CN104713932B - 一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪 - Google Patents

Abstract

一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，包括纳米孔检测池，纳米孔检测池的两支电极和电流放大系统的探头连接，交流信号发生系统输出和电流放大系统输入连接，电流放大系统的电位输出和锁相放大系统的电位入口连接，电流放大系统的电流输出通过滤波系统和锁相放大系统的电流入口连接，锁相放大系统的电位、电流、振幅、相位出口分别和多通道数据同步采集系统的相应接口连接，多通道数据同步采集系统和计算机显示及分析系统连接，本发明可以对穿过纳米孔的单个分子引起的直流组分电流、交流组分振幅、相位差、阻抗变化等诸多参数进行检测，提高纳米孔测量的选择性，可应用于多种生物大分子和药物分子的筛选和分析检测。

Description

一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪

技术领域

本发明涉及纳米孔单分子分析技术领域，具体涉及一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪。

背景技术

纳米孔单分子分析技术是以纳米孔为分析元件，施加恒电位来测量目标物通过纳米孔通道时离子电流的变化而建立的分析方法。目前应用较多的纳米孔材料有：α-溶血素，MspA和phi29为主的蛋白纳米孔(直径为1-3纳米)以及基于无机材料(硅和氮化硅,氧化铝，玻璃等)，高分子聚合物和碳纳米管、石墨烯等人工固体纳米通道(直径为几十到几百纳米)。纳米孔技术在DNA测序、单分子检测及单分子化学反应机制研究等方面有着巨大的应用价值，其应用范围覆盖了化学、生物、医学、国防、空间探索和食品安全等诸多领域。近五年来，Science和Nature及其子刊杂志已发表纳米孔相关研究论文与评述文章30余篇。纳米孔单分子分析技术是当前世界发展的重要前沿研究领域之一，受到国际科学界和高技术仪器公司的广泛关注和重视。

目前，纳米孔技术的测量方式以恒电位法为主，采用直流恒电位模式来记录离子的电导电流。分析物在静电力驱动下，进入纳米孔内发生穿孔事件。分析物通过纳米孔引起孔道内部电解质环境的改变而产生脉冲离子电流的变化，其大小和持续时间反映了分析物穿过纳米孔的信息，通过对大量脉冲电流的统计分析可实现对分析物的检测。

然而，施加恒电位测量带来的纳米孔电流变化信号单一，对分析物的选择性低，灵敏度差，无法提供足够丰富的信息来研究分析物穿孔过程中的构象变化和相互作用机制，极大地限制了纳米孔技术的应用。恒电位模式下的纳米孔测量方法有着不可避免的技术局限性。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，可以对穿过纳米孔的单个分子引起的直流组分电流、交流组分振幅、相位差、阻抗变化等诸多参数进行检测，提高纳米孔测量的选择性，应用于多种生物大分子(DNA、RNA、多肽、蛋白等)和药物分子的筛选和分析检测。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，包括纳米孔检测池，纳米孔检测池的两支电极和电流放大系统的探头连接，交流信号发生系统输出和电流放大系统输入连接，电流放大系统的电位输出和锁相放大系统的电位入口连接，电流放大系统的电流输出通过滤波系统和锁相放大系统的电流入口连接，锁相放大系统的电位、电流、振幅、相位出口分别和多通道数据同步采集系统的相应接口连接，多通道数据同步采集系统和计算机显示及分析系统连接；

纳米孔检测池由高绝缘材料制作而成，其内部溶液样品池分为正、反两侧，中间由纳米孔材料隔断，纳米孔选择生物纳米孔(α-溶血素)或固态纳米孔(SiN纳米孔)，两支电极分别浸没于纳米孔两侧的溶液中，溶液中含支持电解质，两支电极同时进行电位施加和纳米孔电流检测，电极为银/氯化银电极；

交流信号发生系统输出正弦交流信号，通过电流放大系统在电极之间施加交流电势；

电流放大系统实时同步采集电极记录的电位和电流信号，通过放大电路进行信号放大，并同时输出电位、电流模拟信号；

滤波系统采用贝塞尔滤波器，电流放大系统输出的电流信号进入滤波系统,通过对滤波系统设置截止频率，对电流的频率进行低通滤过，即只通过截止频率以下的信号，将滤出的信号输出至锁相放大系统；

锁相放大系统接收电位、电流模拟信号，通过相敏检波，实时输出振幅和相位差信号；

多通道数据同步采集系统接收电位、电流、振幅、相位差信号，并同步输出至计算机显示及分析系统，实现纳米孔多参数信号的同步采集，计算机显示及分析系统根据采集的多参数信号，结合生物物理模型，确定分析样品的特定性质。

所述的多通道数据同步采集系统通过软件进行控制。

所述的交流信号发生系统能够进行一定范围内频率、振幅的调节。

所述的电流放大系统采用精密微电流测试仪，具备实时同步采集电位、电流的功能。

本发明的优点与积极效果：

不同于常用的纳米孔恒电位记录方法，本发明采用分析物穿过纳米孔的直流组分电流阻断时间、阻断幅度，交流组分振幅、相位差、阻抗，以及所施加交流电势的频率、振幅等诸多参数对分析物穿过纳米孔的事件进行评价，可提供更丰富信息。多参数作为分析信号能够有效提高分析的选择性。此外，锁相放大系统的相敏检波功能可选择性检出特定频率的信号，可进一步屏蔽噪声，提高纳米孔检测的信噪比。

附图说明

图1为本发明的结构框图。

图2为本发明在直流电势叠加的交流电势下的分子穿孔信号及各参数示意图。

图3为实施例中实时记录的电流A、交流振幅B、相位差C随时间变化的示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细描述。

如图1所示，一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，采用模块集成式结构，由具备相应功能且具备兼容性的设备搭建而成，具体包括纳米孔检测池，纳米孔检测池的两支电极和电流放大系统的探头连接，交流信号发生系统输出和电流放大系统输入连接，电流放大系统的电位输出和锁相放大系统的电位入口连接，电流放大系统的电流输出通过滤波系统和锁相放大系统的电流入口连接，锁相放大系统的电位、电流、振幅、相位出口分别和多通道数据同步采集系统的相应接口连接，多通道数据同步采集系统和计算机显示及分析系统连接；

纳米孔检测池由高绝缘材料制作而成，其内部溶液样品池分为正、反两侧，中间由纳米孔材料隔断，纳米孔选择生物纳米孔(α-溶血素)或固态纳米孔(SiN纳米孔)，两支电极分别浸没于纳米孔两侧的溶液中，溶液中含支持电解质，两支电极同时进行电位施加和纳米孔电流检测，电极为银/氯化银电极；

交流信号发生系统输出正弦交流信号，通过电流放大系统在电极之间施加交流电势；

电流放大系统实时同步采集电极记录的电位和电流信号，通过放大电路进行信号放大，并同时输出电位、电流模拟信号；

滤波系统采用贝塞尔滤波器，电流放大系统输出的电流信号进入滤波系统,通过对滤波系统设置截止频率，对电流的频率进行低通滤过，即只通过截止频率以下的信号，然后将滤出的信号输出至锁相放大系统；

锁相放大系统接收电位、电流模拟信号，通过相敏检波，实时输出振幅和相位差信号；

多通道数据同步采集系统接收电位、电流、振幅、相位差信号，并同步输出至计算机显示及分析系统，实现纳米孔多参数信号的同步采集，计算机显示及分析系统根据采集的多参数信号，结合生物物理模型，确定分析样品的特定性质。

所述的多通道数据同步采集系统通过软件进行控制。

所述的交流信号发生系统能够进行一定范围内频率、振幅的调节。

所述的电流放大系统采用精密微电流测试仪，具备实时同步采集电位、电流的功能。

如图2所示，图2显示了在直流电势的基础上叠加交流电势的情况下，分子穿孔引起的电流信号，以及阻断时间，阻断电流，交流组分振幅，交流组分相位差的示意图。

下面结合具体实施例对本发明做详细描述。

a.纳米孔的构建：选用α-溶血素作为材料构建纳米孔，选择聚四氟乙烯材料制成的纳米孔检测池，正、反样品池由带直径150微米小孔的聚四氟乙烯板隔开，在样品池中分别加入含1摩尔每升氯化钾的测试溶液后，可在直径150微米的小孔上构建磷脂双分子层，α-溶血素可自发插入磷脂双分子层中形成单个七聚体α-溶血素纳米孔，将两支银/氯化银电极插入正、反检测池的溶液中，电极与电流放大系统的探头相连，反样品池中的电极接地，在电极间施加电位后，记录其单通道电流信号，在记录中，纳米孔及磷脂双分子层保持了良好的稳定性；

b.样品的选择：选用发卡型(Hairpin)结构DNA作为分析样品，将分析样品加入到正检测池中的溶液中，施加一定正电势引发DNA分子穿孔；

c.仪器结构和操作：体系中叠加在直流电势上的交流电势由交流信号发生系统输出正弦交流信号实现。直流电势大小、交流电势的频率、振幅均根据实验需要进行调节。交流信号通过外部电势信号输入接口连接并输入电流放大系统。

电流放大系统通过与探头连接的两支银/氯化银电极，实时同步采集电位和电流信号，通过放大电路进行电流信号的放大，并同时输出测得的电位、电流模拟信号。

滤波系统接收电流放大系统输出的电流信号，根据实验所需设置截止频率，此频率须大于交流电势的频率，以保证不会滤去目标频率下的交流组分信息，滤波系统进行电流信号的低通滤波，即只通过低于截止频率的信号，输出处理后的电流信号传输至锁相放大系统。

锁相放大系统同时接收电位、电流模拟信号，实时输出振幅和相位差信号，实时阻抗信号可根据关系式：|阻抗|＝Δ电势/Δ电流，进行计算得到。

多通道数据同步采集系统的四通道同时接收电位、电流、振幅、相位差信号，并同步输出至计算机显示及分析系统，实现纳米孔多参数信号同步采集。多通道数据同步采集系统通过软件进行控制，振幅、相位差的输出采样率参考所施加的交流频率来确定。

d.仪器测试结果：图3显示了实施例实验中一段实时采集的电流A、交流振幅B、相位差C随时间变化的曲线，实验条件：电极之间施加100毫伏的直流电势，同时叠加振幅为10毫伏，频率为100赫兹的交流电势；滤波系统截止频率设置为5千赫兹；电流的采样率为40千赫兹，振幅和相位差的采样率均为20赫兹。实验中用补偿电路抵消了体系中的一部分电容，以减小交流电流的振幅。DNA与纳米孔相互作用产生的变化在电流A、交流振幅B、相位差C均有明显体现，三组参数显现出良好的时间同步性，其中振幅和相位差具备较高的信噪比。

以上叙述仅为本发明的示范性实施举例，根据本发明的基本方法，分析仪各模块的组成可以有多种变化和组合，它们由本发明的权利要求书加以限定。

Claims (4)

1.一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，包括纳米孔检测池，其特征在于：纳米孔检测池的两支电极和电流放大系统的探头连接，交流信号发生系统输出和电流放大系统输入连接，电流放大系统的电位输出和锁相放大系统的电位入口连接，电流放大系统的电流输出通过滤波系统和锁相放大系统的电流入口连接，锁相放大系统的电位、电流、振幅、相位出口分别和多通道数据同步采集系统的相应接口连接，多通道数据同步采集系统和计算机显示及分析系统连接；

纳米孔检测池由高绝缘材料制作而成，其内部溶液样品池分为正、反两侧，中间由纳米孔材料隔断，纳米孔选择固态纳米孔，两支电极分别浸没于纳米孔两侧的溶液中，溶液中含支持电解质，两支电极同时进行电位施加和纳米孔电流检测，电极为银/氯化银电极；

交流信号发生系统输出正弦交流信号，通过电流放大系统在电极之间施加交流电势；

电流放大系统实时同步采集电极记录的电位和电流信号，通过放大电路进行信号放大，并同时输出电位、电流模拟信号；

滤波系统采用贝塞尔滤波器，电流放大系统输出的电流信号进入滤波系统,通过对滤波系统设置截止频率，对电流的频率进行低通滤波，即只通过截止频率以下的信号，将滤出的信号输出至锁相放大系统；

锁相放大系统接收电位、电流模拟信号，通过相敏检波，实时输出振幅和相位差信号；

多通道数据同步采集系统接收电位、电流、振幅、相位差信号，并同步输出至计算机显示及分析系统，实现纳米孔多参数信号的同步采集，计算机显示及分析系统根据采集的多参数信号，结合生物物理模型，确定分析样品的特定性质。

2.根据权利要求1所述的一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，其特征在于：所述的多通道数据同步采集系统通过软件进行控制。

3.根据权利要求1所述的一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，其特征在于：所述的交流信号发生系统能够进行一定范围内频率、振幅的调节。

4.根据权利要求1所述的一种交流模式的多参数纳米孔单分子分析仪，其特征在于：所述的电流放大系统采用精密微电流测试仪，具备实时同步采集电位、电流的功能。