KR20110100963A - 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법 - Google Patents
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Abstract
미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법에 의하면, 표적 핵산의 염기 서열을 효율적으로 결정할 수 있다.
Description
미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법에 관한 것이다.
유전자는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민의 염기에 의해 구별되는 4가지 종류의 뉴클레오티드의 선형 배열로 구성되어 있다. 유전자 서열 분석 기술로는 Sanger 등에 의해 개발된 연쇄종결방법(chain termination method) 및 Maxam 등에 의해 개발된 화학적 분해 방법(chemical degradation method)의 2가지 기본적인 접근 방법이 있다. 그러나, 이러한 과정들은 한번에 결정할 수 있는 DNA의 크기를 제한되어, 비용 및 시간이 많이 소모되므로, 인간 게놈 프로젝트와 같이 한번에 많은 표적 서열을 분석하는데에는 적합하지 않다. 2005년부터 등장하기 시작한 Sanger 방법을 사용하지 않는 새로운 유전자 서열 분석기술인 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS) 기술은 유전자 서열의 분석량을 급격하게 증가시키고, 시퀀싱 비용을 급속하게 낮추고 있다.
NGS 기술은 크게 2세대 시퀀싱 기술과 3세대 시퀀싱 기술로 나눌 수 있다. DNA 클론을 사용하는 2세대 시퀀싱 기술은 클로닝된 DNA가 대부분 반응에 참여하도록 해야 하므로, 사이클 반응이 필요하다. 그러나, 단일 DNA를 이용한 3세대 시퀀싱 기술은 DNA 클론을 사용하지 않기 때문에 시퀀싱 프로세스가 다양한 방식으로 가능하게 되었다. 3세대 시퀀싱 기술 중, 나노 포어를 이용한 시퀀싱은 가장 이상적인 시퀀싱 방법이나, 단일 DNA 분자가 나노 포어를 통과하는 속도는 매우 빠르기 때문에, DNA의 염기 서열을 결정하기 위한 충분한 검출 시간을 제공하지 못한다는 단점을 가지고 있다.
이와 관련하여, 관련 기술은 나노 포어의 양단의 전압을 낮추거나, 온도를 낮추고, 용액 점도를 높이는 등의 방법을 사용하거나, 또는, 광학 트위져(optical tweezer) 또는 자성 트위져(magnetic tweezer)를 사용하는 방법을 개시하였으며, 또 다른 관련 기술은 전기적 조절로 DNA 상의 염기 하나씩을 옮겨 가는 방법으로 DNA의 이동 속도를 조절하는 방법을 개시한다. 그러나, 관련 기술에 의하면, 단일 DNA 분자가 나노 포어를 통과하는 속도가 늦춰지더라도, 통과 속도가 일정하지 않을 수 있으며, 확산에 의해 DNA가 나노 포어로 근접하기 때문에, 시료의 양이 많이 필요하다는 단점이 있다.
따라서, 종래 기술에 의하더라도, 표적 핵산의 염기 서열을 보다 효율적으로 결정하는 방법 및 장치가 여전히 요구되고 있다.
일 구체예는 제1 채널 및 상기 제1 채널과 나노 포어를 통하여 유체 소통 가능하게 연결된 제2 채널 또는 챔버를 하나 이상 포함하는 미세 유동 장치를 제공하는 것이다.
다른 구체예는 상기 미세 유동 장치를 이용한 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 제1 채널; 및 상기 제1 채널과 나노 포어를 통하여 유체 소통 가능하게 연결된 제2 채널 또는 챔버를 하나 이상 포함하는 미세 유동 장치로서, 상기 제1 채널에는 채널의 길이 방향에 대하여 전압을 인가하기 위한 제1 전극 및 제2 전극이 배치되어 있고, 상기 제1 채널 내의 물질을 검출하기 위한 제1 검출기가 배치되어 있으며, 상기 제2 채널 또는 챔버에는 상기 제1 전극 또는 제2 전극과 쌍을 이루어 상기 제1 전극 또는 제2 전극과의 사이에 전압을 인가하기 위한 제3 전극이 배치되어 있고, 상기 나노 포어에는 상기 나노 포어를 통과하는 물질을 검출하기 위한 제2 검출기가 배치되어 있는 것인 장치를 제공한다.
용어, "미세 유동 장치(microfluidic device)"는 하나 이상의 입구 및 출구를 포함하고, 상기 입구 및 출구는 마이크로 또는 나노 채널에 의하여 연통되어 있는 장치를 의미한다. 상기 미세 유동 장치는 일반적으로 일정한 화학 반응 또는 분석을 하기 위한 마이크로 또는 나노 채널 또는 챔버를 포함한다. 상기 채널의 단면은 임의의 형상을 가질 수 있으며, 예를 들어, 원형, 사각형 및 사다리형 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "나노 포어(nanopore)"는 포어의 가장 좁은 단면의 중심을 지나는 선의 길이가 1 nm 내지 1000 nm인 것을 나타낸다. 상기 포어가 원의 형태인 경우, 상기 선의 길이는 원의 직경을 의미한다. 상기 포어의 크기는 예를 들면, 가장 좁은 단면의 직경이 1 nm 내지 1000 nm일 수 있으며, 10 nm 내지 1000 nm일 수 있다. 이를 포어의 단면적으로 계산하는 경우, 포어에서 가장 좁은 단면적은 예를 들어, 1 nm2 내지 8 x 105 nm2 일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 나노 포어는 직경이 단일 가닥인 핵산의 직경보다 큰 것일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 미세 유동 장치는 제1 채널 및 상기 제1 채널과 나노 포어를 통하여 유체 소통 가능하게 연결된 제2 채널 또는 챔버를 하나 이상 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 채널 및 제2 채널 또는 챔버는 상기 채널 또는 챔버의 측면 또는 바닥면의 벽면이 서로 맞닿아 있고, 상기 벽면에 포함된 나노 포어에 의해 유체 소통 가능하도록 제작될 수 있다. 또한, 상기 나노 포어는 채널의 형태로 상기 제1 채널 및 제2 채널 또는 챔버를 유체 소통 가능하도록 연결될 수 있다.
한편, 상기 제1 채널의 직경은 예를 들어, 10 nm 내지 1000 nm일 수 있으며, 10 nm 내지 100 nm일 수 있다. 또한, 상기 제2 채널 또는 챔버의 직경은 예를 들어, 10 nm 내지 1000 nm일 수 있으며, 10 nm 내지 100 nm일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 제1 채널은 양 말단에 개구부를 포함하는 것으로, 한쪽 개구부로부터 다른쪽 개구부로 표적 물질이 통과하는 채널이며, 상기 제2 채널 또는 챔버는 상기 나노 포어를 통해 표적 물질의 출입이 가능한 것일 수 있다.
상기 표적 물질은 그 자체가 전하를 갖는 물질 또는 유도된 전하를 갖는 물질을 포함할 수 있다. 상기 표적 물질은 유기물질, 무기물질 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 핵산 또는 변형된 핵산(예를 들어, DNA, RNA, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid)) 또는 폴리펩티드 또는 이들의 복합체(complex)일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 복합체는 핵산과 핵산의 2 bp 이상의 서열을 인식하여 핵산에 결합하는 프로브 분자와의 결합으로 만들어질 수 있다. 또한, 상기 표적 물질을 상기 채널 내에 이동시키기 위해서는 상기 표적 물질의 운반을 매개할 수 있는 매개 물질이 필요할 수 있으며, 이는 당업계에 알려진 어떠한 완충 용액이라도 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 채널에는 채널의 길이 방향에 대하여 전압을 인가하기 위한 제1 전극 및 제2 전극이 배치되어 있다. 상기 제1 전극 및 제 2 전극은 상기 미세 유동 장치의 양 말단에 배치될 수 있다. 또한, 상기 제1 전극 및 제2 전극은 서로 반대 극성을 갖는 전압이 인가될 수 있다. 예를 들어, 핵산과 같은 (-) 극성을 갖는 표적 물질이 제1 채널 내로 유입되는 경우, 제1 전극은 (-) 극성을, 제2 전극은 (+) 극성의 전압을 인가하도록 조절될 수 있다. 또한, 상기 장치는 상기 극성의 세기를 조절하는 전압 조절부를 더 포함할 수 있으며, 상기 전압 조절부에 의해 제1 채널 내에 유입된 표적 물질의 이동 속도를 조절할 수 있다,
일 구체예에 따르면, 상기 장치는 상기 제1 채널 내에 통과하는 표적 물질을 검출하기 위한 제1 검출기가 배치될 수 있다. 또한, 상기 나노 포어에는 상기 나노 포어를 통과하는 물질을 검출하기 위한 제2 검출기가 배치될 수 있다.
상기 제1 검출기 또는 제2 검출기는 광학적 검출기 또는 전기적 검출기일 수 있다. 상기 전기적 검출기는 예를 들어, 전류, 전압, 저항 및 임피던스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 것일 수 있으며, 상기 광학적 검출기는 예를 들어, 흡광, 투과, 산란, 형광, 형광 공명 에너지 전이 (FRET), 표면 플라스몬 공명, 표면 강화 라만 산란 및 회절로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 제2 검출기는 나노 전극일 수 있으며, 상기 제2 검출기가 나노 전극인 경우, 염기의 터널링 전류 차이를 이용하여 직접 염기 서열의 정보를 얻거나, 임피던스, 전기 용량(capacitance), 컨덕턴스(conductance) 또는 전기 화학 등에 의해 핵산과 결합한 프로브 정보를 얻을 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제2 채널 또는 챔버에는 상기 제1 전극 또는 제2 전극과 쌍을 이루어 상기 제1 전극 또는 제2 전극과의 사이에 전압을 인가하기 위한 제3 전극이 배치될 수 있다.
상기 제3 전극은 제2 채널 또는 챔버 내부의 어떠한 위치라도 배치가 가능하며, 예를 들어, 상기 제2 채널 또는 챔버 내부에서 나노 포어를 마주 보는 위치에 배치될 수 있다. 상기 제3 전극은 제1 채널을 이동하는 표적 물질을 나노 포어를 통해 제2 채널 또는 챔버로 이동하도록 유도하는 추진력을 제공하기 위해 요구되는 것으로, 제3 전극에 인가되는 전압은 제1 전극에 인가되는 전압과 상대되는 극성을, 제2 전극에 인가되는 전압과 동일한 극성을 갖는 것일 수 있다. 즉, 제1 채널을 이동하는 표적 물질이 나노 포어를 통해 제2 채널 또는 챔버로 이동되기 위해서는, 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가된 전압을 제1 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환(switch)시켜야 한다, 이를 위해서, 상기 장치는 상기 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환시키기 위한 전압 전환부를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 장치는 상기 제1 채널의 양쪽 말단의 개구부에 유체 소통 가능하게 연결된 시료 주입부 및 시료 배출부 각각 더 포함할 수 있다. 상기 시료 주입부는 상호간에 유체 소통 가능한 하나 이상의 마이크로 유동 채널을 포함하는 마이크로 유동 지역 및 하나 이상의 나노 유동 채널을 포함하는 나노 유동 부위를 포함하며, 상기 마이크로 유동 지역 및 나노 유동 지역의 경계면에 존재하는 상기 마이크로 유동 채널 또는 나노 유동 채널의 개구부는 가로 방향의 길이가 상기 나노 유동 지역을 향해 점점 감소되는 것일 수 있다. 상기 마이크로 유동 채널 또는 나노 유동 채널의 개구부는 가로 방향의 길이가 예를 들어, 10 nm 내지 500 nm의 폭 만큼 점점 감소되는 것일 수 있다. 즉, 상기 시료 주입부는 채널의 직경 크기가 작아지는 방향으로 배치되는 하나 이상의 마이크로 유동 채널 및 나노 유동 채널을 포함하므로, 시료가 주입되면, 상기 시료 주입부 내의 채널들을 통과하면서, 구조적으로 제한을 받게 되어 펼쳐지게 된다. 최종적으로 표적 물질의 농도를 조절하거나 전극의 조절을 통해 동일 시간에 한 분자의 표적 물질만이 상기 미세 유동 장치의 제1 채널에 유입되도록 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 장치는 상기 제2 검출기와 연결되며, 상기 제2 검출기로부터 검출 신호를 핵산의 염기 서열 정보로 변환시키는 변환부; 및 상기 제1 검출기 및 변환부에서 얻어지는 정보로부터 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 연산부를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 변환부는 상기 제2 검출기로부터 발생하는 검출 신호를 표적 프로브 위치 정보로 변환시키는 것일 수 있다.
또한, 상기 장치는 상기 연산부로부터 결정된 표적 핵산의 염기 서열을 사용자에게 출력시키는 출력부를 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 염기 서열을 결정하고자 하는 표적 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자를 연결시키는 단계; 상기 나노 입자가 연결된 표적 핵산을 상기 제1 채널을 통하여 주입하는 단계; 상기 장치의 제1 전극 및 제2 전극 사이에 전압을 인가하는 단계; 상기 제1 채널을 통과하는 상기 표적 핵산에 연결된 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계; 및 상기 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환시켜 상기 나노 입자가 연결되지 않은 표적 핵산의 말단 부분을 포어로 도입시키는 단계를 포함하는 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법을 제공한다.
상기 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
상기 방법은, 염기 서열을 결정하고자 하는 표적 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자를 연결시키는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "나노 입자(nanoparticle)"는 직경 1 내지 100 nm 크기의 물질들로 이루어진 입자를 의미하며, 상기 나노 입자를 이루는 성분은 예를 들어, 금, 은, 구리, 알루미늄, 니켈, 팔라듐 및 백금 등과 같은 금속, CdSe, CdS, InAs, InP 등의 반도체 물질, 폴리스틸렌, 라텍스, 아크릴레이트 계열, 폴리펩티드 등의 중합 물질과 같은 불활성 물질일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 나노입자와 표적 핵산과의 결합은 1:1 공유 결합일 수 있으며, 이를 위해서 나노 입자와 표적 핵산을 화학 결합시킨 다음 나노 입자와 표적 핵산이 결합된 것을 분리할 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산을 나노 입자보다 과량으로 넣어 나노 입자의 자기적 특성이나 전기 영동 속도 차이 또는 크기 등의 물리적 특성을 이용하여 분리하는 방식으로 표적 핵산과 나노 입자가 1:1로 결합한 것을 분리할 수 있다. 또 다른 방법으로, 나노 입자에 결합 가능한 작용기를 1개만 가지고 있는 것을 활용할 수 있는데, 폴리펩티드의 경우 C-또는 N-말단의 작용기를 활용할 수 있다. 나노 입자가 비드 형태인 경우, 작용기가 여러 개일 수 있으며, 하나의 작용기를 갖진 나노 입자를 선택하는 방식으로 하나의 작용기만을 도입하는 것도 가능하다. 예를 들어, Nam 등은 Nature Material vol 9, 60p (2010)에서 하나의 올리고 핵산 서열이 다른 형태의 나노 입자 합성을 개시하고 있으며, 상기 올리고 핵산에 작용기를 도입하면 상기와 동등한 효과를 얻을 수 있다. 또한, DNA 이중 나선의 경우 양단에 작용기에 의한 반응이 가능하므로 이를 분리하기 위한 별도의 과정이 포함될 수 있다.
상기 나노 입자는 상기 미세 유동 장치의 제1 채널 내에서 상기 표적 핵산의 이동을 감속 또는 가속시켜 DNA의 펼침을 향상시키기 위해 표적 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 연결될 수 있다. 또한, 상기 나노 입자는 상기 표적 핵산이 제1 채널 내에서 이동하는 위치를 파악할 수 있도록, 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
용어 "핵산(nucleic acid)"은 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드를 포함하며, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 포함한다. 예를 들어, 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포함하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
용어 "검출 가능한 표지(detectable label)"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자의 특이적으로 검출하도록 하는 원자, 분자 또는 입자로, 상기 검출 가능한 표지는 예를 들어, 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 혼성화 가능한 핵산, 발색 물질, 형광 물질, 전기적으로 검출 가능한 물질, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 물질 또는 양자점 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 표지는 표지된 결합 단백질, 중금속 원자 및 다이와 같은 분광학적 마커, 및 자기 표지물을 포함할 수 있다. 상기 다이는 예를 들어, 퀴놀린 다이, 트리아릴메탄 다이, 프탈레인, 아조 다이 및 시아닌 다이를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 물질은 예를 들어, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 및 Cy3와 Cy5(Pharmacia)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
한편, 상기 나노 입자의 직경은 제1 채널 내에서 상기 표적 핵산의 속도를 느리게 할 수 있으며, 또한, 상기 제1 채널을 통과할 수 있을 정도의 크기일 수 있으며, 예를 들어, 1 nm 내지 100 nm, 또는 1 nm 내지 10 nm일 수 있다. 또한, 상기 나노 입자는 상기 나노 입자가 연결된 표적 핵산 가닥이 상기 제1 채널 내에서 펼쳐지도록 하기 위해 제1 전극에 인가된 전압의 극성과 동일한 극성을 갖도록 할 수 있다. 다만, 상기 나노 입자가 극성을 갖는 경우라면, 상기 나노 입자가 연결된 표적 핵산 가닥이 제1 채널 내에서 이동할 수 있도록, 상기 극성의 크기는 제1 전극에 인가된 전압의 극성의 크기보다는 작아야 한다. 또한, 상기 표적 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
이후, 상기 방법은 상기 나노 입자가 연결된 표적 핵산을 상기 미세 유동 장치의 제1 채널을 통하여 주입하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 주입은 예를 들어, 상기 미세 유동 장치에 장착된 시료 주입부를 통하여 주입될 수 있으며, 시료 공급 장치(예를 들어, 펌프 등)에 의해 자동으로 주입되거나 또는 실험자에 의해 수동으로 주입될 수 있다. 상기 시료 주입부를 통하여 표적 핵산이 주입되는 경우, 상기 설명한 바와 같이, 한 가닥의 핵산 분자만이 제1 채널로 유입될 수 있다.
이후, 상기 방법은 상기 장치의 제1 전극 및 제2 전극 사이에 전압을 인가하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 단계에서, 제1 전극 및 제2 전극에 서로 다른 극성을 갖도록 전압을 인가할 수 있다, 즉, 표적 핵산은 (-) 극성을 나타내므로, 일 구체예에 따른 미세 유동 장치에서, 제1 전극은 (-) 극성, 제2 전극은 (+) 극성의 전압이 인가되도록 할 수 있다. 상기와 같이 전압이 인가됨으로써, 제1 채널에 유입된 표적 핵산은 제2 전극이 배치된 방향으로 이동할 수 있게 된다.
이후, 상기 방법은 상기 제1 채널을 통과하는 상기 표적 핵산에 연결된 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 포함할 수 있다,
상기 표적 핵산에 연결된 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자로부터 발생하는 신호는 상기 미세 유동 장치 내의 제1 검출기에서 검출될 수 있다. 상기 발생하는 신호는 검출 가능한 표지의 종류에 따라 다양할 수 있으며, 그 예는 상기 설명한 바와 같다. 상기 나노 입자에서 발생하는 신호의 검출에 의해, 표적 핵산이 제1 채널 내의 어느 위치를 통과하고 있는지 여부를 인지할 수 있으며. 또한, 상기 신호로부터 표적 핵산에 결합한 표지의 시작점 또는 종결점의 위치를 파악할 수 있으므로, 상기 표적 핵산의 염기 서열 결정에 정보를 제공할 수 있다.
이후, 상기 방법은 상기 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환시켜 상기 나노 입자가 연결되지 않은 표적 핵산의 말단 부분을 나노 포어로 도입시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 제1 전극 및 제2 전극에 전압을 인가하여, 표적 핵산이 제1 채널 내에서 이동하는 중에, 상기 표적 핵산에 연결되어 있는 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자로부터 발생하는 신호를 제1 검출기에서 검출하면, 제1 전극과 제2 전극에 인가되었던 전압은 제1 전극과 제3 전극으로 전압이 인가되도록 전환될 수 있다. 상기 전환에 의해, 제1 전극 및 제2 채널 또는 챔버 중에 배치된 제3 전극에 서로 다른 극성의 전압이 인가되므로, 상기 표적 핵산은 제2 채널 또는 챔버 쪽으로 인력을 받게 된다. 일 구체예에 따르면, 상기 제1 채널 및 제2 채널 또는 챔버는 나노 포어를 통해 유체 소통 가능하게 연결되어 있으므로, 상기 표적 핵산은 나노 포어를 통해 제2 채널 또는 챔버 방향으로 이동하게 된다. 또한, 상기 표적 핵산의 말단에는 나노 입자가 연결되어 있으므로, 상기 나노 입자가 연결되지 않은 표적 핵산의 말단부터 상기 나노 포어를 통해 제2 채널 또는 챔버 방향으로 이동될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 연결시키는 단계 이후, 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브를 상기 표적 핵산과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 표적 핵산과 프로브의 접촉은 시험관 내에서 당업계에 공지된 엄격한 조건(stringent condition) 하에, 적절한 완충액 내에서 이루어질 수 있다.
용어 "프로브(probe)"는 하나 이상의 종류의 화학 결합, 일반적으로 상보적 염기 결합, 즉, 염기 간의 수소 결합을 통해 상보적 서열의 표적 핵산에 결합할 수 있는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 상기 프로브는 상기 표적 핵산의 염기 서열의 일부와 상보적인 결합을 하는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 상기 프로브가 핵산인 경우, 일반적으로, 상기 프로브는 예를 들어, 4 내지 100개 뉴클레오티드의 임의의 길이를 가질 수 있다. 상기 프로브가 단백질인 경우, 상기 표적 서열 결합 단백질에서, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하는 아미노산 서열은 핵산 결합 모티프(nucleic acid binding motif)를 포함할 수 있으며, 상기 단백질은 하나 이상의 핵산 결합 모티프를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합하는 아미노산 서열은 징크 핑거(zinc finger) 모티프, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프, 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 모티프, 류신 지퍼(leucine zipper) 모티프, 제한 효소(restriction endonuclease)의 핵산 결합 모티프 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 결합 모티프를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 서로 다른 징크 핑거 모티프는 서로 다른 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식할 수 있으며, 이러한 징크 핑거 모티프의 특정 아미노산 서열이 인식하는 특이적인 뉴클레오티드 서열에 대한 내용은 http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php에서 찾아볼 수 있다. 상기 프로브는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 상기 프로브에 포함될 수 있는 검출 가능한 표지의 예는 상기 설명한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 도입시키는 단계 이후, 상기 제2 검출기에서 상기 표적 핵산의 염기 서열 또는 상기 표적 핵산에 결합된 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 표적 핵산의 염기 서열 또는 상기 표적 핵산에 결합된 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브로부터 발생하는 신호는 상기 미세 유동 장치 내의 제2 검출기에서 검출될 수 있다. 상기 발생하는 신호는 검출 가능한 표지의 종류에 따라 다양할 수 있으며, 그 예는 상기 설명한 바와 같다. 상기 검출하는 단계 이후, 상기 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극 및 제2 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환시켜 상기 나노 입자가 연결된 표적 핵산을 제1 채널로 이동시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 이동시키는 단계는 나노 포어를 통해 제2 채널 또는 챔버로 이동되면서, 상기 제2 검출기를 통해 표적 핵산의 염기 서열 또는 상기 표적 핵산에 결합된 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브로부터 발생하는 신호를 검출을 모두 마친 이후의 단계를 의미한다. 즉, 검출이 완료된 표적 핵산을 배출시키기 위해 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극 및 제2 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환시켜 상기 나노 포어를 통해 상기 표적 핵산을 다시 제1 채널의 방향으로 이동시키게 된다. 상기 이동된 표적 핵산은 시료 배출부로 이동되어 배출될 수 있다. 대안적으로, 상기 표적 핵산은 상기 단계를 거치지 않고, 나노 포어를 통과하여 제2 채널 또는 챔버 내로 배출될 수도 있다.
한편, 상기 제2 검출기에서 검출된 표적 핵산의 염기 서열 정보 또는 프로브 정보는 상기 미세 유동 장치에서 설명한 바와 같이, 변환부, 연산부 및 출력부를 거쳐 사용자에게 출력될 수 있다.
일 구체예에 따른 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법에 의하면, 표적 핵산의 염기 서열을 효율적으로 결정할 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 미세 유동 장치를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치에 장착될 수 있는 시료 주입부를 확대한 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치 내의 나노 포어에서 표적 핵산의 염기 서열이 결정되는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5a 및 도 5b는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 프로브 맵핑에 의한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 단일 가닥 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치에 장착될 수 있는 시료 주입부를 확대한 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치 내의 나노 포어에서 표적 핵산의 염기 서열이 결정되는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5a 및 도 5b는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 프로브 맵핑에 의한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 단일 가닥 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 일 구체예에 따른 표적 핵산의 염기 서열을 결정하기 위한 미세 유동 장치에 대한 모식도이며, 도 2는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치에 장착될 수 있는 시료 주입부를 확대한 도면이다. 또한, 도 3은 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 1 내지 도 3을 참조하여 미세 유동 장치를 이용한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법의 일 구체예를 설명하면, 먼저, 제1 채널(100)과 유체 소통 가능하게 연결된 시료 주입부(220)에 표적 핵산을 포함하는 시료를 주입한다. 상기 표적 핵산은 5' 말단 또는 3' 말단에 광학적 또는 전기적으로 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자와 연결되어 있을 수 있다. 상기 시료 주입부(220)는 마이크로 유동 지역(240) 및 나노 유동 지역(250)으로 이루어진 복수 개의 채널이 그라디언트(gradient) 구조로 구성되어 있으므로, 상기 시료 주입부(220)에 주입된 상기 표적 핵산은 상기 마이크로 유동 지역(240) 및 나노 유동 지역(250)을 통과하여 선형으로 펼쳐지게 된다.
제1 채널(100)에 유입된 한 가닥의 표적 핵산은 제1 전극(130)에 인가되는 (-) 극성의 전압 및 제2 전극(140)에 인가되는 (+) 극성의 전압에 의해 제2 전극(140)이 배치된 방향으로 이동하게 된다. 이때, 상기 표적 핵산에 연결된 나노 입자와 나노 채널 구조로 인해 상기 표적 핵산은 제1 채널(100) 내에서 펼쳐진 구조로써 이동될 수 있다. 또한, 상기 나노 입자는 상기 표적 핵산의 이동을 감속시키는 기능을 한다.
제1 검출부(150)는 제1 채널(100)의 내부를 이동하는 상기 표적 핵산에 연결된 상기 나노 입자에 포함된 검출 가능한 표지로부터 광학적 또는 전기적인 신호를 검출한다. 일 구체예에 따르면, 상기 제1 검출부(150)에 의해 상기 신호가 검출되면 이는 표적 핵산이 나노 포어(120)에 근접한 것이므로, 상기 나노 포어(120)를 통과하는 표적 핵산의 염기 서열을 검출하기 위해 나노 포어(120)를 통과하도록 인가되는 전압을 전환시킬 수 있다. 즉, 제1 전극(130)과 제2 전극(140)에 인가되었던 전압을 제1 전극(130)과 제3 전극(160)으로 전압이 인가되도록 전환시킬 수 있다. 상기 전압의 전환은 전압 전환부(180)에 의해 이루어지며, 상기 전압의 전환에 의해, 상기 표적 핵산은 제2 채널 또는 챔버(110) 쪽으로 인력을 받는다. 따라서, 상기 표적 핵산은 상기 나노 입자가 연결되지 않은 표적 핵산의 말단부터 나노 포어(120)를 통해 제2 채널 또는 챔버(110) 방향으로 이동하게 된다.
상기 나노 포어(120)를 통과하는 표적 핵산은 제2 검출기(170)에 의해 신호가 검출될 수 있다. 상기 제2 검출기(170)는 예를 들어, 나노 전극일 수 있으며, 이 경우, 염기의 터널링 전류 차이 또는 임피던스 등을 이용하여 직접적으로 염기 서열의 정보를 얻을 수 있다(도 4). 이 때, 상기 나노 전극은 1 nm 이하의 두께를 가질 수 있다.
상기 염기 서열의 정보를 얻기 위해서는 상기 제2 검출기(170)로부터 검출 신호를 변환부(190)에서 핵산의 염기 서열 정보로 변환시키고, 연산부(200)에서 상기 제1 검출기(150)로부터 얻어지는 표적 핵산의 위치 정보, 즉, 표적 핵산의 시작 지점 및 변환부(190)에서 얻어지는 검출 신호를 연산하여 표적 핵산의 염기 서열을 결정할 수 있다. 상기 결정된 염기 서열의 정보는 출력부(210)를 통해 사용자에게 출력될 수 있다.
상기 나노 포어(120)를 통해 상기 제2 채널 또는 챔버(110) 방향으로 이동되면서 염기 서열의 결정이 완료된 표적 핵산은 상기 제1 전극(130)과 제3 전극(160) 사이에 인가되는 전압을 전압 전환부(180)에 의해 제1 전극(130) 및 제2 전극(140) 사이에 인가되는 전압으로 전환시켜 다시 제1 채널(100)의 방향으로 이동시킬 수 있다. 상기 제1 채널(100)로 이동된 표적 핵산은 시료 배출부(230)로 이동되어 배출될 수 있다. 또한, 상기 표적 핵산은 나노 포어(120)를 통과하여 제2 채널 또는 챔버(110) 내로 배출될 수도 있으며, 이를 위해서는 나노입자와 핵산을 전기적 또는 광학적 방법으로 분리할 수 있는 작용기가 나노 입자와 핵산 사이에 도입될 수 있다..
도 5a 및 도 5b는 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 프로브 맵핑에 의한 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
프로브 맵핑에 의한 표적 핵산의 염기 서열은 일 구체예에 따른 상기 미세 유동 장치를 이용하여 결정할 수 있다. 상기 프로브 맵핑을 위해서는 일 구체예에 따른 상기 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법에서, 상기 표적 핵산의 일부 염기 서열에 상보적으로 결합할 수 있으며, 광학적 또는 전기적으로 검출 가능한 표지를 포함하는 핵산 또는 단백질 프로브를 접촉시키는 과정을 추가적으로 필요로 한다. 또한, 상기 제2 검출기(170)는 상기 프로브에 포함된 검출 표지로부터 발생하는 신호를 검출하여 상기 변환부(190)에서 표적 핵산의 염기 서열 정보로 변환시킬 수 있다. 연산부(200)에서는 상기 변환부(190)에서 변환된 염기 서열 정보를 수집하여 프로브 맵을 연산, 분석함으로써 최종적으로 출력부(210)를 통해 사용자에게 표적 핵산의 염기 서열 정보를 출력할 수 있다. 이외의 과정은 상기 일 구체예에 따른 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법과 동일하다.
도 6은 일 구체예에 따른 미세 유동 장치를 이용하여 단일 가닥 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 개략적으로 나타낸 도면이다.
염기 서열을 검출하기 위해서 단일 가닥의 표적 핵산을 사용할 수 있다. 제2 검출기(170)가 나노 전극인 경우, 상기 단일 가닥의 표적 핵산을 나노 포어(120)로 통과시켜야 하지만, 완충액 상에서 단일 가닥의 핵산은 안정적으로 긴 길이를 유지하기가 어렵다. 따라서, 이러한 문제를 극복하기 위해 단일 가닥 결합 단백질(single strand binding protein)로 상기 단일 가닥 핵산을 안정화시키거나, 상기 표적 핵산의 일부, 즉 나노 포어(120)를 통과하지 않는 부분의 핵산을 이중 가닥 핵산으로 유지시켜 긴 길이의 표적 핵산을 완충액 상에서 사용할 수 있다.
100: 제1 채널
110: 제2 채널 또는 챔버
120: 나노 포어
130: 제1 전극
140: 제2 전극
150: 제1 검출기
160: 제3 전극
170: 제2 검출기
180: 전압 전환부
190: 변환부
200: 연산부
210: 출력부
220: 시료 주입부
230: 시료 배출부
240: 마이크로 유동 지역
250: 나노 유동 지역
110: 제2 채널 또는 챔버
120: 나노 포어
130: 제1 전극
140: 제2 전극
150: 제1 검출기
160: 제3 전극
170: 제2 검출기
180: 전압 전환부
190: 변환부
200: 연산부
210: 출력부
220: 시료 주입부
230: 시료 배출부
240: 마이크로 유동 지역
250: 나노 유동 지역
Claims (24)
- 제1 채널; 및 상기 제1 채널과 나노 포어를 통하여 유체 소통 가능하게 연결된 제2 채널 또는 챔버를 하나 이상 포함하는 미세 유동 장치로서, 상기 제1 채널에는 채널의 길이 방향에 대하여 전압을 인가하기 위한 제1 전극 및 제2 전극이 배치되어 있고, 상기 제1 채널 내의 물질을 검출하기 위한 제1 검출기가 배치되어 있으며, 상기 제2 채널 또는 챔버에는 상기 제1 전극 또는 제2 전극과 쌍을 이루어 상기 제1 전극 또는 제2 전극과의 사이에 전압을 인가하기 위한 제3 전극이 배치되어 있고, 상기 나노 포어에는 상기 나노 포어를 통과하는 물질을 검출하기 위한 제2 검출기가 배치되어 있는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 나노 포어의 직경은 1 nm 내지 100 nm인 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 채널은 직경이 10 nm 내지 100 nm인 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 채널 또는 챔버는 직경이 10 nm 내지 1000 nm인 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 검출기는 광학적 검출기 또는 전기적 검출기인 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 검출기는 광학적 검출기 또는 전기적 검출기인 것인 장치.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 전기적 검출기는 전류, 전압, 저항 및 임피던스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 것인 장치.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 광학적 검출기는 흡광, 투과, 산란, 형광, 형광 공명 에너지 전이, 표면 플라스몬 공명, 표면 강화 라만 산란 및 회절로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 검출하기 위한 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환(switch)하기 위한 전압 전환부를 더 포함하는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 장치는 상기 제2 검출기와 연결되며, 상기 제2 검출기로부터 검출 신호를 핵산의 염기 서열 정보로 변환시키는 변환부; 및 상기 제1 검출기 및 변환부에서 얻어지는 정보로부터 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 연산부를 더 포함하는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 장치는 상기 제2 검출기와 연결되며, 상기 제2 검출기로부터 발생하는 검출 신호를 표적 프로브 위치 정보로 변환시키는 변환부; 및 상기 센서 및 변환부에서 얻어지는 정보로부터 표적 핵산의 염기 서열을 결정하는 연산부를 더 포함하는 것인 장치.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 장치는 상기 연산부로부터 결정된 표적 핵산의 염기 서열을 사용자에게 출력시키는 출력부를 더 포함하는 것인 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 장치는 상기 제1 채널의 양쪽 말단의 개구부에 유체 소통 가능하게 연결된 시료 주입부 및 시료 배출부 각각 더 포함하는 것인 장치.
- 제13항에 있어서, 상기 시료 주입부는 상호간에 유체 소통 가능한 하나 이상의 마이크로 유동 채널을 포함하는 마이크로 유동 지역 및 하나 이상의 나노 유동 채널을 포함하는 나노 유동 부위를 포함하며, 상기 마이크로 유동 지역 및 나노 유동 지역의 경계면에 존재하는 상기 마이크로 유동 채널 또는 나노 유동 채널의 개구부는 가로 방향의 길이가 상기 나노 유동 지역을 향해 점점 감소되는 것인 장치.
- 제14항에 있어서, 상기 가로 방향의 길이는 10 nm 내지 500 nm의 길이만큼 점점 감소되는 것인 장치.
- 염기 서열을 결정하고자 하는 표적 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자를 연결시키는 단계;
상기 나노 입자가 연결된 표적 핵산을 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 장치의 제1 채널을 통하여 주입하는 단계;
상기 장치의 제1 전극 및 제2 전극 사이에 전압을 인가하는 단계;
상기 제1 채널을 통과하는 상기 표적 핵산에 연결된 검출 가능한 표지를 포함하는 나노 입자로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계; 및
상기 제1 전극과 제2 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환시켜 상기 나노 입자가 연결되지 않은 표적 핵산의 말단 부분을 나노 포어로 도입시키는 단계를 포함하는 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법. - 제16항에 있어서, 상기 나노 입자는 직경이 1 nm 내지 100 nm인 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥인 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 방법은 상기 연결을 시키는 단계 이후, 상기 나노 입자와 하나의 표적 핵산이 연결된 것을 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 방법은 상기 연결시키는 단계 이후, 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브를 상기 표적 핵산과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 프로브는 상기 표적 핵산의 염기 서열의 일부와 상보적인 결합을 하는 핵산 또는 단백질인 것인 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 방법은 상기 도입시키는 단계 이후, 상기 제2 검출기에서 상기 표적 핵산의 염기 서열 또는 상기 표적 핵산에 결합된 검출 가능한 표지를 포함하는 프로브로부터 발생하는 신호를 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 방법은 상기 검출하는 단계 이후, 상기 제1 전극과 제3 전극 사이 또는 제2 전극과 제3 전극 사이에 인가되는 전압을 제1 전극 및 제2 전극 사이에 인가되는 전압으로 전환시켜 상기 나노 입자가 연결된 표적 핵산을 제1 채널로 이동시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제16항 또는 제20항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 색깔 비드(colored bead), 항원 결정체, 효소, 혼성화 가능한 핵산, 발색 물질, 형광 물질, 전기적으로 검출 가능한 물질, 변경된 형광-분극 또는 변경된 빛-확산을 제공하는 물질 또는 양자점으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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