JP4918237B2 - 生体の定量方法 - Google Patents
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Description
本発明は、試料中の生体の定量方法および定量装置に関し、例えば、溶液中の微生物の数を定量的に検出する方法および装置に関する。
一般に、生菌などの微生物が人間の活動に大きな影響を与えることが知られており、こうした微生物を簡便に検出する方法あるいは検出装置は、従来から社会的な要請として多くの研究が行われてきた。具体的には、溶液中の生菌を測定する代表的な測定方法として以下のようなインピーダンス法などが挙げられる。
例えば、電極間にパルス電圧もしくはステップ電圧をかけ、電気泳動による電流変化を見る方法がある。すなわち、この方法は、図１０に示すように、微生物含有の液体を収容でき内部に面対向する一対の平板状の電極５１ａ，５１ｂを配置した容器５０と、電極５１ａ，５１ｂ間に電圧を印加する電源回路５２と、電極５１ａ，５１ｂ間の電気量を測定する電気量測定回路５２と、電気量測定回路５２で測定された電気量に基づき微生物を計数する演算回路５５と有する構造となっている。これにより、電極５１ａ，５１ｂ間の電気量を検出し、これを演算して微生物を計数できる微生物数測定装置である（例えば特許文献１参照）。
また、電気泳動で（櫛歯型）電極に生菌を凝集させて交流電圧をかけて溶液のインピーダンスの値から生菌数を求める方法がある。すなわち、本方法は、図１１に示すように、試料を保持することができる測定セル６１と、電極６２に誘電泳動を行うための電圧を印加する電源部６３と、試料液中の微生物数を算出する測定部６４と、電源部６３と測定部６４を制御するための制御部６５とを備え、制御部６５が電極６２に電圧を印加して試料液中の微生物を誘電泳動力によって該電極上に捕集し、測定部６４が捕集後または捕集中の電極６２間のインピーダンスを測定することで試料液中の微生物数を定量的に算出するものである（例えば特許文献２参照）。
さらに、図１２に示すように、所定の抗原決定基をもつ微生物含有の試料液と、抗原決定基と抗原抗体反応し且つ標識物質を結合した抗体を含有する検液と、安定溶液とを導入し、内部で抗原抗体反応させることができる反応セル７１と、反応セル７１内と連通路７２で連通され、抗原抗体反応した微生物を誘電泳動させて電界集中部に集めるための泳動電極が設けられた測定セル７３と、泳動電極に交流電圧を印加する泳動電源部７４と、電界集中部に集められた抗原抗体反応した微生物に結合された標識物質の濃度を測定する測定部７５と、標識物質の濃度から微生物数及び／または微生物濃度を算出する演算部７６と、泳動電源部７４と測定部７５と演算部７６とを制御する制御部７７とを有する構成によって、微生物数・微生物濃度を光学的に求める方法がある（例えば特許文献３参照）。
しかしながら、電極間にパルス電圧もしくはステップ電圧をかけ、電流変化を見る方法では、過渡応答を測定する必要があることから迅速性に欠けるという課題があった。
また、電気泳動法を用い、電極に生菌を凝集させて交流電圧をかけて溶液のインピーダンスの値から生菌数を求める方法では、電気泳動で凝集させるのに時間がかかりすぎる問題があった。電気泳動法を用い、電極に生菌を凝集させて光学的に求める方法についても、同様の課題があった。
また、電気泳動法を用い、電極に生菌を凝集させて交流電圧をかけて溶液のインピーダンスの値から生菌数を求める方法では、電気泳動で凝集させるのに時間がかかりすぎる問題があった。電気泳動法を用い、電極に生菌を凝集させて光学的に求める方法についても、同様の課題があった。
つまり、現場での種々の目的に対応した生菌などの微生物の測定には、迅速性が強く求められているが、上述した方法では、定量自体に時間がかかってリアルタイムの測定を実現するのは無理である上に、測定に使用する試薬等も多く、専門家による高度で複雑な作業が必要で、一般の人間が測定を行えるようなものではなかった。
本発明は、このような課題を解決するために、リアルタイムに近い迅速性を備え、特定の生体の数を簡便に検出する、生体の定量方法および定量装置を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、以下に示す生体の定量方法および定量装置によって上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、試料中の特定の生体の数を検出する方法であって、所定の間隔を有する電極間に試料を導入し、該電極間に一定周波数の交流電圧を印加した条件下で、前記電極間に印加した交流電圧と発生した交流電流の位相差を検出して該位相差信号から正接を求めるとともに、予め得られた正接と特定の生体の数との関係から、前記試料中の特定の生体の数を演算することを特徴とする（請求項１）。
また、本発明は、試料中の特定の生体の数を検出する装置であって、所定の間隔を有する電極と該電極間に試料が導入される流路からなる検出セル部と、該電極間に一定周波数の交流電圧を印加する電源部と、該交流電圧を測定する交流電圧計と、該電極間に流れる交流電流を測定する交流電流計と、前記交流電圧と交流電流の位相を比較して位相差信号を作成する位相比較器と、該位相比較器からの位相差信号の演算、前記生体の数の検出に必要な情報の保存および該情報を用いて演算処理を行う演算処理部と、を有することを特徴とする（請求項６）。
つまり、特定の誘電率を有する溶媒中に特定の生体が存在する場合、該溶媒の誘電率がその生体の存在、つまり生体の数によって変化が生じることが知られている。このとき、これらが共存する空間、例えば溶液に一定の電界を形成していれば、電界にそれに相応する変化が生じることになり、この電界変化量をインピーダンス変化として検出すれば特定の生体の数を検出することができる一方、上記のような課題が生じる。本発明者は、こうした電界変化量をインピーダンス変化としてではなく、電極間に一定周波数の交流電圧を印加した条件下で、電極間に印加した交流電圧（印加電圧）と発生した交流電流（負荷電流）の位相差を検出して該位相差信号から正接を求めることによって、特定の生体の数を迅速かつ精度よく検出することができることを見出したもので、予め得られた正接と特定の生体の数との関係を求めておくことで、非常に選択性の高い生体の定量方法または定量装置を形成することが可能となる。
また、こうした検出方法は、特殊な作業を必要とせず、かつ、非常に迅速性の高いことから、リアルタイムに近い迅速性を備え、誰でも特定の生体を簡便かつ定量的に検出することが可能な生体の定量方法または定量装置を提供することができる。つまり、従来の余計な抗原抗体反応や電気泳動による凝集などの操作が不要になり、測定に要する時間の短縮とコストダウンが可能になるという効果が得ることができる。さらに、次のような技術的効果を得ることが可能となった。
（１）印加電圧と負荷電流の位相を測定するだけで優れた測定精度を確保することができるので、従来のインピーダンス法に比べ、測定回路が単純になった。特に、印加電圧を精密に設定する必要がなくなり、回路構成の負担が小さくなった。
（２）印加電圧と負荷電流の位相を比較して正接を演算するだけであり、インピーダンスをわざわざ計算してインピーダンスと生菌数の検量線から生菌数を演算するという余計な操作が不要になり、演算機能を実現するためのソフト開発上の負担が小さくなった。
（１）印加電圧と負荷電流の位相を測定するだけで優れた測定精度を確保することができるので、従来のインピーダンス法に比べ、測定回路が単純になった。特に、印加電圧を精密に設定する必要がなくなり、回路構成の負担が小さくなった。
（２）印加電圧と負荷電流の位相を比較して正接を演算するだけであり、インピーダンスをわざわざ計算してインピーダンスと生菌数の検量線から生菌数を演算するという余計な操作が不要になり、演算機能を実現するためのソフト開発上の負担が小さくなった。
なお、ここでいう生体とは、タンパク質、核酸、糖類、生物が産生した有機分子・無機分子、あるいは上記のような原因菌や桿菌などを含む各種の菌、細胞、酵素、微生物など、生命体を構成している要素あるいは広く独立した生命体自身を含む。
本発明は、上記生体の定量方法であって、前記電極の表面に、予め前記生体のみと特異的に結合する生体高分子を固定しておき、前記電極間に前記試料を導入することを特徴とする（請求項２）。
上記のように、本発明においては、電極間のインピーダンスつまり溶液のインピーダンスが生体の定量精度を決定する１つの重要な要素である。従って、例えば、唾液中のう触原因菌の菌数測定のように、唾液中のイオン濃度が高く試料溶液のインピーダンスに影響を及ぼす場合などにおいては、試料溶液に所定の脱塩処理を施した後に測定する方法が有効である。このような場合、電極の表面に、予め生体のみと特異的に結合する生体高分子を固定しておき、電極間に前記試料を導入することによって、電極表面に測定対象である生体を固定することが可能となる。すなわち、測定したい生体は特異抗体と結合しているので、イオン交換水などで溶液を置換し、試料溶液のインピーダンスに影響しない測定に適した条件で生体を測定することが可能となる。従って、簡便かつ定量精度の高い生体の定量方法を提供することができる。
本発明は、試料中の複数種の生体の数を検出する方法であって、各生体種に対応した複数の電極を設け、予め各電極の表面にそれぞれの生体種のみと特異的に結合する生体高分子を固定しておき、前記電極間に前記試料を導入し、各生体種と前記生体高分子との結合後に、前記電極間に印加した交流電圧と発生した交流電流の位相差を検出し、該位相差信号から各生体種に対応した正接を求めることを特徴とする（請求項３）。
また、本発明は、試料中の複数種の生体の数を検出する装置であって、各生体種に対応した複数の電極から構成され、予めそれぞれの生体種のみと特異的に結合する生体高分子が各電極の表面に固定された前記電極部と、を有することを特徴とする（請求項７）。
溶液中の微生物測定などにおいては、複数種の微生物の測定を同時に行いたい場合がある。特に、溶液試料が微量で微生物の量も多くない場合には、溶液を稀釈することも難しく、同時に複数種の生体の数を検出する方法が好ましい。本発明は、こうした要請に対応可能な生体の定量方法を提供するもので、各生体種に対応した複数の電極を設け、予め各電極の表面にそれぞれの生体種のみと特異的に結合する生体高分子を固定しておくことによって、１の試料導入により各電極間での印加電圧と負荷電流の位相差を検出して該位相差信号から各生体種に対応した正接を求めることが可能となる。従って、試料中の複数種の生体の数を同時に検出する生体の定量方法を提供することが可能となる。
本発明は、上記生体の定量方法であって、前記生体と特異的に結合して該生体よりも高い誘電率を有する高誘電体を前記試料に混合し、前記生体と前記高誘電体とからなる複合体を形成し、該複合体を含有する試料を前記電極間に導入することを特徴とする（請求項４）。
つまり、特定の生体と、これと特異的に結合する生体高分子およびこれらよりも高い誘電率を有する物質（以下「高誘電体」という。）が結合して複合体を形成した場合、被複合体となった高誘電体の誘電率に変化が生じる。このとき、これらが共存する空間、例えば溶液に一定の電界を形成していれば、電界にそれに相応する変化が生じることになる。従って、この電界変化量を検出すれば、高誘電体と結合した特定の生体の量を検出することができる。本発明者はこうした高誘電体の存在によって、特定の生体の量を迅速かつ精度よく検出することができることを見出したもので、試料中の特定の生体と特異的に結合する生体高分子を選定することで、非常に選択性の高い検出方法または検出装置を形成することが可能となる。また、こうした結合反応は、特殊な作業を必要とせず、かつ、非常に迅速性の高いことから、リアルタイムに近い迅速性を備え、誰でも特定の生体を簡便かつ定量的に検出することが可能な生体の定量方法を提供することができる。
本発明は、上記生体の定量方法であって、前記位相差の大きさあるいは前記電極間のインピーダンスの大きさに対応して前記電極間に印加する交流電圧の周波数を変更することを特徴とする（請求項５）。
生体における誘電率の変化は、印加される交流電圧の周波数によって変化することが知られている。本発明者は、特定の周波数においては生体の数と位相差の大きさあるいはインピーダンスとが非常に良い相関関係にあることを見出した。特に、誘電率が高いほどこうした傾向が顕著であることを見出した。本発明は、こうした生体の「周波数特性」といえる特性を利用し、位相差の大きさあるいは電極間のインピーダンスの大きさに対応して印加電圧の周波数を変更することによって、高感度、高精度の生体検出を行うことを可能とし、簡便かつ定量的に検出することが可能な生体の定量方法を提供することができる。
以上のように、本発明の生体の定量方法あるいは生体の定量装置によれば、高い迅速性を備え、特定の生体を簡便に検出する、生体の定量方法および定量装置を提供することができる。特に、生菌などのように、従来非常に特殊な方法で時間を掛けて行ってきた微生物の検出などには、非常に優れた検出機能を発揮することができる。
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
＜本発明に係る生体の定量装置の基本的な構成＞
本発明に係る生体の定量装置の基本的な構成を、図１に例示する（第１構成例）。１は試料が導入される検出セル部を示し、所定の間隔を有する２つの電極２ａ，２ｂからなる電極部２と該電極２ａ，２ｂ間に試料を導入する流路３によって構成される。４は試料中の生体数を検出する測定部を示し、前記検出セル部１と、電極部２に一定周波数の交流電圧（印加電圧）Ｖを印加する電源部５と、印加電圧Ｖを測定する交流電圧計６と、電極２ａ，２ｂ間に流れる交流電流（負荷電流）Ｉを測定する交流電流計７とから構成される。交流電圧計６および交流電流計７からの出力は、各々の出力用ゼロクロスコンパレータ８ａ，８ｂを介して位相比較器９に導入される。位相比較器９においては、印加電圧Ｖと負荷電流Ｉの位相を比較して位相差信号を作成して演算処理部１０に送信される。演算処理部１０においては、生体の数の検出に必要な情報の保存を行うとともに、第１演算部１０ａにおいて位相差信号から正接を演算し、第２演算部１０ｂにおいて前記情報を用いて生体数を演算し、記憶部１０ｃにおいてこうした演算結果を記憶する一方、第２演算部１０ｂにおいて演算された結果は、表示部１１に送信され表示される。
本発明に係る生体の定量装置の基本的な構成を、図１に例示する（第１構成例）。１は試料が導入される検出セル部を示し、所定の間隔を有する２つの電極２ａ，２ｂからなる電極部２と該電極２ａ，２ｂ間に試料を導入する流路３によって構成される。４は試料中の生体数を検出する測定部を示し、前記検出セル部１と、電極部２に一定周波数の交流電圧（印加電圧）Ｖを印加する電源部５と、印加電圧Ｖを測定する交流電圧計６と、電極２ａ，２ｂ間に流れる交流電流（負荷電流）Ｉを測定する交流電流計７とから構成される。交流電圧計６および交流電流計７からの出力は、各々の出力用ゼロクロスコンパレータ８ａ，８ｂを介して位相比較器９に導入される。位相比較器９においては、印加電圧Ｖと負荷電流Ｉの位相を比較して位相差信号を作成して演算処理部１０に送信される。演算処理部１０においては、生体の数の検出に必要な情報の保存を行うとともに、第１演算部１０ａにおいて位相差信号から正接を演算し、第２演算部１０ｂにおいて前記情報を用いて生体数を演算し、記憶部１０ｃにおいてこうした演算結果を記憶する一方、第２演算部１０ｂにおいて演算された結果は、表示部１１に送信され表示される。
このような構成において、所定の間隔を有する電極２ａ，２ｂ間に試料を導入し、電極２ａ，２ｂ間に一定周波数の交流電圧Ｖを印加した条件下で、印加電圧Ｖと負荷電流Ｉの位相差を検出して該位相差信号から正接を求めることによって、予め得られた正接と特定の生体の数との関係から、前記試料中の特定の生体の数を演算することができる。
ここで、検出セル部１においては、以下の通り、印加電圧Ｖと負荷電流Ｉの位相差を検出して該位相差信号から正接を求めることができる。
（ａ）検出セル部１内に置かれた電極２ａ，２ｂ間の負荷インピーダンスＺは、周波数をωとすると、下式（１）のように、
Ｚ（ω）＝ｒ（ω）−ｊｘ（ω）＝｜Ｚ｜ｅ−ｊθ・・・（式１）
で表すことができる。
ここに、｜Ｚ｜＝√（ｒ２＋ｘ２）で、θは実数部ｒと虚数部ｘのなす角度である。
Ｚ（ω）＝ｒ（ω）−ｊｘ（ω）＝｜Ｚ｜ｅ−ｊθ・・・（式１）
で表すことができる。
ここに、｜Ｚ｜＝√（ｒ２＋ｘ２）で、θは実数部ｒと虚数部ｘのなす角度である。
（ｂ）次に、印加電圧Ｖを、Ｖ＝Ｅｅｊωｔとすると、負荷電流Ｉは、下式（２）のように、
Ｉ＝Ｖ／Ｚ（ω）＝（Ｅ／｜Ｚ｜）×ｅｊ（ωｔ−θ）・・・（式２）
となる。なお、Ｅは交流電圧の振幅である。
Ｉ＝Ｖ／Ｚ（ω）＝（Ｅ／｜Ｚ｜）×ｅｊ（ωｔ−θ）・・・（式２）
となる。なお、Ｅは交流電圧の振幅である。
（ｃ）以上のことを、図２（Ａ）を用いて表すと、印加電圧Ｖは、ゼロクロスコンパレータ８ａを通すと、一定周期のＯＮ−ＯＦＦ信号として電圧位相信号を得ることができ、同様に、負荷電流Ｉは、ゼロクロスコンパレータ８ａを通すと、一定周期のＯＮ−ＯＦＦ信号として電流位相信号を得ることができる。これらの信号を位相比較器９に通すと、電圧位相信号と電流位相信号のＯＮ−ＯＦＦの時間的ズレ、つまり位相差信号を得ることができる。つまり、印加電圧Ｖと負荷電流Ｉの交流波形の位相差がθとなり、インピーダンスＺを測定せずに、正接ｔａｎθを容易に求めることができ、位相差θの信号を得ることができる。
（ｄ）ここで、試料中に生体が存在することによって、上記負荷インピーダンスＺが変化する。つまり、図１に示す検出セル部１は、電気的には図２（Ｂ）のような回路と等価であり電極２ａ，２ｂ間に等価抵抗Ｒおよび等価容量成分Ｃが存在するものとみなすことができる。電極２ａ，２ｂ間に一定の交流電圧Ｖを印加すると、試料中の溶液成分よりも高い誘電率を有する物質が存在しない状態では、その間での負荷インピーダンスＺは、試料中の溶液成分に依存しほぼ一定となる。しかしながら、溶液よりも高い誘電率を有する微生物を含む試料が電極２ａ，２ｂ間に存在すると容量成分Ｃが変化し、その結果、負荷インピーダンスＺが変化する。こうした変化量を検出することで、生体数を検出することができる。
（ｅ）すなわち、印加電圧Ｖが一定であることから、電極２ａ，２ｂ間に容量変化が生じる生体が存在することによって、負荷電流Ｉとの位相差θが変化し、正接ｔａｎθが変化する。従って、その変化量Δｔａｎθは、電極２ａ，２ｂ間に存在する生体数ｎと下式（３）のような一定の関係を有することから、
Δｔａｎθ＝ｆ（ｎ）・・・（式３）
予め生体数ｎと正接ｔａｎθあるいはその変化量Δｔａｎθの関係（式３の関係）を求めておくことによって、試料検出時の正接ｔａｎθあるいはその変化量Δｔａｎθから、試料中の生体数ｎを求めることができる。
Δｔａｎθ＝ｆ（ｎ）・・・（式３）
予め生体数ｎと正接ｔａｎθあるいはその変化量Δｔａｎθの関係（式３の関係）を求めておくことによって、試料検出時の正接ｔａｎθあるいはその変化量Δｔａｎθから、試料中の生体数ｎを求めることができる。
このとき、電極部２ａ，２ｂは、銅、金、白金あるいは炭素などで構成することが可能である。また、図１では、２つの電極部２ａ，２ｂを微小な空間を介して並列配置したタイプの検出セル部１を例示しているが、電極はこうした構造に限定されるものではない。具体的には、図３（Ａ）に示すような、平面検出セル部１の両側に板状の電極２ａ，２ｂを配した構造や、図３（Ｂ）に示すような、櫛歯状の電極２ａ，２ｂを平面検出セル部１に配した構造などが挙げられる。電極２ａ，２ｂ間の距離は、試料の条件によって異なるが、電極の絶縁性や溶液の流通性などを考慮すると、０．１〜１ｍｍ程度が好適である。
また、このとき電極に印加する交流電圧は、試料の条件によって異なるが、水溶液などの比誘電率（２０℃で８０．１）、周囲温度や湿度などの外部要因による影響あるいは検出回路での誘導や電磁場などの影響を考慮すると、振幅０．０１〜１０Ｖ、周波数１００Ｈｚ〜１００ＭＨｚが好ましい。より好ましくは、周波数１ｋＨｚ〜１５ＭＨｚの領域が好適である。かかる範囲を下回る範囲あるいは超える周波数の場合、菌数が少ないと位相差が小さく測定精度が悪くなる場合がある。具体的には、菌腫や生菌数によって異なるが、例えば、虫歯原因菌の場合には、１０４、１０５、１０６個の範囲でカリエリスクの大小を判断することから、さらに１ｋＨｚ〜１００ｋＨｚでの測定が好ましい。
このとき、検出された位相差θの大きさあるいは電極２ａ，２ｂ間のインピーダンスＺの大きさに対応して、電極２ａ，２ｂ間に印加する交流電圧Ｖの周波数を変更することも可能である。後述する実施例において明らかなように、特定の周波数において、生体の数と相差の大きさあるいはインピーダンスとが非常に良い相関関係を有し、誘電率が高いほどこうした傾向が顕著であるという、生体の「周波数特性」といえる特性を利用することによって、感度の高い、高精度の生体の定量を行うことができる。
また、試料を導入する流路３の容量は、準備可能な試料の量に依存し、特に限定されるものではないが、例えば、虫歯原因菌の場合には、口腔内の唾液の量やプラークの量などを考慮すると、数μＬ〜数ｍＬ程度が適当である。
なお、本構成例においては、位相の検知手段として、出力用ゼロクロスコンパレータ８ａ，８ｂを用いた場合を例示しているが、位相の検知手段はこれに限定されるものではなく、波形のピーク点やピークの５０％中心点の検知などによって、位相を特定することが可能である。電極２ａ，２ｂ間における誘導などによって波形にランダムノイズあるいはスパイクノイズなどが重畳する可能性がある場合に、より正確な位相検知が可能となる。また、他のデジタルオシロスコープなどで用いられるように、電圧波形と電流波形をＡＤ変換器でデジタルデータに変換後、演算処理部１０において演算し位相差もしくは正接を得る方法を採ることも可能である。さらに、オシロスコープやシンクロスコープの画面上の電圧波形と電流波形から位相差を直読する方法も可能である。
なお、電極２ａ，２ｂと交流電圧計６あるいは交流電流計７は、検出セル部１上に組み込むことが可能である。また、出力用ゼロクロスコンパレータ８ａ，８ｂや位相比較器９あるいは演算処理部１０は、機能面で分離する構成を例示しているが、１つの回路あるいは１つの処理手段として纏めること、または同様の機能を異なる構成で実現することも可能である。さらに、各部の接続は通常有線（コネクタ等）で行われるが、無線等で接続することも可能である。また、記録、記憶、外部との交信部において、必要に応じて印字記録、データベースへの記憶、外部の装置への転送が行われる。
＜本発明に係る生体の定量装置の他の構成例＞
次に、図４に、本発明に係る生体の定量装置の他の構成例を例示する（第２構成例）。基本的には、上記第１構成例と同様の構成であるが、電極２ｂの表面に、予め検出対象となる生体のみと特異的に結合する生体高分子Ａを固定しておき、電極２ａ，２ｂ間に試料を導入することを特徴とする。
次に、図４に、本発明に係る生体の定量装置の他の構成例を例示する（第２構成例）。基本的には、上記第１構成例と同様の構成であるが、電極２ｂの表面に、予め検出対象となる生体のみと特異的に結合する生体高分子Ａを固定しておき、電極２ａ，２ｂ間に試料を導入することを特徴とする。
例えば、唾液中のう触原因菌の菌数測定のように、唾液中のイオン濃度が高い試料溶液の場合には、試料溶液のイオンの存在によってインピーダンスＺが変化する。従って、イオン濃度の変化が大きい場合には、印加電圧Ｖと負荷電流Ｉの位相差θに対する測定誤差を生じることがある。本構成においては、電極２ｂの表面に、予め生体のみと特異的に結合する生体高分子Ａを固定しておき、電極２ａ，２ｂ間に前記試料を導入することによって、電極２ｂ表面に測定対象である生体を固定することが可能となる。すなわち、測定したい菌は特異抗体と結合しているので、イオン交換水などで溶液を置換し、試料溶液のインピーダンスに影響しない測定に適した条件で菌数を測定することが可能となる。このように、試料溶液に所定の脱塩処理を施し、予め得られた生体の数の検出に必要な情報と同じ溶液組成で測定可能な条件にすることによって、予め得られた正接と特定の生体の数との関係を用いて精度の高い測定が可能となる。
ここで、生体と特異的に結合する生体高分子Ａとは、こうした生体と、いわゆるカギによって結合しうる対象物との関係にあるものをいい、選択性および検出感度を考慮して設定される。具体的には、たんぱく質−たんぱく質間、薬剤−レセプター間、抗原−抗体間、ＤＮＡ／ＲＮＡ−たんぱく質間、ＤＮＡ−ＤＮＡ間、細胞−たんぱく質間などを含む。また、抗体としては、検出対象となる生体の種類に対応し、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を問わず、任意に選択可能である。
具体的に、電極表面に生体高分子として抗体Ａを固定した上記の検出装置を用い、生体である唾液内の生菌Ｌを検出する場合の検出手順を、図５に例示する。
（１）予め電極２ｂに検出する生菌Ｌと反応する抗体（生体高分子）Ａを担持する。
（２）試料を流路３に導入する。唾液の場合には、菌の表面がグルカンで覆われており、十分な数だけの抗原抗体反応を得るために、予め試料にグルカン破壊酵素を混ぜておくことが好ましい。
（３）唾液内の生菌Ｌが、抗原抗体反応により電極２ｂ上の抗体Ａに結合する。このとき、試料をスルーフローによって検出する場合には、抗体Ａとの結合能力のない菌種は、流路３を通過し検出セル部１から排出される。
（４）未反応の菌を洗浄する。唾液のイオン濃度が高いときは同時に脱塩を行う。これによって、試料の前処理が完了する。
（５）電極部２に交流電圧を印加し、位相差θを測定する。
（６）測定された位相差θから、生菌Ｌの数を演算する。演算手段等は、図１の検出装置における構成と同様である。
（１）予め電極２ｂに検出する生菌Ｌと反応する抗体（生体高分子）Ａを担持する。
（２）試料を流路３に導入する。唾液の場合には、菌の表面がグルカンで覆われており、十分な数だけの抗原抗体反応を得るために、予め試料にグルカン破壊酵素を混ぜておくことが好ましい。
（３）唾液内の生菌Ｌが、抗原抗体反応により電極２ｂ上の抗体Ａに結合する。このとき、試料をスルーフローによって検出する場合には、抗体Ａとの結合能力のない菌種は、流路３を通過し検出セル部１から排出される。
（４）未反応の菌を洗浄する。唾液のイオン濃度が高いときは同時に脱塩を行う。これによって、試料の前処理が完了する。
（５）電極部２に交流電圧を印加し、位相差θを測定する。
（６）測定された位相差θから、生菌Ｌの数を演算する。演算手段等は、図１の検出装置における構成と同様である。
＜本発明に係る生体の定量装置の第３の構成例＞
次に、図６に、本発明に係る生体の定量装置の第３の構成例を例示する。上記第２構成例をさらに応用した構成であって、複数の生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃ・・を含む試料中の各生体数を検出する場合に有用である。予め複数の生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃ・・のそれぞれとのみと特異的に結合する生体高分子Ａａ、Ａｂ、Ａｃ・・を表面に固定した複数の電極２１ｂ，２２ｂ，２３ｂ・・を有する電極部２を構成することを特徴とする。図６では生体を３種類とし、３つの対応する生体高分子および３つのこれらを固定する電極を用いる場合を示している。
次に、図６に、本発明に係る生体の定量装置の第３の構成例を例示する。上記第２構成例をさらに応用した構成であって、複数の生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃ・・を含む試料中の各生体数を検出する場合に有用である。予め複数の生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃ・・のそれぞれとのみと特異的に結合する生体高分子Ａａ、Ａｂ、Ａｃ・・を表面に固定した複数の電極２１ｂ，２２ｂ，２３ｂ・・を有する電極部２を構成することを特徴とする。図６では生体を３種類とし、３つの対応する生体高分子および３つのこれらを固定する電極を用いる場合を示している。
なお、ここでは、電極部２を共通の電極２ａと各生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃに対応した電極２１ｂ，２２ｂ，２３ｂとによって構成される場合を示しているが、後述する図７のように、電極２ａを各々絶縁された電極２１ａ，２２ａ，２３ａとして構成することも可能である。
試料中の複数種の微生物の測定を同時に行いたい場合に、各生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃに対応した複数の電極対２ａと２１ｂ，２ａと２２ｂ，２ａと２３ｂを設け、予め各電極２１ｂ，２２ｂ，２３ｂの表面にそれぞれの生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃのみと特異的に結合する生体高分子Ａａ、Ａｂ、Ａｃを固定しておくことによって、少量の溶液試料を導入により各電極２ａと２１ｂ，２ａと２２ｂ，２ａと２３ｂ間での印加電圧Ｖａ，Ｖｂ，Ｖｃと負荷電流Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃの位相差θａ，θｂ，θｃを検出して該位相差信号から各生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃに対応した正接ｔａｎθａ，ｔａｎθｂ，ｔａｎθｃを求めることが可能となる。従って、演算された正接ｔａｎθａ，ｔａｎθｂ，ｔａｎθｃを用い、予め得られた正接と各生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃの数との関係を基に、各生体種Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃの数を算出することが可能となる。
図７は、電極表面に生体高分子として抗体ＡａおよびＡｂを固定した上記の検出装置を用い、生体である唾液内の生菌ＬａおよびＬｂを検出する場合の検出手順を示している。予め電極２１ｂおよび２２ｂに、検出する生菌ＬａおよびＬｂと反応する抗体（生体高分子）ＡａおよびＡｂを担持する。
（１）検出セル部１の流路３に、互いに絶縁された測定電極を、検出する生体の数だけ形成する。図７では、検出セル部１の流路に、電極２１ａおよび２１ｂの組合せと電極２２ａおよび２２ｂの組合せを直列に配した場合を例示する。
また、それぞれの電極２１ｂおよび２２ｂに検出する生体と反応する抗体ＡａおよびＡｂを担持する。図７では、生菌ＬａおよびＬｂの抗体ＡａおよびＡｂである。
（２）試料をこの流路に導入する。唾液の場合の処理は上記と同様である。
（３）試料中の生菌ＬａおよびＬｂが抗原抗体反応により電極上の抗体ＡａおよびＡｂに結合する。このとき、試料をスルーフローによって検出する場合には、対応する抗体のない菌種Ｌｃは結合することができずに、検出セル部１を通過する。
（４）未反応の菌を洗浄する。唾液のイオン濃度が高いときは同時に脱塩を行う。これによって、試料の前処理が完了する。
（５）電極部２に交流電圧を印加し位相差θを測定する。図７では、電源部５、交流電圧計６および交流電流計７を各１つ設け、測定電極ごとに交流電圧の印加を切り替える構成を例示する。電源部５と電極２１ｂまたは電極２２ｂとの接続ラインをスイッチ９で切り替えて、それぞれの位相差θａおよびθｂを測定する。
（６）測定された位相差θａおよびθｂから、それぞれの生菌Ｌａの数および生菌Ｌｂの数を演算する。演算手段等は、図１の検出装置における構成と同様である。
（１）検出セル部１の流路３に、互いに絶縁された測定電極を、検出する生体の数だけ形成する。図７では、検出セル部１の流路に、電極２１ａおよび２１ｂの組合せと電極２２ａおよび２２ｂの組合せを直列に配した場合を例示する。
また、それぞれの電極２１ｂおよび２２ｂに検出する生体と反応する抗体ＡａおよびＡｂを担持する。図７では、生菌ＬａおよびＬｂの抗体ＡａおよびＡｂである。
（２）試料をこの流路に導入する。唾液の場合の処理は上記と同様である。
（３）試料中の生菌ＬａおよびＬｂが抗原抗体反応により電極上の抗体ＡａおよびＡｂに結合する。このとき、試料をスルーフローによって検出する場合には、対応する抗体のない菌種Ｌｃは結合することができずに、検出セル部１を通過する。
（４）未反応の菌を洗浄する。唾液のイオン濃度が高いときは同時に脱塩を行う。これによって、試料の前処理が完了する。
（５）電極部２に交流電圧を印加し位相差θを測定する。図７では、電源部５、交流電圧計６および交流電流計７を各１つ設け、測定電極ごとに交流電圧の印加を切り替える構成を例示する。電源部５と電極２１ｂまたは電極２２ｂとの接続ラインをスイッチ９で切り替えて、それぞれの位相差θａおよびθｂを測定する。
（６）測定された位相差θａおよびθｂから、それぞれの生菌Ｌａの数および生菌Ｌｂの数を演算する。演算手段等は、図１の検出装置における構成と同様である。
＜本発明に係る生体の定量方法の他の態様＞
上記の構成例による実施態様においては、試料中の生体をそのまま検出セル部の流路に導入する場合を説明した。しかし、試料の条件によっては、試料に所定の処理を行うことが好ましい場合がある。例えば、試料中の生体の濃度が低い場合で生体の濃縮が困難な場合、あるいは生体の誘電率が試料溶媒の誘電率に近い場合などにおいては、生体と特異的に結合して該生体よりも高い誘電率を有する高誘電体を試料に混合し、生体と生体高分子および高誘電体とからなる複合体を含む試料中に形成し、インピーダンスを測定することも可能である。
上記の構成例による実施態様においては、試料中の生体をそのまま検出セル部の流路に導入する場合を説明した。しかし、試料の条件によっては、試料に所定の処理を行うことが好ましい場合がある。例えば、試料中の生体の濃度が低い場合で生体の濃縮が困難な場合、あるいは生体の誘電率が試料溶媒の誘電率に近い場合などにおいては、生体と特異的に結合して該生体よりも高い誘電率を有する高誘電体を試料に混合し、生体と生体高分子および高誘電体とからなる複合体を含む試料中に形成し、インピーダンスを測定することも可能である。
つまり、高誘電体の複合体を含む試料を検出セル部に導き、電極部間に交流電圧を印加し、そのときの負荷電流との位相差を測定する。このときの位相差は、試料中の生体の数に対応した値となることから、予め生体の数と位相差つまり正接との相関関係を求めておいて、実測した正接からを試料中の生体の数を演算・算出することができる。
ここで、高誘電体とは、本発明では、広く生体や生体と特異的に結合する生体高分子あるいはこれらの結合体よりも高い誘電率を有する物質をいい、具体的には、金、チタン酸バリウム、酸化タンタル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、グリシン硫酸などが挙げられる。特に、チタン酸バリウムや五酸化タンタルは、誘電率が非常に高い点や物質の取扱いも容易であることから、本発明のような生体の検出には好ましい。
以下、具体的実施例により本発明をさらに説明する。なお、本発明がかかる実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
＜検出装置の構成＞
（１）検出セル部
検出セル部における電極部は、図３（Ａ）に例示した構成を用い、奥行きが１０ｍｍ、上部電極と下部電極の間に５ｍｍの間隔をおいて、厚さ０．５ｍｍのスペーサを挟み込み、電極間の被測定溶液２５μＬを注入できるようにした。
（２）測定部
位相差θの測定は、横河ヒューレットパッカード社製（４９１４ＡＩｍｐｅｄａｎｃｅ／Ｇａｉｎ−Ｐｈａｓｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用い、測定端子を直接電極に接続して行った。測定周波数１００〜１５ＭＨｚ、印加電圧は０．０５Ｖに設定した。
（１）検出セル部
検出セル部における電極部は、図３（Ａ）に例示した構成を用い、奥行きが１０ｍｍ、上部電極と下部電極の間に５ｍｍの間隔をおいて、厚さ０．５ｍｍのスペーサを挟み込み、電極間の被測定溶液２５μＬを注入できるようにした。
（２）測定部
位相差θの測定は、横河ヒューレットパッカード社製（４９１４ＡＩｍｐｅｄａｎｃｅ／Ｇａｉｎ−Ｐｈａｓｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用い、測定端子を直接電極に接続して行った。測定周波数１００〜１５ＭＨｚ、印加電圧は０．０５Ｖに設定した。
＜原因菌の培養調製＞
（１）生体の準備
検出対象となる生体として原因菌を選定した。具体的には、口腔内細菌のＳ.Ｓｏｒｂｉｎｕｓ菌およびＳ．Ｍｕｔａｎｓ菌とした。
（２）原因菌の培養
本実施例に用いる原因菌の培養を所定の培地を用いて行い、菌数測定を実施した。原因菌は２５時間の培養で、１０6ｃｆｕ／ｍＬまで増加することが、寒天プレート法により確認できた。またＯＤ６００と、寒天プレート法の相関も示された。
（１）生体の準備
検出対象となる生体として原因菌を選定した。具体的には、口腔内細菌のＳ.Ｓｏｒｂｉｎｕｓ菌およびＳ．Ｍｕｔａｎｓ菌とした。
（２）原因菌の培養
本実施例に用いる原因菌の培養を所定の培地を用いて行い、菌数測定を実施した。原因菌は２５時間の培養で、１０6ｃｆｕ／ｍＬまで増加することが、寒天プレート法により確認できた。またＯＤ６００と、寒天プレート法の相関も示された。
＜原因菌の菌体液の前処理＞
（１）培養した原因菌を蒸留水で１０５、２×１０５、１０６ｃｆｕ／ｍＬに段階希釈した試料を用い、脱塩処理を実施した。
（２）培養菌液（１０５、２×１０５、１０６ｃｆｕ／ｍＬ）０．２２μをエッペンドルフチューブ型フィルターに添加し、１０ｋｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心処理する。
（３）菌体に、蒸留水を５００μＬ添加し、１０ｋｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心処理する。
（１）培養した原因菌を蒸留水で１０５、２×１０５、１０６ｃｆｕ／ｍＬに段階希釈した試料を用い、脱塩処理を実施した。
（２）培養菌液（１０５、２×１０５、１０６ｃｆｕ／ｍＬ）０．２２μをエッペンドルフチューブ型フィルターに添加し、１０ｋｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心処理する。
（３）菌体に、蒸留水を５００μＬ添加し、１０ｋｒｐｍ、５ｍｉｎで遠心処理する。
＜金コロイド抗体−原因菌の菌体複合体の調製＞
（１）金コロイドを誘導体として用い、蒸留水によって希釈し、３０ｐｐｍ濃度の金コロイド溶液を作製した。
（２）金コロイド溶液に、金コロイドと原因菌の抗体が１：１（容量）になるように原因菌の抗体を添加し、金コロイド抗体溶液を作製した。
（３）金コロイド抗体と原因菌の菌液を室温で反応させ、抗体抗原複合体を作製した。具体的には、蒸留水に懸濁した菌体液について、金コロイド抗体溶液と懸濁した。その後、室温に３０分放置し、菌体複合体とした。
（１）金コロイドを誘導体として用い、蒸留水によって希釈し、３０ｐｐｍ濃度の金コロイド溶液を作製した。
（２）金コロイド溶液に、金コロイドと原因菌の抗体が１：１（容量）になるように原因菌の抗体を添加し、金コロイド抗体溶液を作製した。
（３）金コロイド抗体と原因菌の菌液を室温で反応させ、抗体抗原複合体を作製した。具体的には、蒸留水に懸濁した菌体液について、金コロイド抗体溶液と懸濁した。その後、室温に３０分放置し、菌体複合体とした。
＜原因菌の菌体液のインピーダンス測定＞
（１）測定のたびごとにマイクロディスペンサにて被測定溶液３０μＬをとり本電極間の間隙に注入し、測定終了後には溶液を吸い取り、純水もしくはイオン交換水にて数回洗浄した後に次の実験に移行した。
（２）図８に、Ｓ．Ｓｏｒｂｉｎｕｓ菌の測定結果を、周波数をパラメータとして示す。周波数が１ｋＨｚ以下であると菌数と正接はほぼリニアな関係にあり、測定周波数が高くなるに従い菌数が少なくなるとフラットな特性を示すようになる。これは細菌内に電流が流れるようになり、インピーダンスが低下し溶液のそれに近づくためと考えられ（R.Pethig，D.B.Kell，the passive electrical properties of biological systems：their significances in physiology, biophysics and biotechnology, Phys. Med. Biolo. 1987, Vol 32, No.8, 933-970）、菌数が少ないときは溶液のインピーダンスによる正接を示すようになると考えられる。菌数が少ない状態でも測定できるためには、周波数を数ｋＨｚ以内にする必要があるが、この程度であれば電流検出回路による位相のズレが問題にならない（トランス結合などにおける）ので、実験に用いたような高価な測定器は不要で、より安価な測定系を組むことが可能となる。
（３）図９に、Ｓ．Ｍｕｔａｎｓ菌の測定結果を、導電率もしくは高誘電率系の粒子で修飾した抗体と反応させた場合の例として、金コロイド修飾体と結合させたものと比較して示す。結果的には、切片の差があるが、グラフの傾きは逆に大きく、却って菌数に対する分解能が大きいので、生菌のみで十分に測定できることが分かる。
（１）測定のたびごとにマイクロディスペンサにて被測定溶液３０μＬをとり本電極間の間隙に注入し、測定終了後には溶液を吸い取り、純水もしくはイオン交換水にて数回洗浄した後に次の実験に移行した。
（２）図８に、Ｓ．Ｓｏｒｂｉｎｕｓ菌の測定結果を、周波数をパラメータとして示す。周波数が１ｋＨｚ以下であると菌数と正接はほぼリニアな関係にあり、測定周波数が高くなるに従い菌数が少なくなるとフラットな特性を示すようになる。これは細菌内に電流が流れるようになり、インピーダンスが低下し溶液のそれに近づくためと考えられ（R.Pethig，D.B.Kell，the passive electrical properties of biological systems：their significances in physiology, biophysics and biotechnology, Phys. Med. Biolo. 1987, Vol 32, No.8, 933-970）、菌数が少ないときは溶液のインピーダンスによる正接を示すようになると考えられる。菌数が少ない状態でも測定できるためには、周波数を数ｋＨｚ以内にする必要があるが、この程度であれば電流検出回路による位相のズレが問題にならない（トランス結合などにおける）ので、実験に用いたような高価な測定器は不要で、より安価な測定系を組むことが可能となる。
（３）図９に、Ｓ．Ｍｕｔａｎｓ菌の測定結果を、導電率もしくは高誘電率系の粒子で修飾した抗体と反応させた場合の例として、金コロイド修飾体と結合させたものと比較して示す。結果的には、切片の差があるが、グラフの傾きは逆に大きく、却って菌数に対する分解能が大きいので、生菌のみで十分に測定できることが分かる。
上記生体の定量方法および生体の定量装置は、微生物、特に虫歯の原因菌などの菌類について、唾液等の溶液試料を主に説明したが、試料はこうした性状に限定されるものではなく、固形物に含有された状態あるいは気中に浮遊した状態であっても、試料採取後に処理し、検出セルに導入できる状態にすれば同様に検出可能である。また、生体についても、測定時に生きている必要もなく、誘電率の変化を伴う手段が可能な物質であれば、検出対象とすることが可能である。
１ 検出セル部
２ 電極部
２ａ，２ｂ，２１ａ，２１ｂ，２２ａ，２２ｂ，２３ａ，２３ｂ 電極
３ 流路
４ 測定部
５ 電源部
６ 交流電圧計
７ 交流電流計
８ａ，８ｂ ゼロクロスコンパレータ
１０ 演算処理部
１１ 表示部
Ａ，Ａａ，Ａｂ，Ａｃ 生体高分子（抗体）
Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ 交流電流（負荷電流）
Ｌ，Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃ 生菌
Ｖ，Ｖａ，Ｖｂ，Ｖｃ 交流電圧（印加電圧）
Ｚ 負荷インピーダンス
θ，θａ，θｂ，θｃ 位相差
ｔａｎθ，ｔａｎθａ，ｔａｎθｂ，ｔａｎθｃ 正接
２ 電極部
２ａ，２ｂ，２１ａ，２１ｂ，２２ａ，２２ｂ，２３ａ，２３ｂ 電極
３ 流路
４ 測定部
５ 電源部
６ 交流電圧計
７ 交流電流計
８ａ，８ｂ ゼロクロスコンパレータ
１０ 演算処理部
１１ 表示部
Ａ，Ａａ，Ａｂ，Ａｃ 生体高分子（抗体）
Ｉ，Ｉａ，Ｉｂ，Ｉｃ 交流電流（負荷電流）
Ｌ，Ｌａ，Ｌｂ，Ｌｃ 生菌
Ｖ，Ｖａ，Ｖｂ，Ｖｃ 交流電圧（印加電圧）
Ｚ 負荷インピーダンス
θ，θａ，θｂ，θｃ 位相差
ｔａｎθ，ｔａｎθａ，ｔａｎθｂ，ｔａｎθｃ 正接
Claims (4)
- 試料中の特定の生体の数を検出する方法であって、所定の間隔を有する電極の表面に、予め前記生体のみと特異的に結合する生体高分子を固定しておき、前記電極間に試料を導入し、生体と生体高分子との結合後に、イオン交換水で試料溶液を置換した後、該電極間に一定周波数の交流電圧を印加した条件下で、前記電極間に印加した交流電圧と発生した交流電流の位相差を検出して該位相差信号から正接を求めるとともに、予め得られた正接と特定の生体の数との関係から、前記試料中の特定の生体の数を演算することを特徴とする生体の定量方法。
- 前記生体は、複数種であり、
前記電極は、各生体種に対応した複数の電極であり、且つ、予め各電極の表面にそれぞれの生体種のみと特異的に結合する生体高分子が固定されており、
前記電極間に前記試料を導入し、各生体種と前記生体高分子との結合後に、イオン交換水で試料溶液を置換した後、前記電極間に印加した交流電圧と発生した交流電流の位相差を検出し、該位相差信号から各生体種に対応した正接を求めることを特徴とする請求項１記載の生体の定量方法。 - 前記生体と特異的に結合して該生体よりも高い誘電率を有する高誘電体を前記試料に混合し、前記生体と前記高誘電体とからなる複合体を形成し、該複合体を含有する試料を前記電極間に導入することを特徴とする請求項１又は２に記載の生体の定量方法。
- 前記位相差の大きさあるいは前記電極間のインピーダンスの大きさに対応して前記電極間に印加する交流電圧の周波数を変更することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体の定量方法。
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