WO2011030944A1 - 다중 pna를 이용하는 dna 서열 분석 방법 및 장치 - Google Patents

Abstract

본 발명의 일 측면은 DNA를 전기적으로 고정시키고 완전히 펼친 상태에서 표지체로부터 방출되는 파장을 검출함으로써 광학적인 한계를 보완하여 높은 정밀도를 갖는 DNA 서열분석 방법 및 상기 방법을 자동화할 수 있는 나노 소자 칩을 제공하고자 한다. 본 발명의 또다른 측면은 상이한 파장을 방출하는 표지체(label)로 표지된 복수 개의 PNA(peptide nucleic acid)를 서열 분석 대상 DNA에 상보적 결합시켜 결합 오차를 제거하고 광학적인 공간 분해능의 한계를 해결할 수 있는 DNA 서열 분석 방법을 제공하고자 한다. 본 발명의 일 측면에 따른 나노 소자 칩 및 DNA 염기서열 분석 방법을 사용하는 경우, 첫째, 실시간으로 높은 공간분해능을 가지는 광학적 신호를 검출하여 고감도, 고효율 및 저잡음의 검출을 실현할 수 있고, 둘째, DNA를 일시적으로 고정시키고 일렬로 펼칠 수 있는 나노채널을 집적시켜 나노 소자 칩으로 구현함으로써 검출 속도를 조절할 수 있고 PCR 비용을 줄일 수 있다. 셋쩨, 복수 개의 PNA와 형광 표지 및 FRET 방법을 사용하여 PNA 결합 오차를 검출하여 제거할 수 있고, 파장의 편이(shift)를 증가시켜 정교하고 값비싼 광학 필터를 사용하지 않을 수 있다. 또한, 복수 개의 나노채널이 집적되어 있는 나노 소자 칩, 다채널 레이저 및 광학 시스템을 통하여 염기서열 분석을 자동화하여, 개인 지놈(genome) 지도 작성, 맞춤 의학 및 치료에 기여할 수 있다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

다증 PNA를 이용하는 DNA서열 분석 방법 및 장치

【기술분야】

<ι> 본 발명은 다중 PNA를 이용하는 DNA 서열 분석 방법 및 장치에 관한 것이 다.

【배경기술】

<2> 현재 가장 보편화되어 있는 DNA 염기서열 분석 방법은 생거방법 (Sanger

Method)를 기본으로 하고 있다. 생거방법은 디데옥시뉴클레오타이드 (dideoxynucleotide, ddNTP)를 이용하여 폴리머라제 (polymerase)의 이중 나선구조 를 형성하는 반응을 종결시켜고, 생성된 이중 나선형의 DNA를 겔 전기영동법 (gel electrophoresis)에 의해 분리하여 특정 디데옥시뉴클레오타이드가 각각 해당하는 염기서열에 나타나는 것을 분석하는 방법이다. 참고로 디데옥시뉴클레오타이드는 3'에 해당하는 탄소에 수산화기 (0H)가 아닌 수소기 (H)가 붙어 있는 뉴클레오타이드 구조를 가지고 있어 이후의 중합반웅을 차단하는 구조로 되어 있다. 기존에 나와 있는 생거방법들을 바탕으로 하는 염기서열 분석 방법의 경우, 신뢰성 있는 결과를 가져오는 장점이 있지만， 시간과 돈이 많이 소요되는 문제점을 가지고 있다. 또한 단일 염기 변화 (단일 뉴클레오타이드 다형성, single nucleotide polymorphism, SNP)를 검출하는데 여러 번의 PCR(Polymerase Chain React ion)과 생거방법을 반복 해야하므로 비효율적이다.

<3> 다른 염기서열 분석 방법에는 형광 염료를 붙인 ddNTP를 통하여 광학적으로 검출하는 대신 비오틴을 붙인 ddNTP를 이용하여 전기영동 대신 질량 분광법 (mass spectrometry)을 이용하는 방법, 헬리카제 (hel icase)를 이용한 PCR-직접 시¾성 (PCT-direct sequencing), DNA를 합성할 때 나오는 ppi를 탐지하는 파이로시¾싱 (Pyrosequencing), 여러 DNA 분자를 합성할 때 형광염료가 붙은 dNTP를 사용하는 벌크 형광 DNA 시¾싱—합성 (bulk-fluorescence DNA sequencing一 by_synthesis) , 하 나의 DNA분자를 합성할 때 형광염료가 붙은 dNTP를 사용하는 단일 -분자 DNA 시퀀 싱, DNA 분자를 무작위로 자른 다음 각각을 특정단편들과 흔성화 (hybridization) 하여 서열을 알아내고 컴퓨터로 수없이 중복하는 서열들을 하나로 연결하는 혼성화 에 의한 시퀀싱 (sequencing by hybridization), DNA 분자에 특정 단편을 붙였다 떼 었다 하면서 서열을 알아내는 단계별 효소 결합-절단을 이용하는 대량 평행 시뭔싱 (massively parallel sequencing with stepwise enzymatic ligation and cleavage) 등 여러 가지 방법이 존재하지만 각각 형광을 가지는 NTP를 이용한 합성을 기본으 로 하고 있기 때문에 긴 서열을 확인할수 없는 단점을 가지고 있다.

또 다른 방법의 염기서열 분석 방법에는 두 수용액 가운데 있는 지질막에 극 히 작은 통로 (nanopore)을 설치하고 그 사이로 DNA 분자를 통과시켜 서열을 알아내 는 나노포어 (nanopore) DNA 시퀀싱 , DNA 분자를 특정단편을 가지는 DNA 서열과 흔 성화 후 나노포어에 통과하여 서열을 알아내는 흔성화 -도움 나노포어 시뭔싱 (Hybridization-assisted Nanopore Sequencing, HANS) 방법 등 긴 서열을 분석하려 는 시도가 있으나, 이러한 방법의 경우 전기적으로 신호를 검출하므로 검출한계가 생거방법 등의 방법올 이용해서 형광을통해 검출하는 것보다 낮다.

광학 기술은 가장 감지도가높은 기술로 알려져 있으며, 단일광자 검출기 등 의 기술의 발달로 형광측정을 통한 단일 분자 검출이 가능하게 되었다. 그러나 단 일 분자에서 발생되는 광 신호의 세기가 지극히 미약하고, 주변에서 발생하는 광량 에 의한 잡음, 신호처리 시 잡음 둥으로 인해 측정 효율을 높이는데 한계가 있다. 상기 기술한 형광분자들을 이용해서 검출하는 염기서열 분석 방법의 경우, DNA를 중합반응을 시키기 위해 다량의 형광염료를 검출하는 시료에 집어넣으므로 검출하 고자 하는 纖 시료와 중합하지 않은 형광분자들은 분석하고자 하는 신호를 방해하 는 잡음신호로 존재하게 된다. 이런 잡음신호를 처리하기 위해 세척과정을 진행하 지만 시료 내에 불특정하게 표면에 결합하는 형광분자들도 존재하여 잡음신호를 발 생시키는 문제점을 완전히 제거할수 없다.

또 다른 문제점으로는 DNA에 형광분자를 붙이는 과정에서 오차가 발생할 수 있다. 검출하고자 하는 염기서열에 형광분자가 100%붙는 것이 아니기 때문에 이렇 게 발생하는 오차가 기존의 방식에서는 검출 오차로 발생하게 된다. 그리고 형광분 자가 달려 있는 dNTP 등 DNA 구조를 프로브로 사용하는 경우에는 DNA 프로브 자체 가 핵산분해효소 (nuclease) 등에 대한 생물학적 및 화학적 안정성이 매우 낮은 관 계로 안정성이 낮아 보존 기간에 따라 DNA가 변질되거나 반웅력이 떨어질 수 있는 문제점이 있다.

긴 DNA를 분석하여 검출 속도를 높이고 또한 검출한계를 높일 수 있는 형광 분석을 가능하게 하는 방법으로 광학 DNA 맵핑 (optical DNA mapping) 기술이 대두 되고 있다. 광학 DNA 맵핑의 경우 뭉쳐져 있는 DNA의 펼쳐진 정도에 따라 광학적 검출 한계가 달라지므로 DNA를 잘 펼칠 수 있는 기술이 중요하다. 현재 연구되고 있는 광학 DNA 맵핑은 크게 두 가지 방법으로 나누어진다. 첫 번째 방법은 분자 빗 기술 (molecular combing technique)을 통해 펼쳐진 DNA를 고정시킨 후 그 위에 형 광 물질을 원하는 염기서열에 염색하여 광학적인 방법으로 검출하는 것이다. 이 방 법의 경우, 여러 가지 형광을 동시에 사용하여 읽을 수 있는 것은 장점이나 DNA를 원래 길이의 약 70%까지 밖에 펼칠 수 없으며， DNA 위치를 원하는 곳에 고정할 수 없어서 자동화가 불가능하다. 두 번째 방법은 미세채널 앞에서 여러 기계적인 구조 를 통해 형광 물질을 붙인 DNA를 펼친 후 한 가닥씩 미세채널로 통과시켜 레이저 및 광학 검출기를 통하여 형광 물질 존재 여부 및 속도를 측정하여 염기서열을 분 석하는 것이다. 이 방법의 경우， 한쪽이 고정이 되어있지 않아 DNA를 100% 펼칠 수 없으므로 검출한계를 제한적으로밖에 높일 수 없고， DNA 가닥 끝은 뭉쳐있으므로 검출이 블가능하다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 일 측면은 DNA를 전기적으로 고정시키고 완전히 펼친 상태에서 표 지체로부터 방출되는 파장을 검출함으로써 광학적인 한계를 보완하여 높은 정밀도 를 갖는 DNA서열분석 방법 및 상기 방법올 자동화할 수 있는 나노 소자 칩을 제공 하고자 한다.

본 발명의 또다른 측면은 상이한 파장을 방출하는 표지체 (label)로 표지된 복수 개의 PNA (peptide nucleic acid)를 서열 분석 대상 DNA에 상보적 결합시켜 결합 오차를 제거하고 광학적인 공간 분해능의 한계를 해결할 수 있는 DNA 서열 분 석 방법을 제공하고자 한다.

【기술적 해결방법】

본 발명의 일측면은 마이크로채널 Onicrochannel)로 연결된 두 개의 DNA시료 저장부 (reservoir)를 포함하는 유닛 두 개; 및 각 유닛의 마이크로채널을 연결하는 복수 개의 나노채널 (nanochannel)을 포함하고， 상기 나노채널의 단면은 사다리꼴이 고, 상기 나노채널은 나노채널을 따라 블연속적으로 존재하는 나노흔 (nanohorn) 구 조를 포함하고, 상기 나노흔 구조는 상기 사다리꼴의 양쪽 윗 모서리가 돌출된 형 태인 것을 특징으로 하는 나노 소자 칩 (nanodevice chip)을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 상기 나노 소자 칩을 이용하는 DNA 서열분석 방법으 로서, 하나의 유닛에서 하나의 DNA 시료 저장부에 서열분석대상 DNA 시료를 로딩하 는 단계 ; 상기 DNA 시료 저장부로부터 상기 유닛의 다른 DNA 시료 저장부 방향으로 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하여 상기 유닛의 마이크로채널을 통하여 DNA 시료를 이동시키는 단계 ; 상기 유닛으로부터 다른 유닛 방향으로 나노채널과 평행하게 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하여 DNA시료를 마이크로채널로부터 나노채널 내로 이동 시키는 단계; 및 상기 나노채널과 평행하게 20 kV/m 초과하는 전기장을 인가하여 나노채널 내 DNA의 일 말단은 나노흔 구조에 고정되고 다른 말단은 나노채널 내에 서 이동하여 DNA가 펼쳐지도록 하는 단계를 포함하는 DNA 서열 분석방법을 제공한 다.

<12> 본 발명의 또다른 측면은 DNA서열 분석 방법으로서， 상이한 파장을 방출하 는 표지체 (label)로 표지된 복수 개의 PNA (peptide nucleic acid)를 서열 분석 대 상 DNA에 상보적 결합시키는 단계; 상기 DNA를 나노흔 (nanohorn)구조를 포함하는 나노채널 (nanochannel) 내로 이동시키는 단계; 상기 나노채널에 20 kV/m 초과하는 전기장을 인가하여 나노채널 내 DNA의 일 말단은 나노혼 구조에 고정되고 다른 말 단은 나노채널 내에서 이동하여 DNA가 펼쳐지도록 하는 단계; 및 상기 DNA에 상보 적 결합된 복수 개의 PNA에 표지된 표지체로부터 방출되는 파장을 검출하는 단계를 포함하는 DNA서열 분석방법을 제공한다.

【유리한효과】

<13> 본 발명의 일 측면에 따른 나노 소자 칩 및 DNA 염기서열 분석 방법을 사용 하는 경우，

<14> 첫째， 실시간으로 높은 공간분해능을 가지는 광학적 신호를 검출하여 고감 도, 고효율 및 저잡음의 검출을 실현할수 있고，

<15> 둘째， DNA를 일시적으로 고정시키고 일렬로 펼칠 수 있는 나노채널을 집적시 켜 나노 소자 칩으로 구현함으로써 검출 속도를 조절할 수 있고 PCR 비용을 줄일 수 있다.

<16> 셋째， 복수 개의 PNA와 형광 표지 및 FRET 방법을사용하여 PNA 결합오차를 검출하여 제거할 수 있고, 파장의 편이 (shift)를 증가시켜 정교하고 값비싼 광학 필터를 사용하지 않올 수 있다.

<17> 또한， 복수 개의 나노채널이 집적되어 있는 나노소자 칩， 다채널 레이저 및 광학 시스템을 통하여 염기서열 분석을 자동화하여, 개인 지놈 (genome) 지도 작성, 맞춤 의학 및 치료에 기여할수 있다.

【도면의 간단한 설명】

<18> 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 나노소자 칩의 모식도이다. <I9> 도 2 중 도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라, 저장부 (reservoir)에서 마이크 로채널 (microchannel)을 통해 나노채널 (nanochanne 1 ) 입구까지 DNA 시료를 이송시 키는 과정을 나타낸 모.식도이고， 도 2b는 나노채널 (nanochanne 1)과 평행하게 전기 장을 걸어 나노채널 입구 근처까지 이송된 DNA 시료를 나노채널 (nanochanne 1) 내로 이동시켜 나노흔 (nanohorn)이 있는 위치까지 이송시키는 것올 나타낸 모식도이며， 도 2c는 나노흔 (nanohorn) 구조 까지 이송된 醒 시료에 높은 전기장을 인가하여 나노채널 (nanochanne 1) 내에서 DNA 가 고정 및 스트레칭 (stretching)된 것을 나타 낸 모식도이다.

<20> 도 3은 본 발명의 일실시예에 의한 나노 소자 칩이 제조되는 과정을 나타내 는 모식도이다.

<21> 도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 나노채널의 단면을 나타낸 사진이 다.

<22> 도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 상이한 파장올 방출하는 표지체 (label)로 표지된 복수 개의 PNA (peptide nucleic acid)를 서열 분석 대상 DNA에 상보적 결 합시켜 스트레칭 (stretching)된 DNA 서열을 검출하는 방법을 나타낸 개념도로서， 도 5a는 분석 대상 염기서열들의 간격이 광학적 분해능 이상의 거리에 있을 경우이 고， 도 5b는 두 분석대상 염기서열 간의 간격이 광학적 분해능 이하의 거리일 경우 이다.

<23> 도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 형광 표지가 부착된 단일 가닥 PNA를 분 석 대상 DNA에 증합 (polymerization)시키는 모식도이다.

<24> 도 ₇은 본 발명의 일실시예에 따라 동일한 염기서열을 가지는 PNA를 링커

(linker)를 통해 연결한 이중 가닥 PNA를 분석 대상 DNA에 중합시키는 모식도이고, 도 7a는 하나의 가닥 말단만 표지체로 표지된 경우，도 7b는 양 가닥 말단 모두 동 일한 표지체로 표지된 경우이다.

<25> 도 8은 본 발명의 일실시예에 따라, 링커 (linker)로 연결된 이중 가닥 PNA에

FRET(Fluorescence Resonant Energy Transfer) 도너 (donor) 형광 표지 및 억셉터 (acceptor) 형광 표지를 부착시켜 염기서열을 검출하는 방법올 나타낸 모식도이다. 도 8a는 PNA의 서열이 분석 대상 DNA 염기서열과 완벽하게 상보적 결합한 경우, 도 8b는 PNA의 서열이 분석 대상 DNA 염기서열과 완벽하게 상보적 결합하지 못한 경우 이다.

<26> 도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 나노 소자 칩에 DNA 시료를 로딩하고 전 기장을 인가하는 과정을 나타내는 모식도이다.

<27> 도 10은 본 발명의 실시예에서, 인가된 전기장의 세기에 따른 DNA 연장 정도 를 나타내는 그림 및 사진이다.

<28>

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

<29> 본 발명의 일 측면은 마이크로채널 (microchannel)로 연결된 두 개의 DNA 시 료 저장부 (reservoir)를 포함하는 유닛 두 개; 및 각 유닛의 마이크로채널을 연결 하는 복수 개의 나노채널 (nanochannel)을 포함하고, 상기 나노채널의 단면은 사다 리꼴이고， 상기 나노채널은 나노채널을 따라 블연속적으로 존재하는 나노흔 (nanohorn) 구조를 포함하고， 상기 나노흔 구조는 상기 사다리꼴의 양쪽 윗 모서리 가돌출된 형태인 것을 특징으로 하는 나노소자 칩 (nanodevice chip)을 제공한다.

<30> 본 명세서에서， 마이크로채널은 채널 단면의 가로 및 세로, 또는 직경이 1醒 미만인 채널을 의미하며， 나노채널은 채널 단면의 가로 및 세로가 Ιμιη 미만인 채 널을 의미한다.

<31> 본 발명의 다른 측면은 상기 나노 소자 칩을 이용하는 DNA 서열분석 방법올 제공한다. 구체적으로 , 하나의 유닛에서 하나의 DNA 시료 저장부에 서열분석대상 DNA 시료를 로딩하는 단계 ; 상기 DNA 시료 저장부로부터 상기 유닛의 다른 DNA 시 료 저장부 방향으로 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하여 상기 유닛의 마이크로채널 을 통하여 DNA 시료를 이동시키는 단계 ; 상기 유닛으로부터 다른 유닛 방향으로 나 노채널과 평행하게 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하여 DNA시료를 마이크로채널로부 터 나노채널 내로 이동시키는 단계; 및 상기 나노채널과 평행하게 20 kV/m 초과하 는 전기장을 인가하여 나노채널 내 DNA의 일 말단은 나노흔 구조에 고정되고 다른 말단은 나노채널 내에서 이동하여 DNA가 펼쳐지도록 하는 단계를 포함한다.

<32> 도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 나노 소자 칩의 모식도이다. 상기 나노 소자 칩의 구성은 크게 3 부분을 포함한다. 표지된 PNA가 상보적 결합되어 있는 분 석대상 DNA 시료를 로딩 (loading) 하는 DNA 시료 저장부 (reservoir ) , 상기 DNA 시 료를 상기 저장부로부터 나노채널 입구로 이송시키기 위한 통로 역할을 하는 마이 크로채널 (microchannel) 및 DNA 시료를 전기적으로 고정시키고 펼쳐서 (stretching) 상기 DNA에 상보적으로 결합된 PNA의 표지로부터 방출되는 파장을 검출할 수 있는 나노채널 (nanochannel)을 포함한다. 용량이 매우 큰 저장부 (reservoir )를 바로 나 노채널 (nanochannel)과 연결하는 경우 분석대상 DNA 시료를 포함하는 버퍼가 나노 채널로 들어갈 수 있는 확률이 낮다. 따라서， 저장부와 나노채널을 마이크로채널과 연결하여， 상기 마이크로채널이 저장부로부터 나노채널 입구로 DNA 시료를 이송시 키기 위한 통로 역할을 하게 함으로써， DNA 시료 저장부로부터 DNA 시료가 나노채 널로 들어갈 수 있는 확률을 높일 수 있다.

<33> 본 발명의 일실시예에서， DNA는 포스페이트 (phosphate)를 포함하고 포스페이 트에 있는 옥사이드 (oxide) 기가 음전하를 띠고 있으므로 전기장 내에서 이동이 가 능하다. 이러한 원리를 이용하여， 하나의 유닛에서 하나의 DNA 시료 저장부에 서열 분석대상 DNA 시료를 로딩한 후， 상기 DNA 시료 저장부로부터 상기 유닛의 다른 DNA 시료 저장부 방향으로 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하면， DNA 시료가 저장부 로부터 상기 유닛의 마이크로채널을 통하여 흐르게 된다. DNA 시료가 마이크로채널 을 통하여 나노채널 입구까지 이송되면, 상기 DNA 시료가 로딩되었던 유닛으로부터 다른 유닛 방향으로 나노채널과 평행하게 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하여， DNA 시료를 마이크로채널로부터 나노채널 내로 이동시킬 수 있다.

<34> 긴 DNA는 수퍼코일링 (supercoiling)이 된 상태로 자연계에 존재한다. 예를 들어 λ-DNA의 경우， 48.5kbp를 가지고 있으므로 펼쳐졌을 때의 총 길이는 16.5μπι 이지만 보통 상태에서는 0.8~1μπι의 실타래처럼 뭉쳐져서 존재한다. 이러한 실타래 형태의 DNA를 나노채널 (nanocha皿 el) 내로 이동시키면 공간적인 제한효과 (confinement effect)에 의해서 어느 정도 펼쳐지게 된다. 그러나 공간적인 제한효 과에 의해서 펼쳐질 수 있는 정도는 나노채널 (nanochannel)의 폭과 높이에 의해서 결정이 되고， 현재의 기술로 만들 수 있는 나노채널에서 DNA 를 펼칠 수 있는 정도 는 최대 약 80% 정도이다. 본 발명의 일실시예에서 약 400nm X 400nm 급의 나노채 널을 이용한 경우 약 20% 까지 펼쳐졌다.

<35> 본 발명의 일실시예에서， 20 kV/m 미만의 전기장으로 DNA의 이동 속도를 조 절하여 DNA의 일 말단이 나노흔 (nanohorn) 구조 위치에 올 때까지 이송한 후， 나노 채널과 평행하게 20 kV/m 초과의 전기장을 인가하면， 나노흔 (nanohorn) 구조에 의 한 국부적으로 전기장이 집중되어 유전 전기영동 힘 (dielectrophoresis force, DEP force)이 발생하고， 유전 전기영동 힘에 의하여， DNA의 일 말단이 나노흔 구조에 일시적으로 고정된다. 동시에, 전기장에 의한 정전기력에 인하여， 음전하를 띠는 DNA의 다른 말단은 계속 나노채널 내에서 흐르려고 하고 그 결과 DNA가 펼쳐지게 된다. 본 발명의 일 측면에 따른 방법을 사용하여 DNA가 펼쳐지면 DNA에 상보적으 로 결합되어 있는 PNA 의 표지가 서로 겹쳐지지 않아 결국 광학적인 분해능을 최대 로 증가시켜 정확하게 DNA서열을 분석할 수 있다.

<36> 도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라， 저장부 (reservoir)에서 마이크로채널

(microchannel)을 통해 나노채널 (nanochannel ) 입구까지 DNA 시료를 이송시키는 과 정을 나타낸 모식도이고， 도 2b는 나노채널 (nanochannel)과 평행하게 전기장을 걸 어 나노채널 입구 근처까지 이송된 DNA 시료를 나노채널 (nanochannel) 내로 이동시 켜 나노흔 (nanohorn)이 있는 위치까지 이송시키는 것을 나타낸 모식도이며, 도 2c 는 나노흔 (nanohorn) 구조 까지 이송된 DNA 시료에 높은 전기장을 인가하여 나노채 널 (nanochannel) 내에서 DNA 가 고정 및 스트레칭 (stretching)된 것을 나타낸 모식 도이다.

<37> 본 발명의 일실시예에서 , 상기 나노 소자 칩은 공지된 실리콘 처리 프로세스 및 양극접합 (anodic bonding) 방법을 이용하여 실리콘 기판 상에서 제조될 수 있 다. 양극접합은 기판의 이온 전도성으로부터 발생하는 큰 정전기력을 사용하여 유 리 기판 위에 전도체나 반도체를 고착시키는 기술이다. 도 3은 본 발명의 일실시예 에 의한 나노 소자 칩이 제조되는 과정을 나타내는 모식도이다.

<38> 본 발명의 일실시예에서 , 먼저 표준 전자 빔 리소그라피 기술을 이용하여 40 개의 평행한 나노채널을 실리콘 웨이퍼 상에 패터닝하고 반응성 이온 에칭

(reactive ion etching, RIE)으로 에칭한다. 전자 빔 레지스트 (resist)를 제거한 후, 표준 광 리소그라피 기술 및 RIE 프로세스를 이용하여 두 개의 마이크로채널을 제조한다. 그 후 광 리소그라피 기술 및 DRIE (deep reactive ion etching) 프로세 스를 이용하여 네 개의 저장부를 제조한다. 그 후 유리 웨이퍼로 양극접합하여 본 발명의 일실시예에 의한 나노 소자 칩을 제조할 수 있다. 상기 나노채널은 Si¾ 로 이루어질 수 있다.

<39> 본 발명의 일실시예에 따른 나노채널은 단면이 사다리꼴이고， 윗변이

100~500nm, 아랫변이 100~500nm, 높이가 100~500nm 일 수 있고, 윗변이 450nm, 아 랫변이 SOOnnu 높이가 400nm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 나노흔은 5~30nm의 깊이일 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 나노흔 대비 나노채널 단 면 크기가 일정 수준 미만이면 나노흔에서의 전기장 변화가 미미해질 수 있다. 각 나노채널은 500nm ~ 무한대 간격으로 배열될 수 있고, 무한대 간격으로 배열된다는 것은 나노채널이 하나 존재하는 것과 같은 효과를 나타낸다. 나노채널의 간격이 500nm 미만이면 본딩 (bonding)시 문제가 될 수 있다.

<40> 본 발명의 일실시예에서， 나노혼 (nanohorn) 구조는 나노채널을 따라 블연속 적으로 존재하고， 나노채널 단면에서 보았을 때, 사다리꼴의 양쪽 윗 모서리가 돌 출된 형태이다. 이러한 나노흔 구조는 상기 양극접합 프로세스시 높은 접합 온도 및 압력에 의하여 생성될 수 있다. 접합 온도가 40CTC이고， 이는 유리전이온도인

560°C에 가까우므로， 상부 내열 유리 (Pyrex)가 접합 압력 (1 gi/cm ) 하에서 약 30nm 쳐질 수 있기 때문이다. 도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 나노채널 의 단면을 나타낸다.

<41> 본 발명의 일실시예에서 , 나노채널과 평행하게 20 kV/m 초과의 전기장을 인 가하면, 나노흔 (nanohorn) 구조에 의한 국부적으로 전기장이 집중되어 유전 전기영 동 힘 (dielectrophoresis force, DEP force)이 발생하고， 유전 전기영동 힘에 의하 여, DNA의 일 말단이 나노흔 구조에 일시적으로 고정된다. 동시에， 전기장에 의한 정전기적 인력에 인하여， 음전하를 띠는 DNA의 다른 말단은 계속 나노채널 내에서 흐르려고 하고 그 결과 DNA가 펼쳐지게 된다.

<42> 전기장을 제거하면， DNA가 다시 뭉쳐질 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 나노채널의 공간적인 제한 효과 때문에, 전기장을 제거하여도, DNA가 다시 뭉쳐지 는데까지 걸리는 시간 (relaxation time)이 마이크로채널 또는 빈 공간에 비하여 길 어진다. 본 발명의 일실시예에서는, 20kV/m 전기장 인가 후 전기장을 제거하였을 때， DNA가 다시 뭉쳐지는데까지 걸리는 시간이 10초로 측정되었다.

<43> 유전 전기영동 힘은 하전된 분자로 하여금 "음 (negative)의 유전영동"상태에 있는 장소에 갇히도록 한다. 낮은 전기장에서는 유도된 유전 전기영동 힘이 전기영 동힘보다 작기 때문에 DNA 가 이동하게 되지만, 임계 전기장 세기를 넘으면, DNA 는 나노흔을 벗어나지 못하고 고정되는 것이다.

<44> 본 발명의 또 다른 측면을 통하여， 상이한 파장을 방출하는 표지체 (label)로 표지된 복수 개의 PNA (peptide nucleic acid)를 서열 분석 대상 DNA에 상보적 결 합시키는 단계; 상기 DNA를 나노흔 (nanohorn)구조를 포함하는 나노채널 (nanochannel) 내로 이동시키는 단계; 상기 나노채널에 20 kV/m 초과하는 전기장을 인가하여 나노채널 내 DNA의 일 말단은 나노혼 구조에 고정되고 다른 말단은 나노 채널 내에서 이동하여 DNA가 펼쳐지도록 하는 단계; 및 상기 DNA에 상보적 결합된 복수 개의 PNA에 표지된 표지체로부터 방출되는 파장올 검출하는 단계를 포함하는 DNA서열 분석방법이 제공된다.

<45> 본 발명의 일 측면에 따른 DNA 서열 분석 방법은， 전장 DNA 서열 정보를 알 고 있고， 개인간 서열 차이를 탐지하기 위하여 사용될 수 있다. <46> PNACpeptide nucleic acid)는 DNA의 포스포다이에스터 (phosphodiester) 결합 이 펩타이드 결합 (peptide bond)으로 대체되어 있고， DNA와 같은 아데닌， 티민, 구 아닌과 시토신을 가지고 있어 염기 특이적으로 DNA와 흔성화 반응 또는 중합이 될 수 있다. DNA들의 중합으로 구성된 프로브의 경우 생물학적 및 화학적 안정성이 매 우 낮고 보존 기간에 따라 DNA의 변질 및 반응력 저하의 문제점이 있으나， PNACpeptide nucleic acid)는 DNA의 포스포다이에스터 (phosphodiester) 결합이 펩 타이드 결합 (peptide bond)으로 대체되어 있어 안정성이 높고, 펩타이드 결합으로 변화된 기본골격 (backbone)의 구조적 차이로 인하여 DNA의 포스페이트 골격의 음이 온성이 중성 성질로 바뀌므로， 정전기적 반발력이 제거되어 중합시 그 결합력이 높 다. 또한， 위와 같은 이유로 중합 반응속도가 빠를 뿐만 아니라 특이도도 매우 높 아 S/N 비율 (signal to noise ratio)이 향상되고 생물학적 화학적 안정성이 높다. PNA는 이증나선형의 DNA에 2가지 방법으로 결합할 수 있는데, 하나는 DNA 이중 나 선형 구조 사이에 삽입되는 왓슨 -크릭 수소 결합 (Wat son-Crick hydrogen bonds) 방 법이고, 다른 하나는 DNA 이증 나선형 구조 옆에 결합되는 후그스틴 수소 결합 (Hoogsteen hydrogen bonds)방법이다.

<47> . 본 발명의 일실시예에서， 복수 개의 PNA는 2 가지 파장을 방출하는 표지체로 표지되고, 상기 표지체 증 한 종류의 표지체는 하나 이상의 분석 대상 염기서열에 상보적 결합하는 PNA 에 표지되고， 다른 한 종류의 표지체는 상기 분석 대상 염기 서열의 전후에 상보적으로 결합하는 PNA에 표지될 수 있다. 도 5는 본 발명의 일실 시예에 의하여 펼쳐진 DNA 상에서， 상보적 결합되어 있는 복수 개의 PNA를 검출하 는 방법을 나타내는 개념도이다. 상기 실시예에서， DNA의 분석 대상 염기서열에 상 보적 결합하는 PNA 는 빨간색 형광표지체 (도 5에서 속이 빈 원으로 표시)로 표지되 고, 이 빨간색 형광으로 표지된 PNA의 결합오차를 분석하기 위해， 즉 비특이적 결 합을 판별하기 위해， 분석 대상 염기서열의 앞과 뒤 서열에 상보적 결합하는 PNA를 파란색 형광 표지체 (도 5에서 속이 찬 원으로 표시)로 표지하였다.

<48> 본 발명의 실시예에서， 분석 대상 염기서열들의 간격이 광학적 분해능 (약

400nm) 이상의 거리에 있을 경우에는 (도 5a)， 상기 방법에 따라 2가지 상이한 파장 (빨간색 및 파란색)을 가지는 형광 표지로 표지된 3개의 PNA (즉， 분석 대상 염기서 열에 상보적 결합하는 PNA 는 빨간색 형광표지체로 표지， 분석 대상 염기서열의 앞 과 뒤 서열에 상보적 결합하는 PNA는 파란색 형광 표지체로 표지)를 세트로 분석 대상 염기서열마다 결합시켜 이것을 2중 레이저 채널 또는 2가지 레이저 채널 (laser channel)을 통하여 검출함으로써， 분석 대상 염기서열들의 간격을 확인할 수 있다.

<49> 본 발명의 실시예에서， 두 분석대상 염기서열 간의 간격이 광학적 분해능 이 하의 거리일 경우 (도 5b), 상기 복수 개의 PNA는 4 가지 파장을 방출하는 표지체로 표지되고， 상기 표지체 증 제 1 표지체는 제 1 분석대상 염기서열에 상보적 결합하는 PNA 에 표지 ; 제 2 표지체는 제 2 분석대상 염기서열에 상보적 결합하는 PNA 에 표 지; 제 3 표지체는 제 1 분석대상 염기서열과는 광학적 분해능 이하의 거리에 있고 제 2 분석대상 염기서열과는 광학적 분해능 이상의 거리에 있는 제 3 염기서열에 상 보적 결합하는 PNA에 표지 ; 및 제 4 표지체는 제 1 내지 제 3 염기서열의 전후에 각각 상보적으로 결합하는 PNA에 표지될 수 있다.

<50> 분석 대상 염기서열, 즉 위치 A와 위치 B가 광학적 분해능 이하의 거리에 있을 경우, 위치 A가 노란색 형광표지가 되어 있는 상태이고 위치 B가 빨간색 형광 표지가 되어 있는 상태이면, 광학적인 분해능 이하이므로 두 색의 위치가 파악되지 않고 색이 흔합되어서 나오는 현상이 생기게 된다. 이 경우， 위치 A와 최소 광학적 분해능을 가지는 거리에 있는 위치 C를 녹색 형광표지하면 위치 A와 위치 C의 색의 경우는 흔합이 되지 않고, 위치 B와 위치 C의 경우 광학적 분해능 이하의 거리이므 로 파장이 흔합되는 것으로 나타날 수 있다. 따라서 , 위치 A와 위치 B가 위치 C로 부터 어느 순서로 떨어져 있는지를 분석할 수 있다.

<5i> 구체적으로, (a) 분석 대상 염기서열 위치 A와 위치 B에 각각 노란색 형광 표지체 (도 5에서 가로줄무늬 원으로 표시) 및 빨간색 형광 표지체 (도 5에서 속이 빈 원으로 표시)로 표지된 PNA를 상보적 결합하는 단계 ; (b) 위치 A와 B 각각의 앞 뒤에 파란색 형광 표지체 (도 5에서 속이 찬 원으로 표시)로 표지된 PNA를 상보적 결합함으로써 위치 A와 B 에 결합된 PNA의 결합 오차를 검증하는 단계; (c) 위치 B 와는 광학적 분해능 이하의 거리에 있으며 위치 A와는 최소한의 광학적 분해능 거 리에 있는 위치 C에 녹색 형광 표지체 (도 5에서 세로줄무늬 원으로 표시)로 표지된 PNA를 상보적 결합하는 단계; (d) 위치 C의 앞뒤에 파란색 형광 표지체 (도 5에서 속이 찬 원으로 표시)로 표지된 PNA를 상보적 결합함으로써 위치 C에 결합된 PNA의 결합 오차를 검증하는 단계를 포함할 수 있다. 사용하는 파장이 4가지이므로 4중 레이저 채널 (laser channel) 을 사용하여 검출할 수 있다.

<52> 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지체는 형광 표지체， 발광 표지체, 화 학발광 (chemi luminescent) 표지체 , FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 표지체, 양자점 (quantum dot) 표지체 또는 금속 표지체일 수 있고, 형광 표지체로 는 Cy-5, Cy-3, Alexa 647， Alexa 488， T0T0 둥을 포함하는 유기 형광 표지， 비오 틴 -결합물질, 테트라메틸로다민 (TMR), 테트라메틸로다민 이소시아네이트 (TMRITC), X-로다민 및 텍사스 레드 등을 사용할 수 있다.

<53> 본 발명의 일실시예에서, ΡΝΑ는 4개 이상의 염기서열을 포함할 수 있고, 또 한 4-9개의 염기서열을 포함할 수 있다. 4개 염기서열보다 작으면 비특이적 결합 가능성이 높아지기 때문이다. 9개 염기서열보다 크면 ΡΝΑ 합성이 매우 어려워지고 제작비용이 높아지나 이에 한정되는 것은 아니다.

<54> 본 발명의 일실시예에서， ΡΝΑ는 단일 가닥이거나， 동일한 염기서열을 가지는

ΡΝΑ가 링커 (linker)를 통해 연결된 이중 가닥일 수 있다. PNA 단일 가닥으로도 층 분한 결합력을 가지고 있으나 이중 가닥인 경우 결합 오차를 더욱 줄일 수 있다.

<55> 본 발명의 일실시예에서， 단일 가닥인 경우， 예를 들어， 도 6에 도시된 바와 같이， 7개의 염기서열 (TCCmr)로 구성되고 말단에 형광표지가 부착된 PNA가 이중 나선구조의 DNA의 7개 염기서열 (AGGMM)에 후그스틴 수소 결합 (Hoogsteen hydrogen bonds)방법으로 결합될 수 있다.

<56> 본 발명의 일실시예에서， 동일한 염기서열을 가지는 PNA가 링커 (linker)를 통해 연결된 이증 가닥일 경우， 분석 대상 이중 나선 구조의 DNA에 후그스틴 수소 결합과 왓슨 -크릭 수소 결합을 동시에 이용하여 결합오차를 줄일 수 있다. 하나의 가닥 말단만 표지체로 표지되거나， 양 가닥 말단 모두 동일한 표지체로 표지될 수 있다. 예를 들어, 도 7a에 도시된 바와 같이， 7개의 염기서열 (TCCTTTT)로 구성되고 말단에 형광 표지가 부착된 PNA와 7개 염기서열이 동일한 PNA 한 개를 링커 (linker)로 결합시킨 후 분석 대상 DNA에 결합할 수 있고， 도 7b에 도시된 바와 같 이 , 양 PNA 가닥 말단 모두에 형광 표지를 부착하여 검출할 수 있는 광량를 2배로 증가시킬 수 있다.

<57> 본 발명의 또다른 실시예에서， 동일한 염기서열을 가지는 PNA가 링커

(linker)를 통해 연결된 이중 가닥 PNA에 있어서， 하나의 가닥 말단이 FRET(F 1 uor escence resonance energy transfer) 도너 (donor) 표지체로 표지되고, 다른 하나의 가닥 말단이 FRET(F1 uor escence resonance energy transfer) 억셉터 (acceptor) 표지체로 표지될 수 있다. FRET이란 형광물질인 도너 (donor)가 빛에너 지를 흡수하여 여기 (excitation)되면 형광으로 방출하는 대신, 수 nm 이내에 근접해 있는 억셉터 (acceptor)에 공명현상을 통해 비 복사 에너지 (non— radiat ive energy) 가 전달됨으로써 억셉터 (acceptor)의 장파장 형광이 방출 (emission)되는 원리이다. 즉, 도너와 억셉터의 거리가 수 nm 이내에 근접해야 장파장 형광을 검출할 수 있다.

<58> 도 8a에 도시된 바와 같이， 예를 들어, 7개의 염기서열 (TCCTTTT)로 구성되고 말단에 도너 (donor) 형광 표지를 부착한 PNA와， 동일한 염기서열을 가지고 말단에 억셉터 (acceptor) 형광 표지를 부착한 PNA를 링커 (linker)로 연결하고, 분석 대상 DNA 염기서열에 증합시킨 후， 도너에 단파장의 빛에너지로 조사하여 여기시키면, PNA의 서열이 분석 대상 DNA 염기서열과 완벽하게 상보적 결합한 경우에는 도너와 억셉터의 거리가 수 nm 이내로 배치되어 도너로부터 억셉터로 에너지가 전달되어 장파장의 형광이 방출되고 이를 검출할 수 있다. 도 8b의 경우와 같이, 예를 들어, 분석 대상 DNA의 염기서열 증 SNP(single nucleotide polymorphism) 가 존재하여， PNA의 7개 염기서열 (TCCTTTT)과 분석 대상 DNA의 염기서열이 완벽하게 상보적 결합 을 하지 못하면， 도너 (donor) 형광 표지와 억셉터 (acceptor) 형광 표지 거리가 멀 어져 FRET 현상이 일어나지 않으므로 장파장의 형광을 검출할 수 없다. 이러한 방 법으로 결합오차나 염기서열이 상이함을 분석할 수 있다.

<59> 본 발명의 일실시예에서， 상기 FRET 방법을 이용함으로써 파장의 편이

(shi ft)가 커지므로， 정교하고 값비싼 광학 필터를 사용하지 않아도 되는 효과가 있다.

【발명의 실시를 위한 형태】

<60> 본 발명의 실시예에서， DNA 이동 실험을 수행하였다. 도 9는 본 발명의 일실 시예에 따라 나노 소자 칩에 DNA 시료를 로딩하고 전기장을 인가하는 과정을 나타 내는 모식도이다.

<6i> 먼저， 기본 TBE 버퍼를 이용하여 나노 소자 칩의 채널들을 채운다. 상기 버 퍼는 전기삼투압 흐름 (electroosmotic flow)을 방지하기 위하여 4% (ν/ν) β—머캡 토에탄을 및 0.2% (w/v) P0P6 를 포함하는 1 X TBE 용액을 사용하였다. 상기 버퍼 의 점도는 상온 (24^°C)에서 1.02cP로 측정되었고, 상기 버퍼의 전기전도도 (conductivity)는 임피던스 분석기로부터 64.2yS/cni로 측정되었다. 상기 버퍼는 을트라소니케이터 및 진공 펌프 데시케이터를 이용하여 1시간동안 탈기되었다. 기 본 버퍼는 저장부 1 및 2에 먼저 로딩되고 이어서 맞은 편인 저장부 3 및 4에도 채 워진다. 기본 버퍼를 채운 후에는 먼저 저장부 1에 DNA 시료를 로딩한다. 저장부 1 로부터 저장부 3 방향으로 전기장을 인가하여 DNA 시료가 마이크로채널을 통하여 흐르도록 한다. 이후， 전기장의 방향을 수직으로 변경하여 나노채널과 평행하게 전 기장을 인가하여 DNA 시료가 마이크로채널로부터 나노채널로 이동하도록 한다. <62> 본 발명의 실시예에서는 0.4 내지 80kV/m 전기장을 이용하여 수행하였다.

20kV/m 미만의 전기장에서는， λ-DNA 의 평균적 이동속도가 4.51 x lO^'m vsec 였 다. 전기장의 ^'세기를 20 kV/m 초과 수치로 증가시키자, DNA 분자가 나노채널을 따 라 더 빠른 속도로 움직이다가 DNA 분자의 일 말단이 나노채널 중간에 존재하는 나 노흔구조에 고정되고 동시에 나노채널을 따라 펼쳐졌다. 상기 실시예에서, 마이크 로채널 내에서^' 수퍼코일 형태의 DNA 길이는 1.04_Um였고， 나노채널내에서 공간적인 제한효과 (confinement effect)에 의해서 펼쳐진 DNA 길이는 3.90 μπι (DNA 원길이의 20%까지 연장)였으며， 60kV/m 전기장 인가시 유전 전기영동 힘에 의하여 DNA가 나 노혼에 고정된 후 정전기력에 의하여 DNA가 펼쳐졌을 때 DNA의 길이는 17·94μπι (DNA 원길이의 92% 까지 연장)였다. 상기 DNA는 전기장 세기를 높여 DNA 원길이의 약 100% 까지 연장할 수 있다. 도 10은 인가된 전기장의 세기에 따른 DNA 연장 정 도를 나타낸다.

<63> 비록 본 발명이 상기 언급된 실시예와 관련하여 설명되었지만， 본 발명이 그러한 실시예에 한정되는 것은 아니고， 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양 한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 따라서 첨부된 특허청구의 범위는 본 발 명의 요지에서 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함할 것이다.

Claims

【청구의 범위】

【청구항 1】

마이크로채널 (microchannel)로 연결된 두 개의 DNA 시료 저장부 (reservoir ) 를 포함하는 유닛 두 개; 및

각 유닛의 마이크로채널을 연결하는 복수 개의 나노채널 (nanochannel)을 포 함하고，

상기 나노채널의 단면은 사다리꼴이고，

상기 나노채널은 나노채널을 따라 불연속적으로 존재하는 나노흔 (nanohorn) 구조를 포함하고，

상기 나노흔 구조는 상기 사다리꼴의 양쪽 윗 모서리가 돌출된 형태인 것을 특징으로 하는 나노 소자 ¾ (nanodevice chip).

【청구항 2]

제 1항에 있어서，

상기 나노채널은 Si0₂로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노 소자 칩 .

【청구항 3]

제 1항의 나노 소자 칩을 이용하는 DNA서열분석 방법으로서，

하나의 유닛에서 하나의 DNA 시료 저장부에 서열분석대상 DNA 시료를 로딩하 는 단계 ;

상기 DNA 시료 저장부로부터 상기 유닛의 다른 DNA 시료 저장부 방향으로 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하여 상기 유닛의 마이크로채널을 통하여 DNA 시료를 이 동시키는 단계 ;

상기 유닛으로부터 다른 유닛 방향으로 나노채널과 평행하게 20 kV/m 미만의 전기장을 인가하여 DNA시료를 마이크로채널로부터 나노채널 내로 이동시키는 단계; 상기 나노채널과 평행하게 20 kV/m 초과하는 전기장을 인가하여 나노채널 내 DNA의 일 말단은 나노흔 구조에 고정되고 다른 말단은 나노채널 내에서 이동하여 DNA가 펼쳐지도록 하는 단계를 포함하는 DNA서열 분석방법 .

【청구항 4]

DNA서열 분석 방법으로서，

상이한 파장을 방출하는 표지체 (label)로 표지된 복수 개의 PNA (peptide nucleic acid)를 서열 분석 대상 DNA에 상보적 결합시키는 단계; 상기 DNA를 나노흔 (nanohorn)구조를 포함하는 나노채널 (nanochannel) 내로 이동시키는 단계 ;

상기 나노채널에 20 kV/m 초과하는 전기장을 인가하여 나노채널 내 DNA의 일 말단은 나노흔 구조에 고정되고 다른 말단은 나노채널 내에서 이동하여 DNA가 펼쳐 지도록 하는 단계 ; 및

상기 DNA에 상보적 결합된 복수 개의 PNA에 표지된 표지체로부터 방출되는 파장을 검출하는 단계를 포함하는 DNA서열 분석방법 .

【청구항 5]

^' 제 4항에 있어서，

상기 나노채널의 단면은 사다리꼴이고，

나노흔 구조는 나노채널을 따라 불연속적으로 존재하고， 상기 사다리꼴의 양 쪽 윗 모서리가 돌출된 형태인 것을 특징으로 하는 DNA서열 분석방법.

【청구항 6】

제 4항에 있어서，

상기 복수 개의 PNA는 2 가지 파장을 방출하는 표지체로 표지되고， 상기 표 지체 중 한 종류의 표지체는 하나 이상의 분석 대상 염기서열에 상보적 결합하는 PNA 에 표지되고， 다른 한 종류의 표지체는 상기 분석 대상 염기서열의 전후에 상 보적으로 결합하는 PNA에 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA서열 분석방법 .

【청구항 7】

제 4항에 있어서,

두 분석대상 염기서열 간의 간격이 광학적 분해능 이하의 거리일 경우， 상기 복수 개의 PNA는 4 가지 파장을 방출하는 표지체로 표지되고， 상기 표 지체 중 제 1 표지체는 제 1 분석대상 염기서열에 상보적 결합하는 PNA 에 표지 ; 게 2 표지체는 제 2 분석대상 염기서열에 상보적 결합하는 PNA 에 표지 ; 제 3 표지체는 제 1 분석대상 염기서열과는 광학적 분해능 이하의 거리에 있고 제 2 분석대상 염기서 열과는 광학적 분해능 이상의 거리에 있는 제 3 염기서열에 상보적 결합하는 PNA에 표지; 및 제 4 표지체는 제 1 내지 제 3 염기서열의 전후에 각각 상보적으로 결합하는 PNA에 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA서열 분석방법 .

【청구항 8]

제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서，

상기 표지체는 형광 표지체, 발광 표지체， 화학발광 (chenii luminescent) 표지 체， FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 표지체, 양자점 (quantum dot ) 표지체 또는 금속 표지체인 것을 특징으로 하는 DNA서열 분석방법 .

【청구항 9】

제 4항 내지 게 7항 중 어느 함 항에 있어서，

PNA는 4-9개의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열 분석 방

【청구항 10】

거] 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,

PNA는 단일 가닥이거나， 동일한 염기서열을 가지는 PNA가 링커 (linker)를 통 해 연결된 이중 가닥인 것을 특징으로 하는 DNA서열 분석 방법.

【청구항 11】

제 10항에 있어서,

상기 링커 (linker)를 통해 연결된 이중 가닥 PNA에 있어서， 하나의 가닥 말 단이 표지체로 표지되거나， 양 가닥 말단이 동일한 표지체로 표지되는 것을 특징으 로 하는 DNA서열 분석 방법 .

【청구항 12]

제 10항에 있어서，

상기 링커 (linker)를 통해 연결된 이중 가닥 PNA에 있어서， 하나의 가닥 말 단이 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 도너 (donor) 표지체로 표지되 고， 다른 하나의 가닥 말단이 FRETCFluorescence resonance energy transfer) 억셉 터 (acceptor) 표지체로 표지되는 것을 특징으로 하는 DNA 서열 분석 방법 .

【청구항 13]

제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서，

복수 개의 PNA에 표지된 표지체로부터 방출되는 파장은 다중 레이저 채널 (laser channel)을 이용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 DNA 서열 분석 방법.