KR20120045922A - 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치 - Google Patents

나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치 Download PDF

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조성문
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Abstract

본 발명은 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치에 관한 것이다. 본 발명의 장치에 의하면, 핵산의 증폭이나 합성에 기인하지 않고 나노 포어를 통해 염기 서열을 직접적으로 결정할 수 있으므로, 전체 게놈 시퀀싱에 필요한 가격과 시간을 크게 줄일 수 있고, 또한 염기 서열 내의 메틸화 여부도 함께 확인할 수 있다는 장점이 있다.

Description

나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치{Apparatus for deterimining sequences of nucleic acids including nanopore}
본 발명은 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치에 관한 것이다.
2003년 인간 게놈 프로젝트(human genome project)가 완성되면서 바야흐로 포스트 게놈 시대(post genome era)에 접어들게 되었다. 게놈 프로젝트가 완성되면 인간의 생노병사에 대한 많은 의문이 풀리고, 조기 진단이나 예방 의학 등 많은 변화가 있을 것으로 예상되고 기대되었으나, 여전히 탐구해야 하는 정보가 많이 남아있기 때문에, 이를 위해 더 많은 게놈 정보가 요구되고 있다.
전체 게놈 시퀀싱은(whole genome sequencing)은 이른바 반도체의 집적도 기술이 매년 2배씩 늘어난다는 무어의 법칙보다 더 빠른 속도로 발전하고 있는데, 한 사람의 전체 게놈 시퀀싱에 소요되는 가격은 1990년에 30억 달러에서 2001년경 3억 달러로, 그리고 2010년에 들어서는 3000~6000 달러 정도로 크게 줄어 들고 있다. 이와 같은 비용의 절감은 시퀀싱 기술의 눈부신 발전에 기반한다고 볼 수 있는데, 소위 1세대로 불리는 Sanger 방법에서부터 2세대인 증폭 기술에 기반한 SBS(sequencing by synthesis), 3세대로 불리는 증폭 없는 SBS 기반의 시퀀싱 제품이 나오고 있다. 그러나 많은 전문가들은 전체 게놈 시퀀싱의 가격이 1000 달러 이하로 떨어져야 시퀀싱의 수요가 폭발적으로 늘고, 많은 정보로부터 의미 있는 결과들을 얻어 그 활용이 커질 것으로 내다보고 있다.
따라서, 전체 게놈 시퀀싱의 가격을 낮추기 위한 많은 연구들이 전세계적으로 이뤄지고 있는데, 4세대라 불리는 나노 포어를 이용한 직접적인 염기 서열 분석 방법이 주를 이루고 있으나, 원하는 크기의 나노 포어를 형성하는데 있어서 문제가 있고, 또한 유전자 발현 분석에서 중요한 DNA 메틸화를 동시에 분석할 수 있는 방법은 아직 제시되고 있지 않은 실정이다.
본 발명의 일 구체예는 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 다면체로 이루어진 블록; 상기 블록의 일측 꼭지점에 위치하는 팁(tip); 및 상기 블록 상에 배치되어 있으며, 상기 팁과 연결되는 전극을 포함하는 포어 형성부; 및 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 말단이 상기 팁이 위치하는 상기 블록의 꼭지점을 포함하는 양측면에 결합되어 있는 연결부로 이루어진 것으로, 상기 연결부를 통해 2 이상의 상기 포어 형성부가 인접하여 연결되고, 상기 블록의 꼭지점에 위치하는 상기 팁이 서로 마주보도록 배치되어 있으며, 상기 배치에 의해 생성되는 공간은 나노 포어를 형성하는 것인 염기 서열 결정 장치를 제공한다.
본 발명의 장치는 일 양상은 다면체로 이루어진 블록; 상기 블록의 일측 꼭지점에 위치하는 팁; 및 상기 블록 상에 배치되어 있으며, 상기 팁과 연결되는 전극을 포함하는 포어 형성부를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 블록은 다면체로 이루어질 수 있으며, 상기 다면체는 상하면이 삼각형인 오면체 또는 직육면체인 것일 수 있다. 상기 블록은 본 발명의 장치를 이루는 몸체를 형성하는 것으로, 상기 블록은 부도체 물질일 수 있으며, 예를 들어, 유리, 세라믹, 실리콘, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드 및 이들의 조합으로 이루어된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
일 구체예에 따르면, 상기 팁은 상기 블록의 일측 꼭지점에 위치하며, 말단이 뾰족한 형상으로, 예를 들어, 금, 백금, 은 및 구리로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어지거나, 또는 상기 물질이 상기 전극의 말단에 증착되어 있는 형태일 수 있다.
상기 전극은 본 발명의 장치에서 전류가 흐르는 부분으로, 일 구체예에 따르면, 상기 전극은 그 말단이 상기 팁과 연결되어 있으며, 예를 들어, 금, 백금 및 인듐 틴 옥시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 전극은 상기 블록의 윗면 또는 아랫면에 존재할 수 있다.
본 발명의 장치는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 말단이 상기 팁이 위치하는 상기 블록의 꼭지점을 포함하는 양측면에 결합되어 있는 연결부를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “폴리뉴클레오티드”는 단일 가닥의 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미하며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함하는 의미로 해석된다
일 구체예에 따르면, 상기 연결부는 상기 블록의 꼭지점을 포함하는 양측면에 각각 2개 이상 100개 이하의 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있는 것일 수 있다. 상기 결합될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 개수는 하나의 예시일 뿐이며, 필요에 따라 1000개 이상의 폴리뉴클레오티드를 결합시켜 서로 인접하여 연결되는 포어 형성부의 결합력을 더욱 증가시킬 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 1 내지 300 bp의 길이를 가질 수 있다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 폴리뉴클레오티드에서 1 bp 사이의 거리는 약 0.34 nm이다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드의 길이는 후술할 나노 포어의 크기를 조절하는 데 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 분자들은 상기 팁이 위치하는 상기 블록의 꼭지점을 포함하는 양측면에 일 방향의 일정한 배열로 그 말단이 결합될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 말단의 결합은 예를 들면, 알데히드, 카르복실, 에스테르, 활성화된 에스테르, 아미노 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응성기를 말단에 도입하여, 상기 반응성기를 통해 상기 블록의 양측면에 고정화될 수 있다.
본 발명의 장치는 상기 연결부를 통해 2 이상의 상기 포어 형성부가 인접하여 연결되고, 상기 블록의 꼭지점에 위치하는 상기 팁이 서로 마주보도록 배치되어 있으며, 상기 배치에 의해 생성되는 공간은 나노 포어를 형성할 수 있다.
일 구체예에 다르면, 본 발명의 장치의 몸체를 형성하기 위해 필요에 따라 다수의 포어 형성부를 연결시킬 수 있다. 연결시킬 수 있는 포어 형성부의 개수는 예를 들어, 2개 이상 20개 이하일 수 있고, 바람직하게는 2개 이상 12개 이하일 수 있으나, 4개 이상 8개 이하인 것이 가장 바람직하다.
일 구체예에 따르면, 상기 2 이상의 포어 형성부의 연결은 각각의 연결부를 이루고 있는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 사이의 상보적 결합에 의한 것일 수 있다. 2 이상의 포어 형성부가 서로 연결되는 경우, 각각의 포어 형성부에 결합되어 있는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드는 서로 상보적인 염기 서열을 갖도록 할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 당업계에 잘 알려진 혼성화 조건에 적합하도록 임의로 선택할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 블록의 꼭지점에 위치하는 상기 팁은 서로 마주보도록 배치되어 있으며, 상기 배치에 의해 생성되는 공간은 나노 포어를 형성할 수 있다. 용어 "나노 포어(nanopore)"는 포어의 가장 좁은 단면의 중심을 지나는 선의 길이가 1 nm 내지 1000 nm인 것을 나타낸다. 상기 포어가 원의 형태인 경우, 상기 길이는 원의 직경을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 장치는 레이져 발생 장치 및 검출기를 더 포함할 수 있다. 상기 검출기는 광학적 검출기 또는 전기적 검출기일 수 있다. 상기 전기적 검출에 사용되는 검출기는 예를 들어, 전류, 전압, 저항 및 임피던스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 것일 수 있으며, 상기 광학적 검출에 사용되는 검출기는 예를 들어, 흡광, 투과, 산란, 형광, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 표면 플라스몬 공명, 표면 강화 라만 산란 및 회절로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 장치에 의하면, 핵산의 증폭이나 합성에 기인하지 않고 나노 포어를 통해 염기 서열을 직접적으로 결정할 수 있으므로, 전체 게놈 시퀀싱에 필요한 가격과 시간을 크게 줄일 수 있고, 또한 염기 서열 내의 메틸화 여부도 함께 확인할 수 있다는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따른 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치의 포어 형성부를 확대한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따른 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치에서 2 이상의 포어 형성부가 연결부를 통해 결합된 모습을 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치를 이용하여 단일 가닥 DNA의 염기 서열을 결정하는 방법의 일 구체예를 나타내는 도면이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치에 대한 모식도이고, 도 2는 일 구체예에 따른 본 발명의 장치에서 포어 형성부를 확대한 도면이다. 도 3은 일 구체예에 따른 본 발명의 장치에서 2 이상의 포어 형성부가 연결부를 통해 결합된 모습을 나타내는 도면이며, 도 4는 일 구체예에 따른 본 발명의 장치를 이용하여 단일 가닥 DNA의 염기 서열을 결정하는 방법을 나타내는 도면이다.
이하 도 1 내지 도 4를 참조하여 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치 및 이를 이용하여 염기 서열을 결정하는 방법의 일 구체예를 설명하도록 한다.
도 1은 나노 포어를 포함하는 염기 서열 결정 장치의 평면 단면도를 나타낸 것으로, 블록(100), 전극(110) 및 팁(120)으로 이루어진 포어 형성부, 연결부(130) 및 나노 포어(150)가 도시되어 있다.
블록(100)은 일 구체예에 따른 염기 서열 결정 장치의 몸체를 이루는 부분으로, 2 이상의 블록(100)이 서로 인접하게 연결되어 장치의 몸체를 구성하게 된다. 도 1에서 보는 바와 같이, 상기 블록(100)은 상하면이 직사각형으로 이루어진 직육면체의 형태일 수 있으며, 직육면체의 블록(100)을 몸체의 일부로 사용하는 경우, 4개의 블록(100)이 도 1과 같은 형태로 연결되어 장치의 몸체를 이룰 수 있다. 상기 블록의 상하면이 삼각형으로 이루어진 오면체 형태의 블록을 몸체의 일부로 사용하는 경우라면, 블록의 개수를 3개 내지 12개로 적절하게 조절하여 장치의 몸체를 형성할 수 있다. 상기 블록(100)은 전극(110)에만 전류가 흐를 수 있도록 유리 또는 실리콘과 같은 부도체 물질로 제작할 수 있다.
상기 포어 형성부를 구성하고 있는 전극(110)에는 전압이 인가되어 상기 포어 형성부에서 각각의 전극 말단에 연결된 팁(120)에 전류를 제공할 수 있다. 상기 제공되는 전류는 본 발명의 장치에 형성된 나노 포어(150)에 단일 분자의 DNA가 통과하면서 변화하게 되며, 이러한 변화는 전기 신호로 전환되어 전류 측정기와 같은 당업계에 잘 알려진 여러 전기적 검출기를 통해 검출될 수 있다. 상기 전극은 인듐 틴 옥시드 또는 금과 같은 도체 물질로 제작할 수 있다.
상기 전극(110)의 말단에 연결된 팁(120)은 전극을 통해 흐르는 전류가 도달하는 말단으로, 2 이상의 상기 포어 형성부가 연결되어 본 발명의 장치의 몸체를 형성할 때 나노 포어(150)를 형성하는 부분이다. 상기 팁(120)은 당업계에 공지된 식각 기술을 이용하여 가공할 수 있으며, 예를 들면, AFM 팁과 같이 가공할 수 있다. 상기 팁(120) 부분은 금과 같은 금속으로 이루어질 수 있으며, 본 발명의 장치에서 나노 포어(150)의 크기는 서로 마주보는 팁(120) 사이의 거리에 따라 결정될 수 있다. 연결부(130)는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드로 이루어질 수 있으며, 이는 도 2 및 도 3을 참고하여 후술하도록 한다.
도 2는 본 발명의 장치에서 포어 형성부를 확대한 도면으로, 연결부(130)가 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드로 이루어져 있음을 도시하고 있다. 또한, 도 3은 본 발명의 장치에서 2 이상의 포어 형성부가 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드가 상보적으로 결합하여 서로 연결된 모습을 도시하고 있다.
본 발명의 장치는 나노 포어를 통과하는 단일 가닥의 DNA 염기 서열을 결정하기 위한 장치로, 특히, 상기 나노 포어의 크기를 정밀하게 조절할 수 있다는 특징이 있다. 이러한 나노 포어의 조절은 상기 연결부를 이루고 있는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드의 길이를 조절함으로서 가능하다.
도 2에서와 같이 각 블록(100)에서 팁(120)이 위치하는 상기 블록(100)의 꼭지점을 포함하는 양측면에 임의의 염기 서열을 갖는 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드를 고정화시킨다. 2 이상의 포어 형성부 사이의 결합은 상기 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드의 상보적 결합에 의한다. 즉, 제1 포어 형성부의 연결부를 이루고 있는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열이 "GGGG"라면, 재2 포어 형성부의 연결부를 이루고 있는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 이와 상보적인 결합을 이룰 수 있도록 "CCCC"로 제작할 수 있다(도 3).
또한, 폴리뉴클레오티드의 길이는 원하는 나노 포어의 크기에 따라 조절될 수 있다. 이중 가닥의 DNA의 염기 사이의 거리는 대개의 경우 0.34 nm로 정해져 있기 때문에, 예를 들어, 10 bp의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드를 연결부로 이용하여 2 이상의 포어 형성부를 결합시켰다면, 포어 형성부 사이의 거리는 3.4 nm로 맞출 수 있게 된다. 따라서, 상기 연결부를 이루고 있는 폴리뉴클레오티드 내의 염기의 증감에 따라 원하는 크기의 나노 포어를 형성할 수 있다. 또한, 나노 포어의 크기는 상기 포어 형성부를 이루고 있는 팁(120)의 증착되는 금속의 두께를 조절하여 미세하게 조절이 가능하다.
도 4는 본 발명의 장치를 이용하여 단일 가닥 DNA(140)의 염기 서열을 결정하는 방법을 도시한다.
DNA의 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민의 4가지로 이루어져 있으며, 각각의 염기는 그 화학적 구조가 상이하므로, 단일 가닥의 DNA가 나노 포어(150)를 통과할 때 염기의 터널링 전류의 차이가 생기게 되고, 그 차이를 전기 신호로서 인식하여 이를 염기 정보로 바꾸게 되면 원하는 DNA의 염기 서열을 분석할 수 있다.
또한, 상기 장치에 레이져 발생 장치 및 라만 신호 검출기를 장착하여, 도 4와 같이 라만 분광법(Raman spectroscopy)을 적용하면 표면 강화 라만 산란(Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) 현상이 일어나, 증폭된 라만 신호를 얻을 수 있으며, 상기 신호로부터 메틸기에 대한 스펙트럼을 분석하면 분석하고자 하는 단일 가닥 DNA의 메틸화 여부도 측정할 수 있다.
100 : 블록
110 : 전극
120 : 팁
130 : 연결부
140 : 단일 가닥 DNA
150 : 나노 포어

Claims (10)

  1. 다면체로 이루어진 블록; 상기 블록의 일측 꼭지점에 위치하는 팁(tip); 및 상기 블록 상에 배치되어 있으며, 상기 팁과 연결되는 전극을 포함하는 포어 형성부; 및
    단일 가닥의 폴리뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드의 말단이 상기 팁이 위치하는 상기 블록의 꼭지점을 포함하는 양측면에 결합되어 있는 연결부로 이루어진 것으로, 상기 연결부를 통해 2 이상의 상기 포어 형성부가 인접하여 연결되고, 상기 블록의 꼭지점에 위치하는 상기 팁이 서로 마주보도록 배치되어 있으며, 상기 배치에 의해 생성되는 공간은 나노 포어를 형성하는 것인 염기 서열 결정 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다면체는 상하면이 삼각형인 오면체 또는 직육면체인 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 블록은 유리, 세라믹, 실리콘, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 팁은 금, 백금, 은 및 구리로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전극은 금, 백금 및 인듐 틴 옥시드로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로 이루어진 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 연결부는 상기 블록의 꼭지점을 포함하는 양측면에 각각 2개 이상 100개 이하의 폴리뉴클레오티드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 1 내지 300 bp의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  8. 제1항에 있어서, 상기 2 이상의 포어 형성부의 연결은 각각의 연결부를 이루고 있는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 사이의 상보적 결합에 의한 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  9. 제1항에 있어서, 상기 나노 포어는 포어의 가장 좁은 부분이 1 내지 1000 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
  10. 제1항에 있어서, 상기 장치는 레이져 발생 장치 및 검출기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염기 서열 결정 장치.
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