KR20140006322A - 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법 - Google Patents

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Abstract

나노포어를 포함하는 장치를 이용하여 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 제공한다.

Description

핵산의 염기 서열을 결정하는 방법{Method for determining nucleotide sequence of a nucleic acid}
나노포어를 포함하는 장치를 이용하여 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.
시료 중의 표적 생분자를 분석하기 위한 방법이 개발되었다. 그 중에서 나노갭을 이용한 방법은 바이오포어 모방 시스템으로서 DNA 검출 시스템으로 연구되고 있다. 예를 들면, DNA 또는 RNA가 나노갭을 통과할 때 터널링 전류 또는 차단 전류를 측정하는 것이 있다. 분석은 예를 들면, 핵산의 뉴클레오티드 서열을 분석하는 것이 포함된다. 이러한 서열 분석은 단일염기에 대응되는 신호를 측정하거나, 각 염기에 대한 신호를 분석하는 것을 필요로 한다.
단일 염기에 대응하는 신호를 측정하기 위하여, 다양한 형태의 전극을 사용하는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 그래핀 전극을 사용하거나, 단백질 나노포어를 이용하는 것을 들 수 있다.
종래 기술에 의하더라도, 핵산의 염기 서열을 효율적으로 분석할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 핵산의 염기 서열을 효율적으로 결정하는 방법을 제공한다.
일 양상은 그 두께를 관통하는 나노포어를 포함하는 기판; 상기 나노포어의 내부 벽면에 배치된 제1 전극 및 제2 전극으로서, 제1 전극 및 제2 전극은 상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하도록 배치되어 있고, 상기 나노포어의 내부 벽면을 정의하는 전극의 말단은 한번에 2이상의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께를 가진 전극; 상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원; 및 상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기;를 포함하는 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키는 단계; 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계; 얻어진 전기적 신호를 2이상의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계; 각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하는 단계; 및 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하는 단계;를 포함하는, 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 그 두께를 관통하는 나노포어를 포함하는 기판; 상기 나노포어의 내부 벽면에 배치된 제1 전극 및 제2 전극으로서, 제1 전극 및 제2 전극은 상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하도록 배치되어 있고, 상기 나노포어의 내부 벽면을 정의하는 말단은 한번에 2이상의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께를 가진 전극; 상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원; 및 상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기;를 포함하는 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키는 단계를 포함한다.
상기 장치는 나노포어의 일 말단과 유체소통가능하게 연결된 액체를 담기 위한 시스 챔버; 및 나노포어의 다른 말단과 유체소통가능하게 연결된 액체를 담기 위한 트란스 챔버를 더 포함할 수 있다. 상기 챔버는 액체를 담을 수 있는 것이면 임의의 형태일 수 있다. 예를 들면, 개폐가 조절될 수 있는 입구를 포함하는 밀폐된 것 또는 일 방향이 이상이 개방된 형태의 것일 수 있다.
상기 나노포어는 유체가 흐를 수 있는 통로를 포함하고, 상기 통로는 밀폐되어 있는 형태 또는 일부분 이상 개방되어 있는 갭 (gap)의 형태일 수 있다. 상기 나노포어는 제1 말단과 다른 말단을 직선으로 또는 곡선 형태로 유체 소통가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 기판은 유체 흐름을 지지할 수 있는 고체 기판일 수 있다.
상기 기판은 생체막과 같은 생체 유래의 물질이 아닌 비생물학적 유래의 물질일 수 있다. 상기 기판은 절연물질 (insulating material)일 수 있다. 기판은 실리콘 니트리드 (Si3N4), 알루미늄(Al2O3), 실리카 (SiO2), TeflonTM과 같은 플라스틱, 2성분 부가 경화 실리콘 고무 (silicone rubber)와 같은 탄성체 (elastomer) 및 이들의 조합으로부터 선택된 것일 수 있다. 기판은 편평한 형태, 예를 들면, 필름 또는 막 형태 또는 부정형 형상을 갖는 것일 수 있다. 기판의 일 형태는 적어도 나노포어의 제1 말단에 접하는 부분이 편평한 형태를 갖는 것일 수 있다. 기판은 층상 구조를 갖는 것으로, 실리콘 막과 같은 박막이 지지체 물질에 의하여 지지된 층상 구조를 갖는 것일 수 있다. 나노포어가 배치된 부분의 기판의 두께는 1nm 내지 1000nm, 예를 들면, 3.4nm 내지 500nm 또는 1nm 내지 50nm일 수 있다.
상기 나노포어의 횡단면의 길이는 1nm 내지 100nm, 예를 들면, 1nm 내지 5nm, 1nm 내지 10nm, 5nm 내지 10nm 또는 1nm 내지 25nm의 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 나노포어는 횡단면이 원형 또는 다각형의 형태를 갖는 것일 수 있다. 원형인 경우, 상기 횡단면의 길이는 직경을 나타내고, 다각형인 경우, 최단 거리를 나타낸다. 상기 나노포어의 횡단면의 길이는 나노포어의 길이 방향 (longitudinal direction)에 대하여 균일할 수 있다. 상기 나노포어의 길이 방향의 길이는 핵산이 통과될 수 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 나노포어의 길이 방향의 길이는 통과되는 핵산의 길이 보다 작은 것일 수 있다. 상기 나노포어의 길이 방향의 길이는 핵산 분자 중의 한 염기와 염기 사이의 거리 예를 들면, 3.4nm 내지 500nm일 수 있다. 또한, 상기 길이는 핵산 분자 중의 한 염기와 염기 사이의 거리 예를 들면, 3.4nm 이하일 수 있다.
제1 전극과 제2 전극은 그 사이에 나노포어의 벽면을 정의하여 상기 나노포어의 내부 공간에 접촉가능하게 배치되어 있는 것일 수 있다. 제1 전극 및 제2 전극 쌍은 전압원 및/또는 전기적 신호 측정 장치에 전기적으로 연결된 것일 수 있다. 제1 전극 및 제2 전극 쌍은 복수 개의 쌍이 절연물질에 의하여 이격되어 배치된 것일 수 있다. 제1 전극 및 제2 전극은 절연물질에 의하여 그 아래 및 위가 절연되어 있는 것일 수 있다.
제1 전극 및 제2 전극에 연결된 전기적 신호 측정기는 전류, 전압, 임피던스, 전기용량 또는 이들의 조합을 측정하는 장치일 수 있다.
상기 장치는 상기 나노포어의 제1 말단 측에 배치된 제3 전극 및 상기 나노포어의 다른 말단에 연결된 제4 전극을 더 포함하는 것일 수 있다. 제3 전극 및 제4 전극은 전압원 및/또는 전기적 신호 측정 장치에 전기적으로 연결된 것일 수 있다.
상기 장치는 핵산을 나노포어를 관통하여 선형적으로 이동시키기 위한 수단을 더 포함할 수 있다. 상기 수단은 제1 말단과 다른 말단 사이에 물질의 농도구배, 전압구배, 및 자기력 구배를 제공하기 위한 수단일 수 있다. 상기 수단은 예를 들면, 제1 말단과 다른 말단 사이 또는 채널 내에 배치된 2 이상의 전극을 포함할 수 있다. 상기 전극은 나노포어의 적어도 일부를 정의하는 것이거나 그와는 별개의 것일 수 있다. 나노포어의 적어도 일부를 정의하는 경우는, 나노포어의 적어도 일부분이 전도성 물질로 된 것일 수 있다. 예를 들면, 나노포어의 적어도 일부분이 전도성 물질로 코팅되거나, 전도성 물질 함입되어 있는 것일 수 있다. 상기 수단은 예를 들면, 제1 말단과 다른 말단 사이 또는 채널 내 중 하나이상의 위치에 배치된 분자 모터, 기계적 구동장치, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상일 수 있다. 상기 장치는 또한 상기 수단에 전기적으로 연결된 전원을 포함할 수 있다.
상기 나노포어를 통하여 통과하는 액체에 대하여 전압을 인가하는 제1 전극및 제2 전극의 말단은 2이상의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께를 갖는 것일 수 있다. 상기 두께는 0.34nm 보다 큰 것, 예를 들면, 0.34nm 보다 0.68nm 미만, 0.68nm 보다 크고 1.02nm 미만, 또는 1.02nm 보다 크고 1.36nm 미만인 것일 수 있다.
상기 이동시키는 단계는, 제1 말단과 다른 말단 사이에서 핵산에 가하여지는 임의의 구동력에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 이동은 자연적인 중력, 확산, 전압구배, 자기력 구배, 분자 모터, 기계적 힘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 구동력을 인가함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 일 예는 제1 말단과 다른 말단 사이에서 전압 구배를 인가하는 것일 수 있다. 이 경우, 제1 말단과 다른 말단은 모두 전해질 용액 중에서 접촉된 것일 수 있다. 전해질 용액은 예를 들면, KCl, NaCl 및 이들의 조합을 포함하는 용액일 수 있다. 핵산은 DNA, RNA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 핵산은 단일가닥, 이중가닥 및 이들의 조합으로부터 선택된 형태를 갖는 것일 수 있다. 핵산은 또한 2차 또는 3차 구조를 갖는 것일 수 있다. 핵산은 다른 고분자와 결합된 상태가 아닌 분리된 상태일 수 있다.
상기 방법은, 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 전기적 신호는 전류, 전압, 임피던스, 전기용량 또는 이들의 조합일 수 있다. 측정하는 단계는 터널링 전류를 측정하는 것일 수 있다. 측정하는 단계는 한번에 측정되는 전기적 신호는 동일한 염기 조성에 대하여는 동일한 전기적 신호가 측정되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 전기적 신호 측정기가 측정할 수 있는 단위 뉴클레오티드 개수가 2개인 경우, AT, 및 TA는 서열은 다르지만, 그 염기 조성은 동일하므로 동일한 전기적 신호가 측정될 있다. 상기 전기적 신호 측정기가 측정할 수 있는 단위 뉴클레오티드 개수가 3개인 경우, AAT, ATA, 및 TAA는 서열은 다르지만, 그 염기 조성은 동일하므로 동일한 전기적 신호가 측정될 있다.
상기 방법은, 얻어진 전기적 신호를 2이상의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 "뉴클레오티드"와 "염기"는 상호 교환가능하게 사용된다. "단위 개수"란 제1 전극 및 제1 전극이 핵산과 접촉하는 면적의 한정으로 인하여 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 한번에 측정되는 뉴클레오티드 개수이다. 상기 전기적 신호 측정기는 한번에 2개, 3개, 또는 4개 뉴클레오티드 단위로 전기적 신호를 측정할 수 있는 경우, 단위 개수는 2, 3 또는 4이다. 단위 개수는 2 내지 10, 예를 들면, 2 내지 6, 또는 2 내지 4일 수 있다. 상기 분할을 일 뉴클레오티드 이동에 소용되는 시간을 결정하고 이 시간에 단위 개수를 곱하여 얻어지는 단위 개수 시간에 해당하는 측정된 신호를 얻음으로써 수행될 수 있다. 분할하는 단계는 일 뉴클레오티드 이동에 소용되는 시간을 이동하면서 분할하는 것일 수 있다.
상기 방법은, 각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하는 단계를 포함한다.
상기 방법은, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하는 단계;를 포함한다. "1 염기 차이"란 1 뉴클레오티드 이동에 걸리는 시간을 나타낸다. 예를 들면, 1 뉴클레오티드 이동시에 염기조성 AAT (ATA, 또는 TAA와 동일)에 해당하는 신호가 얻어졌고, 다시 1 뉴클레오티드 더 이동시에 염기조성 AAT (ATA, 또는 TAA와 동일)에 해당하는 신호가 얻어졌고, 다시 1 뉴클레오티드 더 이동시에 염기조성 AAC (ACA, 또는 CAA와 동일)에 해당하는 신호가 얻어졌다면, 1번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)과, 2번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)은 1 번위 단위 개수 서열의 2, 3번 서열은 2번 단위 개수 서열의 1,2번과 중복되고, 2번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)과, 3번 뉴클레오티드 조성 (AAC, ACA, 또는 CAA)은 2 번위 단위 개수 서열의 2, 3번 서열은 3번 단위 개수 서열의 1, 2번과 중복되어야 하므로, 이들 조건을 만족하는 1,2,3번 뉴클레오티드 서열은 ATA가 되어야 한다.
상기 방법은, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터 판독가능한 저장 매체에 기록하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 장치는 상기 정보가 기록된 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
다른 양상은 그 두께를 관통하는 나노포어를 포함하는 기판으로서, 나노포어의 길이 방향은 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이를 가진 것인 기판; 상기 나노포어의 길이를 통하여 전압을 인가하도록 배치되어 있는 제3 전극 및 제4 전극; 상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원; 및 상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기;를 포함하는 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키는 단계; 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계; 얻어진 전기적 신호를 2이상의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계; 각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하는 단계; 및 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하는 단계;를 포함하는, 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 그 두께를 관통하는 나노포어를 포함하는 기판으로서, 나노포어의 길이 방향은 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이를 가진 것인 기판; 상기 나노포어의 길이를 통하여 전압을 인가하도록 배치되어 있는 제3 전극 및 제4 전극; 상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원; 및 상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기;를 포함하는 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키는 단계를 포함한다.
상기 장치는 나노포어의 일 말단과 유체소통가능하게 연결된 액체를 담기 위한 시스 챔버; 및 나노포어의 다른 말단과 유체소통가능하게 연결된 액체를 담기 위한 트란스 챔버를 더 포함할 수 있다. 상기 챔버는 액체를 담을 수 있는 것이면 임의의 형태일 수 있다. 예를 들면, 개폐가 조절될 수 있는 입구를 포함하는 밀폐된 것 또는 일 방향이 이상이 개방된 형태의 것일 수 있다.
상기 나노포어는 유체가 흐를 수 있는 통로를 포함하고, 상기 통로는 밀폐되어 있는 형태 또는 일부분 이상 개방되어 있는 갭 (gap)의 형태일 수 있다. 상기 나노포어는 제1 말단과 다른 말단을 직선으로 또는 곡선 형태로 유체 소통가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 기판은 유체 흐름을 지지할 수 있는 고체 기판일 수 있다.
상기 기판은 생체막과 같은 생체 유래의 물질이 아닌 비생물학적 유래의 물질일 수 있다. 상기 기판은 절연물질 (insulating material)일 수 있다. 기판은 실리콘 니트리드 (Si3N4), 알루미늄(Al2O3), 실리카 (SiO2), TeflonTM과 같은 플라스틱, 2성분 부가 경화 실리콘 고무 (silicone rubber)와 같은 탄성체 (elastomer) 및 이들의 조합으로부터 선택된 것일 수 있다. 기판은 편평한 형태, 예를 들면, 필름 또는 막 형태 또는 부정형 형상을 갖는 것일 수 있다. 기판의 일 형태는 적어도 나노포어의 제1 말단에 접하는 부분이 편평한 형태를 갖는 것일 수 있다. 기판은 층상 구조를 갖는 것으로, 실리콘 막과 같은 박막이 지지체 물질에 의하여 지지된 층상 구조를 갖는 것일 수 있다. 나노포어가 배치된 부분의 기판의 두께는 1nm 내지 1000nm, 예를 들면, 3.4nm 내지 500nm 또는 1nm 내지 50nm일 수 있다.
상기 나노포어의 횡단면의 길이는 1nm 내지 100nm, 예를 들면, 1nm 내지 5nm, 1nm 내지 10nm, 5nm 내지 10nm 또는 1nm 내지 25nm의 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 나노포어는 횡단면이 원형 또는 다각형의 형태를 갖는 것일 수 있다. 원형인 경우, 상기 횡단면의 길이는 직경을 나타내고, 다각형인 경우, 최단 거리를 나타낸다. 상기 나노포어의 횡단면의 길이는 나노포어의 길이 방향 (longitudinal direction)에 대하여 균일할 수 있다.
상기 방법에서, 상기 장치는 그 두께를 관통하는 나노포어를 포함하는 기판으로서, 나노포어의 길이 방향은 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이를 가진 것인 기판을 포함한다. 나노포어는 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이를 갖는 것일 수 있다. 상기 길이는, 0.34nm 보다 큰 것, 예를 들면, 0.34nm 보다 0.68nm 미만, 0.68nm 보다 크고 1.02nm 미만, 또는 1.02nm 보다 크고 1.36nm 미만인 것일 수 있다.
상기 방법에서, 상기 장치는 상기 나노포어의 길이를 통하여 전압을 인가하도록 배치되어 있는 제3 전극 및 제4 전극을 포함한다. 제3 전극은 상기 나노포어의 제1 말단 측에 배치되고 제4 전극은 상기 나노포어의 다른 말단에 연결된 것일 수 있다. 제3 전극 및 제4 전극은 전압원 및 전기적 신호 측정 장치에 전기적으로 연결되어 있다.
상기 장치는 핵산을 나노포어를 관통하여 선형적으로 이동시키기 위한 수단을 더 포함할 수 있다. 상기 수단은 제1 말단과 다른 말단 사이에 물질의 농도구배, 전압구배, 및 자기력 구배를 제공하기 위한 수단일 수 있다. 상기 수단은 예를 들면, 제1 말단과 다른 말단 사이에 대하여 또는 채널 내에 배치된 2 이상의 전극을 포함할 수 있다.
상기 이동시키는 단계는, 제1 말단과 다른 말단 사이에서 핵산에 가하여지는 임의의 구동력에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 이동은 자연적인 중력, 확산, 전압구배, 자기력 구배, 분자 모터, 기계적 힘, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 구동력을 인가함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 일 예는 제1 말단과 다른 말단 사이에서 전압 구배를 인가하는 것일 수 있다. 이 경우, 제1 말단과 다른 말단은 모두 전해질 용액 중에서 접촉된 것일 수 있다. 전해질 용액은 예를 들면, KCl, NaCl 및 이들의 조합을 포함하는 용액일 수 있다. 핵산은 DNA, RNA 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 핵산은 단일가닥, 이중가닥 및 이들의 조합으로부터 선택된 형태를 갖는 것일 수 있다. 핵산은 또한 2차 또는 3차 구조를 갖는 것일 수 있다. 핵산은 다른 고분자와 결합된 상태가 아닌 분리된 상태일 수 있다.
상기 방법은, 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계; 얻어진 전기적 신호를 2이상의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계; 각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하는 단계; 및 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하는 단계를 포함하며, 이들 단계는 달리 언급이 없으면, 상기한 바와 같다.
상기 방법은, 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계를 포함한다. 전기적 신호는 전류, 전압, 임피던스, 전기용량 또는 이들의 조합일 수 있다. 측정하는 단계는 차단 전류를 측정하는 것일 수 있다. 측정하는 단계는 한번에 측정되는 전기적 신호는 동일한 염기 조성에 대하여는 동일한 전기적 신호가 측정되는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 전기적 신호 측정기가 측정할 수 있는 단위 뉴클레오티드 개수가 2개인 경우, AT, 및 TA는 서열은 다르지만, 그 염기 조성은 동일하므로 동일한 전기적 신호가 측정될 있다. 상기 전기적 신호 측정기가 측정할 수 있는 단위 뉴클레오티드 개수가 3개인 경우, AAT, ATA, 및 TAA는 서열은 다르지만, 그 염기 조성은 동일하므로 동일한 전기적 신호가 측정될 있다.
상기 방법은, 얻어진 전기적 신호를 2이상의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계를 포함한다. 본 명세서에서 "뉴클레오티드"와 "염기"는 상호 교환가능하게 사용된다. "단위 개수"란 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 한번에 그 신호가 측정될 수 있는 뉴클레오티드 개수이다. 이는 핵산과 그와 접촉하는 나노포어 내부의 면적의 한정으로 인하여 제3 전극 및 제4 전극에 연결된 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 한번에 그 신호가 측정될 수 있는 뉴클레오티드 개수일 수 있다. 상기 전기적 신호 측정기는 한번에 2개, 3개, 또는 4개 뉴클레오티드 단위로 전기적 신호를 측정할 수 있는 경우, 단위 개수는 2, 3 또는 4이다. 단위 개수는 2 내지 10, 예를 들면, 2 내지 6, 또는 2 내지 4일 수 있다. 상기 분할을 일 뉴클레오티드 이동에 소용되는 시간을 결정하고 이 시간에 단위 개수를 곱하여 얻어지는 단위 개수 시간에 해당하는 측정된 신호를 얻음으로써 수행될 수 있다. 분할하는 단계는 일 뉴클레오티드 이동에 소용되는 시간을 이동하면서 분할하는 것일 수 있다.
상기 방법은, 각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하는 단계를 포함한다.
상기 방법은, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하는 단계;를 포함한다. "1 염기 차이"란 1 뉴클레오티드 이동에 걸리는 시간을 나타낸다. 예를 들면, 1 뉴클레오티드 이동시에 염기조성 AAT (ATA, 또는 TAA와 동일)에 해당하는 신호가 얻어졌고, 다시 1 뉴클레오티드 더 이동시에 염기조성 AAT (ATA, 또는 TAA와 동일)에 해당하는 신호가 얻어졌고, 다시 1 뉴클레오티드 더 이동시에 염기조성 AAC (ACA, 또는 CAA와 동일)에 해당하는 신호가 얻어졌다면, 1번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)과, 2번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)은 1 번위 단위 개수 서열의 2, 3번 서열은 2번 단위 개수 서열의 1,2번과 중복되고, 2번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)과, 3번 뉴클레오티드 조성 (AAC, ACA, 또는 CAA)은 2 번위 단위 개수 서열의 2, 3번 서열은 3번 단위 개수 서열의 1, 2번과 중복되어야 하므로, 이들 조건을 만족하는 1,2,3번 뉴클레오티드 서열은 ATA가 되어야 한다.
상기 방법은, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터 판독가능한 저장 매체에 기록하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 장치는 상기 정보가 기록된 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 따르면, 핵산의 염기 서열을 효율적으로 결정할 수 있다.
도 1은 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 사용될 수 있는 핵산 분석 장치의 일 예를 나타낸 도면이다.
도 2는 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 사용될 수 있는 핵산 분석 장치의 다른 일 예를 나타낸 도면이다.
도 3은 해상도 3인 제1 전극 및 제2 전극을 사용하여 20머 폴리뉴클레오티드에 대하여 측정되는 신호를 단위 3개 염기 개수에 대한 전류 변화 값으로 나타낸 도면이다.
도 4는 표 3의 3개 염기 단위의 신호 수준 및 그에 대한 염기 조성에 근거하여 염기 서열을 결정한 예를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 한번에 2이상의 연속 뉴클레오티드에 대한 전기적 신호를 측정하는 것에 의한 핵산 염기 서열 분석 방법
(1) 나노포어를 포함하는 핵산 분석 장치
도 1은 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 사용될 수 있는 핵산 분석 장치의 일 예를 나타낸 도면이다.
도 1A를 참조하면, 상기 장치 (100)는 그 두께를 관통하는 나노포어 (70)를 포함하는 기판 (10, 20, 30), 상기 나노포어의 내부 벽면에 배치된 제1 전극 (10) 및 제2 전극 (10')으로서, 제1 전극 및 제2 전극은 상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하도록 배치되어 있고, 상기 나노포어의 내부 벽면을 정의하는 말단 (50)은 한번에 2이상의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께를 가진 전극; 상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원 (V1); 및 상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기 (1)를 포함한다. 상기 나노포어 (70)의 제1 전극 (10) 및 제2 전극(10')은 절연물질 (20)상에 배치되고, 제1 전극 (10) 및 제2 전극(10') 상에는 절연물질(30)이 배치될 수 있다. 상기 나노포어의 내부 벽면을 정의하는 말단 (50)은 2이상, 예를 들면 3개의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께를 갖는 것일 수 있다. 상기 두께는 예를 들면, 1.02nm일 수 있다.
도 1B는 전기적 신호를 2개이상, 예를 들면 3개의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수 (50)에 대한 신호 (50')로 분할한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1B의 결과는, 상기 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키는 단계; 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계; 및 얻어진 전기적 신호를 2이상, 예를 들면 3개의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계;를 수행함으로써 얻어질 수 있다.
도 2는 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법에 사용될 수 있는 핵산 분석 장치의 다른 일 예를 나타낸 도면이다. 도 2A는 사시도이며, 도 2B는 측면 단면도이다.
도 2를 참조하면, 핵산 분석 장치 (100)는 그 두께를 관통하는 나노포어 (70)를 포함하는 기판(20)으로서, 나노포어의 길이 방향은 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이 (24)를 가진 것인 기판; 상기 나노포어의 길이를 통하여 전압을 인가하도록 배치되어 있는 제3 전극 (60) 및 제4 전극 (80); 상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원 (V); 및 상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기 (I);를 포함할 수 있다.
(2) 핵산 염기의 결정
핵산 염기의 결정에 사용한 핵산 분석 장치는 도 1에 나타낸 장치를 사용하였다.
장치의 상기 나노포어의 내부 벽면을 정의하는 말단의 두께는 한번에 2개의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께인 1.02nm인 것을 사용하였다. 상기 장치는 또한 나노포어의 일 말단과 유체소통가능하게 연결된 액체를 담기 위한 시스 챔버; 및 나노포어의 다른 말단과 유체소통가능하게 연결된 액체를 담기 위한 트란스 챔버를 더 포함하고 있다. DNA의 이동 및 신호 측정을 위해 시스/트란스 챔버에는 1M KCl 용액을 채워서 측정하였으며, 위 아래의 KCl 농도를 다르게 하여 속도를 줄이거나 노이즈를 줄일 수도 있다. 제3 전극(60)과 제4 전극(80)에 전압, 약 200mV 내지 300mV를 인가하여 DNA가 이동할 수 있는 구도력 (driving force)을 만들어 주었으며, 제3, 4 전극으로는 Ag/AgCl 전극을 사용하였다.
상기 시스 챔버에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 20개 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드를 첨가하고, 제3 전극 (60)과 제4 전극 (80) 사이에 전압을 인가하여 폴리뉴클레오티드가 시스 챔버로부터 트란스 챔버로 이동하도록 하였다. 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키고, 상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하고, 얻어진 전기적 신호를 3개의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계; 각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하고, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하였다.
상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정한 결과, 3개의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수의 염기 조성이 동일한 경우, 동일한 전기적 신호가 측정되었다. 예를 들면, AAT, ATA, TAA는 동일한 염기 조성을 갖는 것이므로, 동일한 전기적 신호가 측정되었고, ACT, ATC, CAT, CTA, TAC, TCA는 동일한 염기 조성을 갖는 것이므로, 동일한 전기적 신호가 측정되었다.
이 경우, 한번 n 염기에 대한 전기적 신호를 측정할 수 있는 전기적 신호 측정기에 의하여 측정된, 각 단위 개수에 대한 신호의 개수는, 4개 염기 중 n개 염기를 중복을 허락하여 뽑게 되는 중복조합에 의하여 결정되는 수와 같다. 예를 들면, 전극의 말단 두께 1.02nm인 경우, 한번에 3개 염기에 해당하는 전기적 신호를 측정할 수 있으며, 염기 서열에 해당하는 필요한 모든 전기적 신호는 64 개 (43)이지만, 동일한 조성은 동일한 전기적 신호가 측정되므로 중복조합에 의하여 20개 (4H3=6C3)만이 필요하다. 따라서, 이들 20개 신호만을 구분하고 염기 서열과 연관시킴으로써 염기서열을 결정할 수 있다. 또한, 염기 서열에 대한 전기적 신호의 중복 측정, 예를 들면, 한번에 3개 염기를 측정하는 경우, 1개 염기를 최대 3번씩 측정하게 되므로, 측정의 정확도를 높일 수 있다.
따라서, 한번 n 염기에 대한 전기적 신호를 측정할 수 있는 전기적 신호 측정기에 의하여 측정된 경우, 측정되는 신호의 개수 (n=r-1)!/r1(n-1)! (nHr=n+r-1Cr)와 같다.
해상도(염기) 4n 4Hr
2 16 10
3 64 20
4 256 35
5 1024 56
6 4096 84
표 1은 한번에 측정할 수 있는 염기의 개수 (이하 "해상도"라고도 함)가 2 내지 6인 경우, 측정되는 신호의 개수를 나타낸다.
신호 수준 염기조성
1 A A A
2 A A C
3 A A G
4 A A T
5 A C C
6 A C G
7 A C T
8 A G G
9 A G T
10 A T T
11 C C C
12 C C G
13 C C T
14 C G G
15 C G T
16 C T T
17 G G G
18 G G T
19 G T T
20 T T T
표 2는 해상도 3인 경우, 예를 들면, 두께 1.02nm인 제1 전극 및 제2 전극을 사용한 경우, 측정되는 신호의 수준과 염기 조성을 나타낸다.
도 3은 해상도 3인 제1 전극 및 제2 전극을 사용하여 20머 폴리뉴클레오티드에 대하여 측정되는 신호를 단위 3개 염기 개수에 대한 전류 변화 값으로 나타낸 도면이다. 상기 전류는 터널링 전류일 수 있다. 상기 20머 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
신호 수준 염기 조성
4 A A T
4 A A T
2 A A C
7 A C T
15 C G T
19 G T T
9 A G T
7 A C T
7 A C T
7 A C T
9 A G T
6 A C G
15 C G T
16 C T T
16 C T T
7 A C T
6 A C G
8 A G G
표 3은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대하여 측정된 전기적 신호를 3개 염기 단위로 분할하고 그에 해당하는 신호 수준 및 그에 대한 염기 조성을 측정의 순서대로 나타낸 것이다.
도 4는 표 3의 3개 염기 단위의 신호 수준 및 그에 대한 염기 조성에 근거하여 염기 서열을 결정한 예를 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 20개 뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드의 경우, 3개 염기 단위의 신호 수준의 순서는 4, 4, 2, 7, 15, 19, 9, 7, 7, 7, 9, 6, 15, 16, 16, 7, 6, 8이고, 그에 해당하는 염기 조성을 2개 염기가 겹치게 배치하였다.
여기서, 1번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)과, 2번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)은 1 번위 단위 개수 서열의 2, 3번 서열은 2번 단위 개수 서열의 1,2번과 중복되고, 2번 뉴클레오티드 조성 (AAT, ATA, 또는 TAA)과, 3번 뉴클레오티드 조성 (AAC, ACA, 또는 CAA)은 2 번위 단위 개수 서열의 2, 3번 서열은 3번 단위 개수 서열의 1, 2번과 중복되어야 하므로, 이들 조건을 만족하는 1,2,3번 뉴클레오티드 서열은 ATA가 되어야 한다. 동일한 과정을, 나머지 뉴클레오티드 조성에 대하여도 동일하게 반복하면, 표 3의 데이터로부터 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 도출할 수 있다.
또한, 차단 전류를 측정하는 경우에 있어서도, 위와 동일한 과정을 거쳐 핵산의 염기 서열을 결정할 수 있다.
<110> Samsung Electronics. Co. Ltd. <120> Method for determining nucleotide sequence of a nucleic acid <130> PN096923 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20mer sample polynucleotide <400> 1 ataactgtac tagcttcagg 20

Claims (19)

  1. 그 두께를 관통하는 나노포어를 포함하는 기판;
    상기 나노포어의 내부 벽면에 배치된 제1 전극 및 제2 전극으로서, 제1 전극 및 제2 전극은 상기 나노포어를 가로질러 전압을 인가하도록 배치되어 있고, 상기 나노포어의 내부 벽면을 정의하는 말단은 한번에 2이상의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께를 가진 전극;
    상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원; 및
    상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기;를 포함하는 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키는 단계;
    상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계;
    얻어진 전기적 신호를 2이상의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계;
    각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하는 단계; 및
    각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하는 단계;를 포함하는, 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 2이상의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께는 0.34nm 보다 큰 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 2이상의 연속 뉴클레오티드를 감지할 수 있도록 하는 두께는 0.34nm 보다 0.68nm 미만, 0.68nm 보다 크고 1.02nm 미만, 또는 1.02nm 보다 크고 1.36nm 미만인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 분할하는 단계는 1 염기에 해당하는 시간을 이동하면서 분할하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 단위 개수는 2 내지 4인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 측정하는 단계는 터널링 전류를 측정하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 측정하는 단계는 한번에 측정되는 전기적 신호는 동일한 염기 조성에 대하여는 동일한 전기적 신호가 측정되는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터 판독가능한 저장 매체에 기록된 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터에 의하여 수행되는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 제1 전극 및 제2 전극은 절연물질에 의하여 그 아래 및 위가 절연되어 있는 것인 방법.
  11. 그 두께를 관통하는 나노포어를 포함하는 기판으로서, 나노포어의 길이 방향은 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이를 가진 것인 기판;
    상기 나노포어의 길이를 통하여 전압을 인가하도록 배치되어 있는 제3 전극 및 제4 전극;
    상기 전극에 전기적으로 연결된 전압원; 및
    상기 전극에 전기적으로 연결된 전기적 신호 측정기;를 포함하는 핵산 분석 장치의 상기 나노포어의 일 말단으로부터 다른 말단으로 핵산을 이동시키는 단계;
    상기 전기적 신호 측정기에 의하여 핵산의 이동 시간에 대한 전기적 신호를 측정하는 단계;
    얻어진 전기적 신호를 2이상의 연속 뉴클레오티드의 단위 개수에 대한 신호로 분할하는 단계;
    각 얻어진 단위 개수에 대한 신호를 서열을 알고 있는 대조군 핵산으로부터 얻어진 각 단위 개수에 대한 신호와 비교하여, 각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기 조성을 결정하는 단계; 및
    각 단위 개수에 대한 신호에 해당하는 염기조성을 1 염기 차이로 순서대로 배열하고 중복되는 염기를 고려하여 염기 서열을 결정하는 단계;를 포함하는, 핵산의 염기 서열을 결정하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이는 0.34nm 보다 큰 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 2이상의 연속 뉴클레오티드에 의하여 차단될 수 있는 길이는 0.34nm 보다 0.68nm 미만, 0.68nm 보다 크고 1.02nm 미만, 또는 1.02nm 보다 크고 1.36nm 미만인 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 분할하는 단계는 1 염기에 해당하는 시간을 이동하면서 분할하는 것인 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 단위 개수는 2 내지 4인 것인 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 측정하는 단계는 차단 전류를 측정하는 것인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 측정하는 단계는 한번에 측정되는 전기적 신호는 동일한 염기 조성에 대하여는 동일한 전기적 신호가 측정되는 것인 방법.
  18. 청구항 11에 있어서, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터 판독가능한 저장 매체에 기록된 것인 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 분할하는 단계, 염기 조성을 결정하는 단계, 및 염기 서열을 결정하는 단계는 컴퓨터에 의하여 수행되는 것인 방법.
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