将900bp DNA分子固定至芯片表面的链。选择900bp模板的长度，是由于其长度紧密匹配制造的孔长度。固相扩增的DNA分子通过限制酶被线性化。通过荧光显微镜利用合适激发的SYBR Gold核酸染料来验证来自固相扩增的固定的核酸的密集存在。图10显示了具有和不具有固定的DNA分子的电荷传感器芯片的显微镜图像。
为了验证荧光响应的结果是来自成功的桥式扩增而非来自非特异性结合，进行了若干对照实验。在每个实验中，在通常将导致PCR扩增的热循环之前，省略表面化学中的成分(氨基硅烷、交联剂和硫醇化的寡核苷酸)。图10显示了结果。任意成分的缺乏导致低水平的荧光，其表示仅当三个表面化学成分中所有都在适当位置时固相PCR扩增才是成功的，如1008中所示。在沉积氨基硅烷和培育硫醇化的寡核苷酸引物而不存交联剂的情况中，稍稍提高的荧光亮度推测为低水平的带负电的寡核苷酸至硅烷的带正电的氨基的非特异性粘合。
图10显示了传感器表面上固相PCR扩增的DNA的光学显微镜研究的实例，与本公开内容的各个方面一致。显示了具有大约900个碱基的固相PCR扩增的DNA的传感器的亮场显微镜图像1006(浅灰色区域为SiNx/SiO2隔膜)。暗的多孔区域为具有孔阵列的Pt感测电极。1μm的孔通过光刻法限定。还显示了在1006中所示的位置处芯片的荧光显微镜图像1007。SYBR Gold染色的DNA荧光表示大量的DNA分子和成功的固相PCR扩增。在1008显示了一系列对照实验，其中已经省略了表面化学中的成分以增强具有各种缺少表面化学的芯片的荧光亮度。
随着核酸被固定，与本公开内容的各个方面一致，可以以下面的方式操作无源或有源传感器芯片：i)可以向阴极施加正电势，ii)施加电势可以靠近孔以将固定的分析物(如，核酸)分子拉入孔的方式产生电场和iii)在外电场下孔中分析物分子的存在留下电信号至(如，铂)感测电极，其电势可以被记录用于分析。随着分析物共价地固定至顶表面，可以通过观察阴性对照实验、具有每分子附着有900个电子(e-)的单链(SS)DNA的芯片、和具有每分子附着有1800e-电荷的双链(DS)DNA的芯片之间的信号差异，测试传感器区分电荷的能力，在阴性对照实验中不对传感器芯片进行表面化学。
图11显示了电荷传感器的说明的实例，与本公开内容的各个方面一致。电荷传感器设置的示意图包括连接至顶部电极1101的电流放大器1100、芯片外的单位增益电压放大器1102、感测电极1103(75nm的铂电极)、绝缘隔膜1104、底部电极1105和在SiO2表面上的固定的(线性化的)核酸分子1106。当向阴极施加正电势时，核酸分子被牵拉进入孔，改变感测电极1103的电势。可以在低浓度盐(如，100μM的KCl)中进行测量以增强电检测。如图11的底部大部分所示，在以毫伏(mV)为单位增加和显示施加的阴极电势1108时，可以以伏特为单位测量和监测传感器电势1107(1102的输出)。每一条曲线代表利用不同传感器芯片的测量(即，实线、短虚线和长虚线)。最上边一组线1109代表没有附着核酸的阴性对照。中间一组线1110代表已经使900个碱基的SS DNA附着至它们的那些芯片。最下边一组线1111代表已经使900个碱基对的DS DNA附着的那些芯片。虽然观察到一些芯片至芯片变体，但是总的来说，传感器能够区分三种情况之间净电荷差异。利用大约900个碱基之间观察到的100mV差异，我们看见110μV/碱基。
图12A显示了图11中描述的装置的电子显微镜图像。焊垫(Bond pad)1200显示有2x冗余。微孔传感器孔区域1201可以由信号线1202附接。传感器区域可以由单一铂电极提供。显微照片还显示了硅衬底1203和SiO2/SiNx隔膜1204。图12B显示了本公开内容的传感器的孔的电子显微照片的两个实例，包括俯视图1205(SiO2侧)和仰视图1206(Si3N4侧)。比例尺为1μm和测量的孔直径为大约1.15μm。
图13显示了电荷传感器的实例和操作电荷传感器的结果。传感器具有如图6中所描述的暴露的金感测电极1300。传感器进一步包括SiNx隔膜1301、固定在一个硫醇化的5'末端处的450bp的DS DNA 1302、顶部电极1303、底部电极1304、孔(直径为2μm)1305和提供传感器信号输出1307的单位增益放大器1306。在纵轴上以伏特(V)为单位绘制传感器电势1308(在1307处)作为以毫伏(mV)为单位施加的偏压1309(在1304处施加)的函数。向底部电极1304施加负偏压导致核酸分子被牵拉出孔1310，并且与没有核酸分子的对照(较大的正方形标记)相比，当核酸被附着至传感器时，在传感器电势中没有测量到有意义的差异(较小的菱形标记)，如曲线的最左侧部分1311中所显示。向底部电极1304施加正偏压导致分子被牵拉进入孔1312。在低正偏压下没有观察到差异，如曲线的中间部分1313所示。然而，在高正偏压下，传感器电势相对于对照显著地降低，如曲线的最右侧部分1314所示。在高正偏压下，没有DNA被附着至芯片的对照情况1315显示了反映施加负偏压的结果的传感器输出，导致对称的操作。在高正偏压下，DNA分子被附着至芯片的情形1316导致成功的核酸电荷检测。
为了说明工作原理，模拟圆柱对称模型系统，其中60bp的双链(DS)DNA的片段放置在水性纳米孔的中心(最具挑战性的检测方案)，如图14A中示意性所示。系统包括阴极1409、金属电极1410、固体电介质1411、虚拟接地1412、阳极1413和带电分子1414。使用广义偏微分方程求解公式Prophet解泊松-能斯特-普朗克(PNP)方程连同斯托克斯方程以穿越孔的离子和流体传输建模，以解非线性、共轭模型方程。PNP方程为：
其中εw为溶液的介电常数，q为基本电荷，D±和μ±分别为阳离子和阴离子的扩散系数和迁移率。通过斯托克斯-发散方程建模流体传输。
其中p为溶剂压力和γ为溶剂粘度。在下面提出的表1显示了重要的模拟参数的值。
表1：模拟参数和值
参数 值
溶液介电常数(εW) 80ε0
绝缘体介电常数(εi) 8ε0
阳离子/阴离子迁移率(μ±) 7.62×10-8m2/Vs
阳离子/阴离子扩散系数(D±) 2×10-9m2/s
体相离子浓度(C0) 10mM
溶剂粘度(γ) 0.001Ns/m2
DNA迁移率(μ) 3.5×10-8m2/Vs
DNA扩散系数(D) 1.8×10-11m2/s
DNA源末端体相浓度 2.7nM
在图14B-D中展示实例模拟结果。模拟器的有效性已经由其准确模拟DNA易位行为通过致动应用的类似尺寸的栅控孔的能力显示。
图14B显示了在施加0V和7V外部电偏压下，由于带电分子的存在，模拟的静电势电荷的实例的等值曲线(contour plot)，与本公开内容的各个方面一致。在零外部电偏压1400下，观察到德拜休克尔屏蔽行为。相反，对于跨越孔施加的7V的电偏压1401，观察到显著的长距离静电相互作用(如由较亮颜色和场线所指示)。隔膜被制模为500nm厚度的固体电介质层。离子溶液为1mM的KCl。孔半径设定为300nm，在该摩尔浓度下对应于大约30德拜长度。
利用图14A的装置结构执行进一步模拟，其与本公开内容的各个方面一致。对于不同的孔半径(如图14C中所示)和偏压条件，诸如有效的栅氧化物厚度(电介质绝缘体)(如图14D中所示)，已经计算了感测效率，或感应电荷的分数β。
参考图14C，当电极和溶液之间没有氧化物时，显示了在1V 1402、2V 1403和3V1404下由生物分子感应的感测电极中电荷的分数。在图14D中显示了0V 1405、1V 1406、2V1407和3V 1408下在感测电极上电介质形成对感测效率的影响的实例曲线。示意性曲线显示了在感测电极上电介质形成对感测效率的影响。这模拟夹在两个绝缘层之间的感测金属电极。假设生物分子电荷为–Q，金属电极中的感应电荷是Q’＝βQ，其基本上是由放大器电路感测的电荷的量。该建模的一个结论可以是，利用跨越孔最适度的DC电偏压，当生物分子在孔的中心处时，对于500nm的孔，可以被感测的电荷在生物分子电荷的大约20％和大约40％之间。实践中，由于分析物(如，DNA)被固定靠近孔的周围而不是在中心的方式，电荷可以被递送更加靠近感测电极。
图15显示了本公开内容的个体传感器的电路图。传感器包括感测电极1500，其为了便于制造晶体管模拟器可以被称为“栅”。传感器还具有顶部绝缘体1501、顶部(或源)电极1504、底部绝缘体1507、底部(或漏)电极1509和沟道位置1506——在此处模拟感测发生。顶部绝缘体1501和底部绝缘体1507可以是相同的或任选地可以由不同的材料组成。电路模型包括各种零件，包括从栅至顶部电解质体(或源)的电容CGS 1502、从栅至沟道的电容CC1503、沟道-源极电阻RGS 1505、沟道-漏极电阻RGD 1508和栅-漏极电容CGD 1510。在1511和1512展示使这些元件与源极(VS)处、漏极(VD)处、沟道(VC)中和栅(VG)处电压相关联的方程式。
图16显示了实验测量的结果，对应于图15中描述的一些电路图元件，其中各个图线表示各个传感器的测量。栅和漏极之间的阻抗1600显示为频率的函数。该曲线的下降斜率1601代表CGD(在1510)，斜率的最小值1602代表RGD(在1508)，以及该曲线的上升斜率1603代表仪器的感应系数。栅和源极之间的阻抗1604也显示为频率的函数。该曲线的下降斜率1605代表CGS(在1502)，曲线的最小值1606代表RGS(在1505)，以及该曲线的上升斜率1607代表仪器的感应系数。
孔可以为任意适合的大小或形状。孔可以是圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、细长狭缝，或5、6、7、8、9、10或更多侧的多边形。本公开内容的传感器和方法可以使用“纳米孔”，但不要求孔是纳米孔，其一般被限定为具有至少大约1纳米(nm)和至多5nm或10nm的直径的孔。不被任何具体理论约束，这是因为本方法不依赖于通过感测分析物阻滞离子流通过孔，诸如美国专利6,428,959中所描述，其公开内容通过具体引用并入本文，用于该相关公开内容。因此，孔可以大于纳米孔，其能够实现更容易地可制造的和操作的装置。本公开内容的孔可以由任何适合的材料制成(即，孔可以是材料中的洞)，包括SiO2、SiN、氧化铝(Al2O3)、金或云母。在一些情况中，孔是生物孔，诸如脂质膜内的蛋白通道。
孔的侧壁可以具有任何适合的形状。在一些例子中，侧壁是直的并且与隔膜的表面成直角(如，如图1中所示)。在一些情况中，侧壁不与隔膜的表面成直角。侧壁可以是倾斜的。如图17中所示，孔可以在隔膜的顺式侧(附着分析物的隔膜的侧)上比在反式侧上更宽。在一些实施方式中，孔可以还在反式侧上比顺式侧上更宽。在一些情况中，孔是沙漏形的或倒沙漏形的。可以改变孔的形状以操纵感测区域1700的性质，例如为了优化任意具体的感测特性，诸如SNR。在一些情况中，锥形孔几何结构可以导致分析物在感测电极表面上更牢固和/或可重复的放置1701。
图18显示了与印刷电路板(PCB)配接的传感器芯片的实例。PCB 1800将传感器芯片1801容纳在插座中。在该例子中，利用丝焊制造从PCB至传感器芯片的电连接1802。可以利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)1803将芯片和丝焊流体地且电学上绝缘。
图19显示了可以集成有传感器的流体池的实例。图19的左部分描绘了流体池的分解视图以显示内部结构，同时图19的右部分显示了组装时的流体池的图片。底部流体池1900可以由聚四氟乙烯(PTFE)制造并可以形成用于底部流体储器1901的流体密封。储器可容纳电解质并具有用于底部电极的开孔以接触电解质。流体池可以设计为安装集成有PCB1902的传感器，如图18中所描述。顶部流体池1903也可以由PTFE制造并且可以形成用于顶部流体储器1904的流体密封。顶部流体储器可容纳电解质并具有用于顶部电极的开孔以接触电解质。流体池还可以具有用于去离子水的储器1905，其可以有助于使装置工作的环境潮湿。
图20显示了能够操作本公开内容的传感器的仪器。仪器可以被容纳在法拉第笼2000(如，由固体铜制造)内。显示图19中描述的传感器和流体池2001。仪器可以具有电极2002、外部放大器电路2003、用于放大器电路和施加静电势的电池组2004以及控制仪器的电缆2005。
图21A显示了集成的传感器阵列的实例。阵列可以具有任意数目的传感器，例如，本领域技术人员将认识到，传感器的具体数目不重要，无论多个传感器是最小值或达若干/数百万。在一些情况中，阵列的个体传感器中每个是个体可寻址的。个体可寻址的传感器可以个体控制(如，具有施加至阳极或阴极的偏压)和/或个体阅读(如，由感测电极导出的信号)。在一些情况中，阵列的多个传感器是作为一组可寻址的。在一些例子中，多个传感器共享共同的阳极和/或阴极，用于施加跨越传感器的电场。
返回至图21A，传感器可以以任何适合的方式寻址和/或具有任何适合的集成电路。例如，电荷传感器中每个单个池2100可以通过垂直接入电路2101寻址。阵列还可以具有静噪电路2102、模拟-数字电路2103和水平接入电路2104。显示池2100内细节，包括电源(如，VDD引线)2105、源极跟随器放大器2106、选择器(select)2107和数据2108。实例静噪电路2102可以包括参考选择器2109、参考存储器(storage)2110、比较器2111、模拟数据输出2112、阅读存储器2113和阅读选择器2114。
图21B和图21C显示了本公开内容的集成传感器阵列的传感器电路的额外的实施方式。
图22图解了去屏蔽的物理学。当系统处于平衡2201时，静电势(Ψ)显示德拜长度2202内的大幅变化，抗衡离子2200有效地屏蔽电荷(-Q，如，DNA)。根据德拜休克尔模型，盐浓度对德拜长度具有影响。例如，对于100毫摩尔(mM)氯化钾(KCl)，德拜长度为大约1纳米(nm)，对于10mM KCl，德拜长度为大约3.4nm，和对于1mM KCl，德拜长度为大约10nm。相反，处于平衡，净抗衡离子电流2203(J净)为大约零，其中抗衡离子电流的偏流分量(J偏流)2204(库伦吸力(Coulombic attraction))有效地平衡扩散分量(J扩散)2205。然而，在外场存在(非平衡条件)的情况中，抗衡离子可以流动2206。静电势处于非平衡2207，其中净抗衡离子电流是非零2208(即，正)并且抗衡离子流动。
可以使用任何技术，或技术的组合，制造本公开内容的传感器，诸如光刻法。在下面提出的表2显示了制作本公开内容的无源传感器的方法的实例。
表2-制造无源传感器的实例方法
如图解，可以实施各种模块和/或其他基于电路的构件块以执行本文中描述和/或附图中显示的操作和作业中的一个或多个。在这样的背景中，这些模块和/或构件块代表执行这些或相关操作/作业中的一个或多个的电路。例如，在一些实施方式中，一个或多个模块和/块为离散的逻辑电路或可编程的逻辑电路，其配置和布置用于执行这些操作/作业，如在本文中显示的电路模块/块中。在一些情况中，可编程电路是编程以执行一组(或多组)指令(和/或结构数据)的一个或多个计算机电路。指令(和/或结构数据)可以为储存在存储器(电路)中并从存储器(电路)可访问的固件或软件形式。作为实例，第一和第二模块/块包括基于CPU硬件的电路和一组固件形式的指令的组合，其中第一模块/块包括具有一组指令的第一CPU硬件电路，和第二模块/块包括具有另一组指令的第二CPU硬件电路。
本公开内容提供了计算机控制系统，其可以被用于调节或以其他方式控制本文中提供的传感器和方法。例如，本公开内容的控制系统可以被编程以控制工艺参数以感测分析物。
图23显示了计算机系统2301，其被编程或以其他方式配置以调节传感器的操作。例如，计算机系统2301可以调节流速、温度、压力、机械操纵、施加的电压或其他电输入和/或输出等。
计算机系统2301包括中央处理单元(CPU，本文中也为“处理器”和“计算机处理器”)2305，其可以是单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统2301还包括内存或内存位置2310(如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元2315(如，硬盘)、与一个或多个其他系统通信的通信接口2320(如，网络适配器)和外围装置2325，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储器和/或电子显示器适配器。内存2310、存储单元2315、接口2320和外围装置2325通过通信总线——诸如主板——与CPU 2305通信。存储单元2315可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。
CPU 2305可以执行一系列机器可读指令，机器可读指令可以嵌入程序或软件中。指令可以存储在存储位置，诸如内存2310。由CPU 2305执行的操作的实例可以包括读取、解码、执行和写回。
存储单元2315可以存储文件，诸如驱动程序、程序库和保存程序。存储单元2315可以存储由用户生成的程序和记录的会话，以及与程序相关的输出(一个或多个)。存储单元2315可以存储用户数据，如用户首选项和用户程序。在一些情况中，计算机系统2301可以包括一个或多个额外的数据存储单元，这些存储单元位于计算机系统2301外部，诸如位于通过内网或互联网与计算机系统2301通信的远程服务器。
计算机系统2301可以与系统2330通信，其包括具有集成的流体和/或处理元件的装置。这样的处理元件可以包括传感器、流量调节器(如，阀)和配置为引导流体的泵送系统。
如本文中所描述的方法可以经由储存在计算机系统2301的电子存储位置——诸如在内存2310或电子存储单元2315上——的机器(如，计算机处理器)可执行的代码实施。机器可执行或机器可读代码以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器2305执行。在一些情况中，代码可以从存储单元2315取回并存储在内存2310上，准备由处理器2305访问。在一些处境中，电子存储单元2315可以被排除，以及机器可执行指令被储存在内存2310上。
代码可以被预编译并配置为供具有适于执行代码的处理器的机器使用，或可以在运行期间被编译。可以以编程语言提供代码，编程语言可以选择为使代码能够以预编译或编译时(as-compiled)的形式执行。
本文中提供的系统和方法的方面，诸如计算机系统2301，可以包含在编程中。技术的各个方面可以被认为是通常以携带在一类机器可读介质上或包含在一类机器可读介质内的机器(或处理器)可执行的代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可以被存储在电子存储单元上，诸如内存(如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的有形存储器的任意一种或所有，或其相关模块，诸如各种半导体(电路)存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以提供在任意时间的非临时存储，用于软件编程。软件的所有或部分有时可以通过互联网或各种其他远程通信网络通信。例如，这样的通信可以能够从一个计算机或处理器加载软件进入另一个，例如，从管理服务器或主机进入应用服务器的计算机平台。因此，可以负载软件元件的另一类介质包括光、电和电磁波，诸如通过有线或光地上通信线(landline)网络和越过空中链路用来跨过本地装置之间的物理接口。负载这样的波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被看作负载软件的介质。如本文中所使用，除非限制在非临时、有形“存储”介质，术语诸如计算机或机器“可读介质”指参与向处理器提供指令用于执行的任何介质。
因此，机器可读介质——诸如计算机可执行代码——可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如，光盘或磁盘，诸如任意计算机(一个或多个)等中的任意存储装置，可被用于实施附图中所示的数据库等。易失性储存介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括包含计算机系统内的总线的线。载波传输介质可以采取电或电磁信号、或声或光波的形式，声或光波诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，例如，计算机可读介质的常见形式包括：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任意其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任意其他光介质、穿孔卡片纸带、任意具有孔图案的其他物理储存介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任意其他存储器芯片或卡盘、传输数据或指令的载波、传输这样的载波的电缆或链路、或任意其他介质，计算机可以从该介质阅读编程代码和/或数据。这些形式的计算机可读介质中许多可以向处理器提供一条或多条指令的一个或多个序列用于执行。
由上述应当理解，虽然已经图解并描述了具体的实施，但是可以对其进行各种修改并且本文中考虑这些修改。例如，本文中描述的实施方式可以组合或修改以又得到更多本发明的实施方式。由说明书内提供的具体实例也非旨在限制本发明。虽然已经参考前述说明书描述了本发明，本文中优选的实施方式的描述和说明不意味着以限制含义解释。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文中陈述的依赖多种条件和变量的具体的描绘、配置或相对比例。本发明的实施方式的形式和细节的各种修改对本领域技术人员将是明显的。因此，应当考虑，本发明也将覆盖任何这样的修改、变化和等效形式。所附权利要求旨在限定本发明的范围并且因而覆盖这些权利要求和其等效形式的范围内的方法和结构。

Claims (25)

1.一种用于检测带电分析物的传感器，所述传感器包括：
流体室，其具有其间有隔膜的电相反部分，所述隔膜提供适合于电解质在所述流体室的所述电相反部分之间通过的孔并具有在所述孔附近束缚的至少一种带电分析物；
第一电路，其配置为施加能够使所述电解质穿过所述孔和牵拉所述至少一种带电分析物进入所述孔的电场；和
第二电路，其配置为在至少一种带电分析物被牵拉进入所述孔后测量指示所述至少一种带电分析物的电荷的信号。
2.根据权利要求1所述的传感器，其中与牵拉所述至少一种带电分析物进入所述孔同时，所述至少一种带电分析物被束缚。
3.根据权利要求1所述的传感器，其中所述电相反部分包括由所述隔膜分开的顶部分和底部分，并且所述至少一种带电分析物通过所述至少一种带电分析物和所述流体室的所述电相反部分之间的相互作用被束缚在所述孔附近。
4.根据权利要求1所述的传感器，其中所述第二电路包括用于测量所述信号的感测电极，其中所述感测电极在远离所述至少一种带电分析物的距离处定位。
5.根据权利要求2所述的传感器，其中所述距离为与所述至少一种带电分析物相关的德拜长度的至少2倍。
6.根据权利要求2所述的传感器，其中使用德拜休克尔方程式：计算德拜长度，其中AD＝德拜长度，ε＝电常数，k＝玻耳兹曼常数，T＝温度，以及C0＝离子浓度。
7.根据权利要求1所述的传感器，其中所述孔具有大小适于所述带电分析物的直径，其中所述孔的直径和所述带电分析物的直径都在大约大于几纳米。
8.根据权利要求1所述的传感器，其中所述电场具有以百万伏特每米(V/m)为单位的强度，其足以抑制由限定所述孔的所述隔膜的部分限定的几何结构内的电荷屏蔽。
9.根据权利要求1所述的传感器，其中所述电场具有至少105伏特每米(V/m)的强度。
10.根据权利要求1所述的传感器，其中所述至少一种带电分析物具有围绕它的电双层(EDL)，并且所述电场能够去屏蔽所述EDL。
11.根据权利要求1所述的传感器，其中所述隔膜和所述孔的壁具有围绕它们的EDL，并且所述电场能够去屏蔽所述EDL。
12.根据权利要求1所述的传感器，其中所述电场能够产生非平衡传输条件。
13.根据权利要求1所述的传感器，其中所述隔膜是电绝缘的。
14.根据权利要求1所述的传感器，其中所述第一电路包括在所述流体室的所述电相反部分的一个中的第一电极，和在所述流体室的所述电相反部分的另一个中的第二电极。
15.根据权利要求1所述的传感器，其中所述第二电路包括在所述孔附近嵌入所述隔膜的电极。
16.根据权利要求1所述的传感器，其中所述信号与所述至少一种带电分析物的电荷成线性比例。
17.根据权利要求1所述的传感器，其中所述至少一种带电分析物是核酸分子。
18.根据权利要求1所述的传感器，其中所述至少一种带电分析物通过分子结构被束缚在所述孔附近。
19.根据权利要求1所述的传感器，其中所述孔的直径对应于穿过所述孔的所述至少一种带电分析物。
20.一种检测带电分析物的方法，所述方法包括：
提供具有其间有隔膜的电相反部分的流体室，所述电相反部分中的一个具有电解质，所述隔膜提供适合于所述电解质在所述流体室的所述电相反部分之间通过的孔并具有在所述孔附近束缚的至少一种带电分析物；
施加电场以使所述电解质穿过所述孔并牵拉所述至少一种带电分析物进入所述孔；和
在所述至少一种带电分析物被牵拉进入所述孔后测量指示所述至少一种带电分析物的电荷的信号。
21.根据权利要求19所述的方法，其中响应于施加的电场，所述至少一种带电分析物被牵拉至所述孔的周围附近。
22.用于检测带电分析物的工具盒，所述工具盒包括：
至少一种带电分析物；和
传感器，其包括：
流体室，其具有其间有隔膜的电相反部分，所述隔膜提供适合于电解质在所述流体室的所述电相反部分之间通过的孔并具有在所述孔附近束缚的至少一种带电分析物；
第一电路，其配置为施加能够使所述电解质穿过所述孔并牵拉所述至少一种带电分析物进入所述孔的电场；和
第二电路，其配置为在至少一种带电分析物被牵拉进入所述孔后测量指示所述至少一种带电分析物的电荷的信号。
23.根据权利要求21所示的工具盒，其中所述第二电路包括能够放大所述信号的放大器。
24.根据权利要求22所示的工具盒，其中所述放大器在距离孔大约5000μm内。
25.根据权利要求21所示的工具盒，其中所述至少一种带电分析物通过所述至少一种带电分析物和所述流体室的所述电相反部分之间的相互作用被束缚在所述孔附近。
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