CN103543187A - 用于检测胆固醇的疏水性离子液体固定胆固醇酶普鲁士蓝修饰电极 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极。其通过离子液体将胆固醇氧化酶固定在电极上,从而在电极表面形成一层修饰层,具体是将胆固醇氧化酶分散于疏水性离子液体中所形成胆固醇酶离子液体储备液,再将该溶液涂覆在电沉积了普鲁士蓝的电极表面,真空干燥,从而得到基于离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极。本发明的修饰电极可直接检测胆固醇,且具有灵敏度高、检测限低的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器,具体地说是一种用于检测胆固醇的基于疏水性离子液体固定胆固醇酶的普鲁士蓝修饰电极。
背景技术
生物传感器(biosensor)是一类特殊的传感器,是对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。其是由固定化的生物敏感材料(酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)作识别元件与适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等)及信号放大装置构成的分析工具或系统,用固定化生物成分或生物体作为敏感元件的传感器称为生物传感器。
离子液体是指在室温或室温附近温度下呈液态的由离子构成的物质,称为室温离子液体、室温熔融盐。离子液体是当前国际科技前沿和热点,展示了广阔的应用潜力和前景, 成为当今世界各国绿色高新技术竞争的战略高地。离子液体之所以有如此发展主要是因为离子液体具有传统有机溶剂和电解质所不具备的一系列独特优点:表现为:(1)蒸汽压低、不挥发、不易燃;(2) 较宽的液态温度范围、良好的导电性和较宽的电位窗口;(3)通过阴阳离子的设计可调节其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性及离子液体酸度;(4)毒性低,可回收利用。
胆固醇是环戊烷并多氢菲的衍生物,亦称“胆甾醇”,广泛存在于动物体内,尤为脑及神经组织中最为丰富,在肾、脾、皮肤和胆汁中含量也很高,是动物体内最重要的固醇,也是动物体内维持正常生理活动所必需的。
现有的胆固醇传感器,多半以导电聚合物或纳米材料制成的复合物为酶的固定基质,其制作过程比较复杂,且电极的稳定性不是很好,而且与胆固醇酶的生物相容性不佳,并且检测效果不是特别理想。
发明内容
鉴于上述,本发明的目的在于提供一种用于检测胆固醇的基于疏水性离子液体固定胆固醇酶的普鲁士蓝修饰电极。
本发明的技术方案是:
a.称取胆固醇氧化酶加入到疏水性离子液体中超声分30min,制得离子液体胆固醇氧化酶储备液;
b.将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面,再依次经体积浓度为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后,得到处理后的玻碳电极;裸玻碳电极在10 mmol/L K3[Fe(CN)6]+10
mmol/L FeCl3+0.1 mol/L KCl 溶液中通过电沉积使干净的裸电极表面形成普鲁士蓝薄膜,然后将修饰有普鲁士蓝薄膜的玻碳电极加入pH 为6.8 的KCl的磷酸盐缓冲溶液中预处理:保持在0V 电压下30s 然后再在电压介于0.5 V到0 V 下扫描10 圈,再次将修饰的玻碳电极用二次蒸馏水冲洗干净,并在红外灯下烘烤30分钟;
c.将离子液体胆固醇氧化酶储备液滴涂到玻碳电极表面,然后真空干燥,4℃保存,得到基于离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极;
d.采用c步骤所得的离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极(ChOx-IL/PB/GCE)为工作电极,以铂为对电极,以饱和的甘汞电极为参比电极的三电极分别插入盛有pH为6.8,含有1×10-5mol/L,3×10-5mol/L, 5×10-5mol/L,7×10-5 mol/L,9×10-5mol/L, 1×10-4mol/L,2×10-4mol/L, 4×10-4mol/L胆固醇质量浓度为0.1M的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描,得到不同浓度胆固醇的循环伏安图;
e.采用origin软件作图,绘制离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极在1×10-5mol/L,3×10-5mol/L, 5×10-5mol/L,7×10-5 mol/L,9×10-5mol/L, 1×10-4mol/L,2×10-4mol/L, 4×10-4mol/L胆固醇中电流跟浓度的线性关系。
本发明具有的优点和产生的有益效果是:
1.与传统的固定在聚合物修饰电极上相比,本发明研制的基于疏水性离子液体固定胆固醇酶的普鲁士蓝修饰电极。所采用的固定胆固醇氧化酶的基质为疏水性离子液体1 - 辛基- 3 甲基咪唑三氟甲基磺酰盐,该离子液体能维持胆固醇氧化酶原有的活性,同时增加了胆固醇氧化酶与胆固醇之间的接触面积和催化活性。提高了修饰电极的灵敏度,扩大了胆固醇的检测范围,增加了胆固醇在修饰电极上的电流响应信号。
表1本发明与现有的胆固醇传感器在胆固醇检测上的对比
从表1可以看出,本发明与现有的胆固醇传感器相比,无论是从
从表1可以看出,本发明与现有的胆固醇传感器相比,无论是从监测范围,还是检出限都具有更好的检测效果。
2. 此生物传感器应用于对胆固醇的检测。用安培响应得到胆固醇的检测线,其检测线比较低,检测过程简单,灵敏度高、快速简便,有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明不同修饰电极(玻碳)在0.1mol/L, pH为6.8的 PBS缓冲液(含0.1 mol/L KCl)中的循环伏安图。其中,a: 裸电极; b: 普鲁士蓝; c:离子液体/普鲁士蓝; d: 离子液体-胆固醇氧化酶/普鲁士蓝。扫速:50mV/s。
图2为本发明不同修饰电极(玻碳)在0.1M KCl 的磷酸盐缓冲溶液和5mM K3Fe(CN)6溶液中的阻抗图。其中,a: 裸电极; b: 普鲁士蓝; c:离子液体/普鲁士蓝; d: 离子液体-胆固醇氧化酶/普鲁士蓝。
图3 为本发明不同修饰电极(玻碳)对不同浓度胆固醇检测的循环伏安图(附图为胆固醇还原峰电流与浓度的线性关系图)
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的内容,下面结合附图和具体的实施例对本发明再作进一步的说明:
本发明实施例中所使用到的仪器或药品:CHI660电化学分析仪(上海辰华仪器公司)用于循环伏安实验;饱和甘汞参比电极(上海日岛科学仪器有限公司);石英管加热式自动双重纯水蒸馏器(1810B,上海亚太技术玻璃公司)用于制备二次蒸馏水;电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)用于称量药品;超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);三氧化二铝打磨粉(0.30 μm,0.05 μm,上海辰华仪器试剂公司)用于处理玻碳电极;离子液体(简称IL,1 - 辛基- 3 甲基咪唑三氟甲基磺酰盐(上海成洁化学有限公司);氯化钾(天津市凯信化学工业有限公司);胆固醇氧化酶(上海源叶生物技术有限公司;胆固醇(天津光复会精细化工研究机构);曲拉通(Triton-100)(阿拉丁化学有限公司);异丙醇(上海中勤化学有限公司)。
用于检测胆固醇的疏水性离子液体固定胆固醇酶普鲁士蓝修饰电极的制备
1)电极的预处理:将玻碳电极依次用0.3μm、0.5μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面,再依次经体积浓度为95%乙醇、二次蒸馏水超声波清洗,得到处理干净的玻碳电极;
2)玻碳电极表面电沉积普鲁士蓝:裸玻碳电极在10 mmol/L K3[Fe(CN)6]+10
mmol/L FeCl3+0.1 mol/L KCl 溶液中通过电沉积使干净的裸电极表面形成普鲁士蓝薄膜,然后将修饰有普鲁士蓝薄膜的玻碳电极加入pH 为6.8、摩尔浓度为0.1 M KCl的磷酸盐缓冲溶液中预处理:保持在0V 电压下30s 再在电压介于0.5 到0 V 下扫描10 圈。再次将修饰的电极用二次蒸馏水冲洗干净,并在红外灯下烘烤30分钟,备用;
3)称取1mg胆固醇氧化酶加入到200μl的疏水性离子液体中超声分散30min,制得离子液体胆固醇氧化酶储备液;
4)将3μl的离子液体胆固醇氧化酶储备液滴涂到电极表面,然后真空干燥, 4℃保存。得到基于离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极;
疏水性离子液体固定胆固醇酶普鲁士蓝修饰电极的电化学表征:
在电化学工作站的技术选项中选择循环伏安技术和电化学阻抗技术,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝为对电极,直径为3mm玻碳电极为工作电极。循环伏安技术的电位窗设置为-0.2 V~0.6V。
图1为本发明不同修饰电极(玻碳)在0.1mol/L, pH为6.8的 PBS缓冲液(含0.1 mol/L KCl)中的循环伏安图。图中,应用循环伏安法对不同修饰电极(玻碳)即:a: 裸玻碳电极; b: 普鲁士蓝电极; c:离子液体/普鲁士蓝电极; d: 离子液体-胆固醇氧化酶/普鲁士蓝电极分别进行检测时,
从图1可以看出:裸玻碳电极电化学反应不存在氧化还原峰(a);当在裸玻碳电极表面电沉积上一层普鲁士蓝薄膜时,循环伏安图(b)明显显示出:在0.2v-0.3v有一组氧化还原峰;即0.2v普鲁士蓝的还原峰与0.3V 普鲁士蓝氧化峰;当疏水性离子修饰在普鲁士蓝薄膜上后,由图中可看出峰电流值明显增加(c),这表明疏水性离对于提高普鲁士蓝在电极表面的稳定性具有很好的帮助作用;由胆固醇氧化酶与疏水性离子共同修饰在普鲁士蓝薄膜上的玻碳电极(d)与(c)比较获得更大的还原峰电流值,说明了疏水性离子液体和胆固醇酶共同作用的结果。
图2为本发明不同修饰电极(玻碳)在摩尔浓度为0.1M (含0.1M KCl)的磷酸盐缓冲溶液和5mM K3Fe(CN)6
溶液中的阻抗图。其中,a: 裸电极; b: 普鲁士蓝; c:离子液体/普鲁士蓝; d: 离子液体-胆固醇氧化酶/普鲁士蓝。裸玻碳电极的阻抗图(图中曲线a)是由一个具有近似直尾线的小半圆(电阻: 100Ω )组成,而在裸玻碳电极的表面修饰上一层普鲁士蓝薄膜时(图中曲线b),电子转移时的电阻值增加到450Ω 。这两条曲线表明电极表面电沉积的普鲁士蓝薄膜会对电化学的探针电子转移产生阻碍。当在普鲁士蓝薄膜上再用疏水性离子液体修饰一层时(图中曲线c),高频率的小半圆直径非常明显地减小,电阻值也减小为250Ω ,这意味着疏水性离子液体在电子转移过程中起着重要的加速作用。再加入3μL 的胆固醇氧化酶储存液时,高频率的小半圆直径明显的减小至最后接近于0 (图中曲线d)。说明离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝修饰电极具有很好的导电性,这得益于离子液体具有优良的导电性。
图3 为离子液体-胆固醇氧化酶/普鲁士蓝修饰电极(玻碳)对1×10-5mol/L,3×10-5mol/L,5×10-5mol/L,7×10-5 mol/L,9×10-5mol/L, 1×10-4mol/L,2×10-4mol/L, 4×10-4mol/L胆固醇检测的循环伏安图(附图为胆固醇还原峰电流与浓度的线性关系图),其中,a-i分别代表1×10-5mol/L,3×10-5mol/L,5×10-5mol/L,7×10-5 mol/L,9×10-5mol/L, 1×10-4mol/L,2×10-4mol/L, 4×10-4mol/L的胆固醇循环伏安曲线,横坐标为扫描电位(V), 纵坐标为响应电流(μA)。内嵌图为还原峰电流与浓度的线性关系。由图3可以看出,胆固醇的检测线范围为0.01–0.40mM,电流与浓度有很好的线性关系,胆固醇浓度高,电流信号强,胆固醇浓度低,电流信号弱,通过胆固醇浓度与电流信号的关系,可以检测出胆固醇的量。本发明与其他同类型的胆固醇传感器相比,检测范围大,检测限低,检测过程简单,灵敏度高、快速简便。
Claims (1)
1.一种基于离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝修饰电极的制备方法,其步骤是:
a.称取胆固醇氧化酶加入到疏水性离子液体中超声分30min,制得离子液体胆固醇酶储备液,待用;
b.将玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面,再依次经体积浓度为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗后,得到处理后的玻碳电极;裸玻碳电极在10 mmol/L K3[Fe(CN)6]+10 mmol/L FeCl3+0.1
mol/L KCl 溶液中通过电沉积使干净的裸电极表面形成普鲁士蓝薄膜,然后将修饰有普鲁士蓝薄膜的玻碳电极加入pH 为6.8 的KCl的磷酸盐缓冲溶液中预处理:保持在0V 电压下30s 然后再在电压介于0.5 V到0 V 下扫描10 圈,再次将修饰的玻碳电极用二次蒸馏水冲洗干净,并在红外灯下烘烤30分钟;
c.将步骤a制得的离子液体胆固醇酶储备液滴涂到玻碳电极表面,然后真空干燥,4℃保存,得到基于离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极;
d.采用步骤c所得的离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极(ChOx-IL/PB/GCE)为工作电极、以铂为对电极、以饱和的甘汞电极为参比电极的三电极分别插入盛有pH=6.8,5mL含有1×10-5mol/L,3×10-5mol/L, 5×10-5mol/L,7×10-5
mol/L,9×10-5mol/L, 1×10-4mol/L,2×10-4mol/L, 4×10-4mol/L胆固醇的含KCl的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描,得到不同浓度胆固醇的循环伏安图;
e.采用origin软件作图,绘制离子液体膜固定胆固醇酶/普鲁士蓝的修饰电极在1×10-5mol/L,3×10-5mol/L, 5×10-5mol/L,7×10-5 mol/L,9×10-5mol/L, 1×10-4mol/L,2×10-4mol/L, 4×10-4mol/L胆固醇中电流跟浓度的线性关系。
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