CN111426849A - 一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法 - Google Patents
一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种测定可溶性总蛋白中14‑3‑3蛋白表达水平的方法，属于电化学分析技术领域。本发明选用导电性良好的碳浆电极，经多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs)复合物修饰丝网印刷碳电极表面，把14‑3‑3蛋白抗体固定于印刷电极表面上，再加入14‑3‑3蛋白检测样品；由于该抗体与14‑3‑3蛋白特异性结合，碳电极能快速识别并捕获样品中的14‑3‑3蛋白，之后再加入14‑3‑3蛋白信号抗体探针，探针上的14‑3‑3抗体能快速识别结合碳电极捕获的14‑3‑3蛋白，制得电流型免疫传感器。信号抗体探针上的CAT酶催化H2O2产生还原氧化反应，通过电化学分析工作站检测该反应的信号电流峰值，可快速实现对14‑3‑3蛋白表达水平检测。该检测方法具有灵敏度高、检测限低、选择性和重复性好等优点，可用于14‑3‑3蛋白表达水平的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于电化学分析技术领域，具体的说，涉及一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋 白表达水平的电化学方法。
背景技术
14-3-3蛋白家族是一组高度保守的可溶性酸性蛋白质，分子量在28～33kD之间，广泛 分布于各种真核生物之中。该蛋白能够特异地结合含有磷酸化丝氨酸或苏氨酸的肽段，参与 多种信号转导途径。14-3-3蛋白调节着许多重要细胞生命活动，如：新陈代谢、细胞周期、 细胞生长发育、细胞的存活和凋亡以及基因转录，该蛋白家族异常与疾病的发生密切相关， 尤其是14-3-3蛋白在脑脊液中的分布与一些神经系统疾病密切相关。14-3-3蛋白已成为一些 疾病的临床诊断指标，其作为疾病治疗的靶点也在研究之中。
14-3-3蛋白主要分布于细胞质、细胞核、线粒体基质、叶绿体基质和类囊体膜。在植物 中14-3-3蛋白对碳和氮代谢有广泛的调控作用，14-3-3蛋白通过与碳代谢途径关键酶如蔗糖 磷酸合酶、6-磷酸果糖激酶/果糖二磷酸激酶、葡1萄糖-1-磷酸腺苷转移酶、甘油醛3-磷酸 脱氢酶、淀粉合成酶、脂肪氧化酶互作影响这些酶的活性，从而实现对植物碳代谢的调控， 影响光合产物的分配、淀粉的积累及脂肪的氧化等。因此，检测14-3-3蛋白表达水平具有 重要意义。
目前在科研和诊断中检测蛋白表达水平多采用Western Blot分析技术，但这种方法都存 在着自身的不足，Western Blot分析技术在使用过程中运行成本较高，无论是仪器还是耗材 的成本都不低；同时，Western Blot分析方法在操作时往往存在操作繁琐、检测限低等不 足。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的电化学方法， 该方法具有选择性好、样品不需预处理、可实现连续在线监测、测定成本远低于大型分析仪 器等优点，可以快速、准确的检测14-3-3蛋白表达水平。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
所述的测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，包括以下步骤：
(1)碳浆印刷电极以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对电极的印刷电极；
(2)依次把多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs)、14-3-3蛋白抗体组装到碳浆印刷 电极的工作电极上，制备的SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用牛血清蛋白BSA封闭30分钟，除去非特异性结合位点，制备得到14-3-3蛋白捕获抗体探针；
(3)将待测蛋白样品滴加到14-3-3蛋白捕获抗体探针上，使14-3-3蛋白与抗体充分结 合后，用电极洗液和去离子水交替冲洗，以洗去非特异性结合的杂蛋白；
(4)在工作电极上滴加14-3-3蛋白信号抗体探针结合后，用电极洗液和去离子水交替 冲洗，制得电流型免疫传感器；
(5)在电流型免疫传感器上滴加H2O2反应液，使用循环伏安法测定电流值大小；将测 得的电流值代入电流峰值与14-3-3蛋白浓度的线性关系式y＝0.1297x+0.417中，求得14-3-3 的蛋白浓度。
进一步优选，步骤(2)中，所述14-3-3蛋白捕获抗体探针的滴加量为5μl，浓度为0.6μg/μL；牛血清蛋白的滴加量为5μl，质量百分比浓度为1％。
进一步优选，步骤(3)中，待测蛋白样品用量体积总量为5μL，蛋白与抗体的结合时间为室温下1小时。
进一步优选，步骤(4)中，所述14-3-3蛋白信号抗体探针的滴加量为5μl，浓度为0.016μg/μL，结合时间1h。
进一步优选，步骤(5)中，所用反应液的含量及用量为：100μL 40mM H2O2溶液；H2O2反应液反应1min后进行循环伏安法测定，循环伏安扫描电压范围为-0.3-0.6V，扫速为500mV/s。
进一步优选，电极洗液为pH7.2的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含0.1mmol/LNaCl 和质量百分比浓度为1％的Tween 20。
进一步优选，14-3-3蛋白捕获抗体探针的具体制备步骤如下：
在碳浆印刷电极的工作电极表面滴涂10μL多壁碳纳米管/纳米金(MWNTP-Au)复合物，室温下凉干；再将电极浸入巯基乙酸的乙醇溶液(TGA，25mmol/L)中，4℃保存12小 时后，依次用乙醇和电极洗液清洗，氮气吹干待用；再将10μL EDC/NHS(2mmol/L:5mmol /L)滴涂到电极表面，保持30分钟，用以活化电极表面的羧基，电极洗液洗涤3次；再将 5μL捕获抗体{Anti-14-3-3}滴到电极上，温育30分钟；制备的SPCE│MWCNTs-Au-Anti- 14-3-3电极用1.0％BSA封闭30分钟，除去非特异性吸附位点，形成14-3-3蛋白捕获抗体 探针。
进一步优选，多壁碳纳米管/纳米金(MWNTP-Au)复合物的制备步骤如下：
a.制备PAMAM-纳米Au复合物：将2mL胶体金溶液加入到2mL PAMAM (0.07mmol/L)和2mL甲酸(1mmol/L)的混合液中，快速搅拌，获得PAMAM-纳米Au复合 物；
b.将多壁碳纳米管在HNO3/H2SO4(1:3V/V)溶液中回流5小时，使其羧基化；过滤所得 产物用清水洗至中性，在真空条件下过夜干燥，随后把1.0mg多壁碳纳米管分散在4mL去离子水中，加入l.0mL EDC/NHS溶液(2mM:5mM)，在室温条件下揽拌2小时，用于活化多 壁碳纳米管表面的羧基；离心洗涤后，将得到的沉淀分散在5.0mL PBS中，逐滴加入上述 制备的6mL PAMAM-纳米Au复合物；缓慢搅拌6小时，再用清水洗涤3次，分散在0.5 mL去离子水中，制得多壁碳纳米管纳米金复合物(MWNTP-Au)。
进一步优选，14-3-3蛋白信号抗体探针的制备步骤如下：
制备14-3-3蛋白信号抗体探针：先用0.25mM K2CO3溶液调节胶体金的pH至9，接着加入4.2μg/μL EDC 100μL、200μg/mL 14-3-3抗体40μL和6μg/μL CAT 100μL，在 室温下缓慢搅拌2小时；用100μL 1％BSA封闭半小时；将上述溶液在15000rpm转速下离 心15分钟，弃去上清液；下层悬浮液经pH 7.4PBS离心分离、洗涤后，得到{14-3-3抗体- Aμ-CAT}生物复合物，即信号抗体探针，重新分散在500μL pH7.4 PBS中，获得浓度为 0.016μg/μL的14-3-3蛋白信号抗体探针。
进一步优选，胶体金液的制备步骤如下：将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比 1:79配成A液；将质量分数为1％柠檬酸三钠，质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸 水按体积比4:0.05:0.05:15.9配成B液；再将所述B液水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A 液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。
本发明选用导电性良好的碳浆电极，先用多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs)复合 物修饰丝网印刷碳电极表面，然后把14-3-3蛋白免疫兔获得的抗体固定于印刷电极表面 上，再加入14-3-3蛋白检测样品；由于该抗体与14-3-3蛋白的特异性结合，碳电极能快速 识别并捕获样品中的14-3-3蛋白，之后再加入制备的14-3-3蛋白信号抗体探针({Anti-14-3- 3-Au-CAT}复合物)，信号抗体探针上的14-3-3抗体能快速识别结合碳电极捕获的14-3-3蛋 白，制得{MWCNTs-Au-Anti-14-3-3}-14-3-3蛋白-{Anti-14-3-3-Au-CAT}电流型免疫传感器。 信号抗体探针上的CAT酶催化H2O2产生还原氧化反应，通过电化学分析工作站检测该反应 的信号电流峰值，可快速实现对14-3-3蛋白表达水平检测。该检测方法具有灵敏度高、检 测限低、选择性和重复性好等优点，可用于14-3-3蛋白表达水平的定量检测。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)特异性强：本发明的反应体系中，缺乏其中任一成分都检测不出电流变化。
(2)灵敏度高：由于14-3-3抗体与14-3-3的特异性结合很强，从而使本发明具有较高的灵敏度。
(3)检测限低：在检测限的测试中，发现本发明能检测出较低的14-3-3蛋白表达水平。
(4)选择性好：总蛋白与14-3-3抗体结合1h后，需要用电极洗液和去离子水交替冲洗，此时总蛋白中的14-3-3与固定在工作电极上的14-3-3抗体发生特异性结合，杂蛋白及小分子物质即可被洗掉，本发明即呈现良好的选择性。
(5)重复性好：本发明选取了一个样品为例，做了3组重复，误差分析显示本发明具有较好的重复性。
附图说明
图1为本发明14-3-3蛋白电流型免疫传感器的制备及分析示意图。
图2为本发明的特异性检测示意图。
图3为电流峰值与14-3-3蛋白浓度的线性关系图；其中，A：电流与不同浓度14-3-3抗 原的IT曲线，B：电流与不同浓度14-3-3抗原的线性关系。
图4为3种不同浓度(μg/mL)的同种烟草叶片蛋白样品利用本发明测得的循环伏安曲 线。
图5为以纯化14-3-3蛋白待测样品为例，做了3次重复6个不同1433蛋白浓度所得电 流值比较。
图6是纯14-3-3蛋白浓度梯度电泳；其中，a:0.5μg，b:1.0μg，c:1.5μg，d:2.0μg，e:2.5μg。
图7是纯14-3-3蛋白浓度梯度Western Blot分析；其中，a:0.5μg，b:1.0μg，c:1.5μg， d:2.0μg，e:2.5μg。
图8是电流型免疫传感器在4℃下储存一个月后的检测与一个月前的效果比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进 行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1：特异性验证
(1)碳浆印刷电极以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对电极的印刷电极；
(2)14-3-3蛋白捕获抗体探针(多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs))的制备：
a制备多壁碳纳米管/纳米金(MWNTP-Au复合物)：首先制备PAMAM-纳米Au复合 物，将2mL胶体金溶液加入到2mL PAMAM(0.07mmol/L)和2mL甲酸(1mmol/L)的混合液 中，快速搅拌，获得PAMAM-纳米Au复合物。然后将多壁碳纳米管在HNO3/H2SO4(1:3 V/V)溶液中回流5小时，使其羧基化。过滤所得产物并用清水洗至中性，在真空条件下过夜 干燥，随后把1.0mg多壁碳纳米管分散在4mL去离子水中，加入l.0mL EDC/NHS溶液 (2mM:5mM)，在室温条件下揽拌2小时，用于活化多壁碳纳米管表面的羧基。离心洗涤 后，将得到的沉淀分散在5.0mL PBS中，逐滴加入上述制备的6mL PAMAM-纳米Au复合 物。缓慢搅拌6小时，再用清水洗涤3次，分散在0.5mL去离子水中，制得多壁碳纳米管/ 纳米金复合物(MWNTP-Au)；
b将10μL MWNTP-Au溶液10μL滴涂到碳浆工作电极上，室温下凉干。再将电极浸入巯基乙酸的乙醇溶液(TGA，25mmol/L)中，在4℃冰箱中保存过夜(12小时)后，依次用 乙醇和电极洗液(电极洗液为pH7.2的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含0.1mmol/L NaCl 和质量百分比浓度为1％的Tween 20)清洗，氮气吹干待用。接着，将10μL EDC/NHS(2mmol/L:5mmol/L)滴涂到电极表面，保持30分钟，用以活化电极表面的羧基， 电极洗液洗涤3次。再将5μL捕获抗体{Anti-14-3-3}滴到电极上，温育30分钟；制备的 SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用1.0％BSA封闭30分钟，除去非特异性吸附位点， 电极洗液和去离子水交替冲洗，室温晾干，形成14-3-3蛋白捕获抗体探针。
(3)配制3个同种不同浓度的烟草叶片总蛋白样品溶液，第一个总蛋白样品溶液浓度 为1μg/mL，第二个总蛋白样品溶液浓度为2μg/mL，第三个总蛋白样品溶液浓度为3μ g/mL。分别滴加5μL三个同种不同浓度的烟草叶片总蛋白样品溶液到14-3-3蛋白捕获抗体 探针上，使蛋白与抗体充分结合后(约室温下1小时)，用电极洗液和去离子水交替冲洗， 室温晾干；其中，烟草叶片总蛋白样品用抽提液(10％甘油，100mM Tris-HCl，1mM PMST，5％PVP，10mmol/L巯基乙醇)提取抽提得到。
(4)14-3-3蛋白信号抗体探针的制备：
a胶体金液的制备：将质量分数为1％氯金酸与双蒸水按体积比1:79配成A液；将质量 分数为1％柠檬酸三钠，质量分数为1％鞣酸、25mM K2CO3与双蒸水按体积比 4:0.05:0.05:15.9配成B液；再将所述B液水浴内同时加热到59～61℃，搅拌A液，快速加 入B液，继续搅拌1分钟，在10～13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。
b.先用0.25mM K2CO3溶液调节胶体金的pH至9，接着加入4.2μg/μL EDC 100μL、200μg/mL 14-3-3抗体40μL和6μg/μL CAT 100μL，在室温下缓慢搅拌2小时；用100 μL 1％BSA封闭半小时；将上述溶液在15000rpm转速下离心15分钟，弃去上清液；下层 悬浮液经pH7.4 PBS离心分离、洗涤后，得到{14-3-3抗体-Aμ-CAT}生物复合物，即信号 抗体探针，重新分散在500μL pH7.4 PBS中，获得浓度为0.016μg/μL的14-3-3蛋白信号 抗体探针。
(5)在工作电极上滴入5μL 14-3-3蛋白信号抗体探针(0.016μg/μL)结合1h后，用电 极洗液和去离子水交替冲洗，制得电流型免疫传感器。
(6)滴加100μL 40mM H2O2反应液覆盖住三电极及中间区域，反应1min后，使用循环伏安法(CyclicVoltammetry，CV)测定电流大小。循环伏安扫描电压范围为-0.3-0.6V，扫速为500mV/s。
结果如图4所示，1为1μg/mL烟草叶片总蛋白样品溶液，2为2μg/mL烟草叶片总蛋白样品溶液，3为3μg/mL烟草叶片总蛋白样品溶液。由图4可知，通过CAT-Au-Anti-14-3- 3结合在印刷电极界面的CAT保持了其蛋白活性，CAT能够催化H2O2产生特征氧化还原 峰，且14-3-3抗原浓度越高，CAT结合量越大，催化H2O2的氧化还原峰增大。由IT曲线 (图4)可知，该体系检测的电流信号随14-3-3抗原蛋白浓度增加而提高，说明该体系能够对 不同浓度的14-3-3抗原实现定量检测，本发明具有很强的特异性。
实施例2：电流峰值与14-3-3蛋白浓度的关系
(1)碳浆印刷电极以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对电极的印刷电极；
(2)14-3-3蛋白捕获抗体探针的制备同实施例1。
(3)将纯化的14-3-3蛋白用PBS(PH7.4)溶液配成浓度分别为0μg/ml、1μg/ml、2 μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml的待测样品液，分别滴入6个14-3-3蛋白捕获抗体探 针上，使蛋白与抗体充分结合后(约室温下1小时)，用电极洗液和去离子水交替冲洗，室 温晾干。
(4)在工作电极上滴入5μL 14-3-3蛋白信号抗体探针(0.016μg/μL)结合1h后，用电 极洗液和去离子水交替冲洗，制得电流型免疫传感器。(14-3-3蛋白信号抗体探针的制备同 实施例1)
(5)滴加100μL 40mM H2O2反应液覆盖住三电极及中间区域，反应1min后，使用循环伏安法(Cyclic Voltammetry，CV)测定电流大小。
结果如图3所示，14-3-3蛋白浓度在0μg/ml至5μg/ml之间，电流峰值与14-3-3蛋白浓度呈现良好的线性关系:y＝0.1297x+0.417，R2＝0.9987，得到良好的线性关系。
实施例3：重复性验证
(1)碳浆印刷电极以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对电极的印刷电极；
(2)14-3-3蛋白捕获抗体探针的制备同实施例1。
(3)将纯化的14-3-3蛋白用PBS(PH7.4)溶液配成浓度分别为0μg/ml、1μg/ml、2 μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml待测样品液各3个，分别滴入18个步骤(2)中的14- 3-3蛋白捕获抗体探针上，使蛋白与抗体充分结合后(约室温下1小时)，用电极洗液和去离 子水交替冲洗，室温晾干。
(4)在工作电极上滴入5μL 14-3-3蛋白信号抗体探针(0.016μg/μL)结合1h后，用电 极洗液和去离子水交替冲洗，制得电流型免疫传感器。(14-3-3蛋白信号抗体探针的制备同 实施例1)
(5)滴加100μL 40mM H2O2反应液覆盖住三电极及中间区域，反应1min后，使用循环伏安法(Cyclic Voltammetry，CV)测定电流大小。
结果如图5所示，每3个相同的14-3-3蛋白浓度对应电流峰值的标准偏差不足0.15％， 与14-3-3蛋白浓度呈现良好线性关系的同时，也具有较高要求的重复性，也即说明本发明 具有可靠的重复性。
实施例4：传感器实际检测结果的精准度和存储稳定性
4.1传感器实际检测结果的精准度
先将14-3-3菌种(E.coli DH5α)活化，然后进行液体培养，再对菌液加入IPTG试剂进 行诱导产生14-3-3蛋白。将诱导后的菌液离心、收集到试管中。取10mL洗菌缓冲液(Tris- HCl(pH7.4)100mmol/L，甘油10％)悬浮菌体并离心洗涤两次，再加入10mL预冷的PBS buffer，悬浮菌体。冰浴下超声裂解菌体细胞，再离心、收集上清，同时用带组氨酸标签重 组蛋白的纯化方法对上清进行蛋白纯化。对纯化后的蛋白液进行蛋白印迹(WesternBlot)分 析。
结果如图6和图7所示，蛋白的上样量按照0.5μg、1.0μg、1.5μg、2.0μg、2.5μg的顺序进行，如图所示，纯化出的蛋白纯度较高，没有其它杂带，随着上样量的逐渐增加，条带的清晰度也越来越高。图6表明在35.0～45.0KDd之间得到14-3-3蛋白特征条带，使用Bradford法确定a～e纯化的14-3-3蛋白样液浓度，同时用本研究制备的传感器和WesternBlot方法检测14-3-3蛋白含量，结果表明本研究的传感器对14-3-3蛋白检测与传统Western Blot检测结果较一致(表1)，说明该传感器检测14-3-3蛋白具有可靠的准确度和实际应用 价值。
表1 14-3-3蛋白传感器检测与Western Blot检测比较
4.2传感器实际检测结果的储存稳定性
根据本研究优化的条件，以0.05、0.1、0.5μg/mL的纯化14-3-3蛋白样各五个来检测相 同SPCE│{MWCNTs-Au-Anti-14-3-3}-14-3-3蛋白-{Anti-14-3-3-Au-CAT}电流型免疫传感器 的工作电极SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3和信号抗体探针复合物{Anti-14-3-3-Au-CAT} 的储存稳定性。将传感器、工作电极和信号抗体探针复合物在密闭冰箱4℃下储存一个月 后检测，对比前后相对标准偏差(RSD)和检测电流信号的灵敏度(如图8)，结果研究发现，储 存一个月后的传感器检测相对标准偏差RSD＜0.5％，检测电流信号峰值下降范围△Imax＜ 5％，说明此免疫传感器具有良好精密度，也具有较好的存储稳定性。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）碳浆印刷电极以碳浆为工作电极，氯化银为参比电极，碳浆为对电极的印刷电极；
（2）依次把多壁碳纳米管/纳米金(MWCNTs/AuNPs)、14-3-3蛋白抗体组装到碳浆印刷电极的工作电极上，制备的SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用牛血清蛋白BSA封闭非特异性结合位点，制备得到14-3-3蛋白捕获抗体探针；
（3）将待测蛋白样品滴加到14-3-3蛋白捕获抗体探针上，使14-3-3蛋白与抗体充分结合后，用电极洗液和去离子水交替冲洗，以洗去非特异性结合的杂蛋白；
（4）在工作电极上滴加14-3-3蛋白信号抗体探针结合后，用电极洗液和去离子水交替冲洗，制得电流型免疫传感器；
（5）在电流型免疫传感器上滴加H2O2反应液，使用循环伏安法测定电流值大小；将测得的电流值代入电流峰值与14-3-3蛋白浓度的线性关系式y=0.1297x+0.417中，求得14-3-3的蛋白浓度。
2.根据权利要求1所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述14-3-3蛋白捕获抗体探针的滴加量为5μl，浓度为0.6μg/μL；牛血清蛋白的滴加量为5μl，质量百分比浓度为1%。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（3）中，待测蛋白样品用量体积总量为5μL，蛋白与抗体的结合时间为室温下1小时。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述14-3-3蛋白信号抗体探针的滴加量为5μl，浓度为0.016μg/μL，结合时间1h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：步骤（5）中，所用反应液的含量及用量为：100μL 40mM H2O2溶液；H2O2反应液反应1min后进行循环伏安法测定，循环伏安扫描电压范围为-0.3-0.6V，扫速为500mV/s。
6.根据权利要求1所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：电极洗液为pH7.2的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含0.1mmol/L NaCl和质量百分比浓度为1%的Tween 20。
7.根据权利要求1或2所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：14-3-3蛋白捕获抗体探针的具体制备步骤如下：
在碳浆印刷电极的工作电极表面滴涂10µL多壁碳纳米管/纳米金（MWNTP-Au）复合物，室温下凉干；再将电极浸入巯基乙酸的乙醇溶液(TGA，25mmol /L)中，4℃保存12小时后，依次用乙醇和电极洗液清洗，氮气吹干待用；再将10µL EDC/NHS(2mmol /L: 5mmol /L) 滴涂到电极表面，保持30分钟，用以活化电极表面的羧基，电极洗液洗涤3次；再将5µL捕获抗体{Anti-14-3-3}滴到电极上，温育30分钟；制备的SPCE│MWCNTs-Au-Anti-14-3-3电极用1.0%BSA封闭30分钟，除去非特异性吸附位点，形成14-3-3蛋白捕获抗体探针。
8.根据权利要求7所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：多壁碳纳米管/纳米金（MWNTP-Au）复合物的制备步骤如下：
a.制备PAMAM-纳米Au复合物：将2mL胶体金溶液加入到2 mL PAMAM (0.07mmol/L)和2mL甲酸(1mmol /L)的混合液中，快速搅拌，获得PAMAM-纳米Au复合物；
b.将多壁碳纳米管在HNO3/H2SO4(1:3 V/V)溶液中回流5小时，使其羧基化；过滤所得产物用清水洗至中性，在真空条件下过夜干燥，随后把1.0 mg多壁碳纳米管分散在4 mL去离子水中，加入l.0mL EDC/NHS溶液(2mM: 5mM)，在室温条件下揽拌2小时，用于活化多壁碳纳米管表面的羧基；离心洗涤后，将得到的沉淀分散在5.0 mL PBS中，逐滴加入上述制备的6 mL PAMAM-纳米Au复合物；缓慢搅拌6小时，再用清水洗涤3次，分散在0.5 mL去离子水中，制得多壁碳纳米管纳米金复合物（MWNTP-Au）。
9.根据权利要求1或4所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：14-3-3蛋白信号抗体探针的制备步骤如下：
制备14-3-3蛋白信号抗体探针：先用0.25mM K2CO3溶液调节胶体金的pH至9，接着加入4.2μg/μL EDC 100μL、200μg/mL 14-3-3抗体 40μL和6μg/μL CAT 100μL，在室温下缓慢搅拌2小时；用100μL 1%BSA封闭半小时；将上述溶液在15000rpm转速下离心15分钟，弃去上清液；下层悬浮液经pH 7.4 PBS离心分离、洗涤后，得到{14-3-3抗体-Aμ-CAT}生物复合物，即信号抗体探针，重新分散在500μL pH7.4 PBS中，获得浓度为0.016 μg/μL的14-3-3蛋白信号抗体探针。
10.根据权利要求9所述的一种测定可溶性总蛋白中14-3-3蛋白表达水平的方法，其特征在于：胶体金液的制备步骤如下：将质量分数为1%氯金酸与双蒸水按体积比1:79配成A液；将质量分数为1%柠檬酸三钠，质量分数为1%鞣酸、25mM K2CO3 与双蒸水按体积比4:0.05:0.05:15.9配成B液；再将所述B液水浴内同时加热到59~61℃，搅拌A液，快速加入B液，继续搅拌1分钟，在10~13分钟内加热至沸腾，得到胶体金液。
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