CN104237361B - 基于L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时检测Cd2+、Pb2+的电化学方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时测定Pb²⁺、Cd²⁺的电化学方法，首先选取氧化石墨烯为原料，通过控制氧化石墨与肼反应温度与反应时间，利用化学还原法制得纳米级片层结构的石墨烯制得石墨烯修饰电极；接着在所制得的石墨烯修饰电极表面进一步电聚合上L-半胱氨酸，制得L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极；最后，选取L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/氯化银电极及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，对Pb²⁺和Cd²⁺同时进行电化学测定；本发明建立了一种同时检测环境水样中Pb²⁺和Cd²⁺的新方法，实时原位检测，灵敏度高，选择性好，环境友好。

Description

基于L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时检测Cd2+、Pb2+的电化学 方法

技术领域

本发明属于电化学分析技术领域，涉及环境中重金属类物质的测定，特别是一种同时测定Pb²⁺和Cd²⁺的电化学方法。

背景技术

一些少量的重金属(铁、钴、锰、锌)是生命体重要的元素，但是大部分的重金属有很强的形成复杂化合物的趋势，尤其是与那些含氮、硫、氧等配体的生命物质，如DNA、蛋白质等生物大分子。当重金属进入机体时会与机体内这些生命大分子的氮、硫、氧等配体结合，导致机体内生物分子结构、氢键等的破坏以及抑制酶的活性。与这些基团之间的相互作用也是重金属离子的毒性和致癌的主要机理。镉离子(Cd²⁺)、铅离子(Pb²⁺)是有毒重金属的重要代表，是威胁人类健康的环境污染物之一。Cd²⁺、Pb²⁺在环境中不能生物降解，一旦被排放到环境中，就能够在环境中长久的存在。Pb²⁺、Cd²⁺不仅对生物体的中枢神经系统、肾和肝、皮肤，骨头和牙齿等方面有着严重的危害，还对生物体的生殖系统有一定的毒性，对雌激素的代谢过程有一定的干扰。Pb²⁺、Cd²⁺已被列为环境内分泌干扰物之一。环境保护协会宣称，20%的铅、镉中毒是由饮用水被污染所导致的，因此监测环境水中Pb²⁺、Cd²⁺含量对提供不超过世界卫生组织规定饮用水中Pb²⁺、Cd²⁺的安全量有着重要的意义。

迄今为止，已有多种方法与技术用于重金属离子的检测，如原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、荧光光谱等。然而这些方法均需要复杂的实验仪器、繁琐的操作过程及专业的实验技术人员等，不利于实现重金属离子实时原位检测。电化学检测重金属离子具有仪器简单、灵敏度好、检测过程简易等优点而备受关注，其中阳极溶出伏安法因其较高的灵敏度成为电化学检测重金属离子最常用的一种方法。传统的阳极溶出伏安法采用汞电极作为工作电极，但因汞本身具有毒性，易造成二次污染而逐渐被淘汰。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种基于L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时测定Pb²⁺、Cd^{2 +}的电化学方法，实时原位检测Pb²⁺、Cd²⁺，灵敏度高，选择性好，且环境友好。

本发明的技术解决方案是：首先选取氧化石墨烯为原料，通过控制氧化石墨与肼反应温度与反应时间，利用化学还原法制得纳米级片层结构的石墨烯制得石墨烯修饰电极；接着在所制得的石墨烯修饰电极表面进一步电聚合上L-半胱氨酸，制得L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极；最后，选取L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/氯化银电极及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，对Pb²⁺和Cd²⁺同时进行电化学测定；

其具体包括以下步骤：

（1）购买商品化的氧化石墨烯制备氧化石墨烯溶液，再将氧化石墨烯溶液与壳聚糖按一定体积比进行混合，超声形成均匀稳定的溶液；

（2）取步骤（1）得到的氧化石墨烯-壳聚糖溶液5 µL滴于洁净的玻碳电极表面，自然晾干，得氧化石墨烯修饰电极；

（3）将步骤（2）得到的氧化石墨烯修饰电极浸于水合肼中于60℃-70℃恒温水浴加热8小时，制得石墨烯修饰电极；

（4）将步骤（3）得到的石墨烯修饰电极浸入含1.0×10⁻³ mol/L L-半胱氨酸的PBS(pH=7.0)溶液中，于-0.6~2.5 V的电位窗口进行循环伏安扫描10圈，扫速为100 mV/s，取出电极用PBS溶液冲洗，得L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极；

（5）将步骤（4）制得的L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/氯化银电极以及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，在CHI660B电化学工作站上完成Pb²⁺和Cd²⁺的同时测定。

其中，上述步骤（1）中，所述氧化石墨烯-壳聚糖悬浮液的制备方法是：称取称量5mg 氧化石墨烯溶于10 mL 二次蒸馏水，超声溶解，形成0.5 mg/mL的氧化石墨烯溶液；将氧化石墨烯溶液与质量浓度0.5％的壳聚糖按4：1的体积比混合超声，得到氧化石墨烯-壳聚糖溶液。

其中，上述步骤（5）中，测定时所用缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液(HAc-NaAc)，醋酸-醋酸钠缓冲液由冰醋酸和醋酸钠按不同比例混合配制，并用醋酸和氢氧化钠调节至所需pH值；整个测定过程在氮气保护下进行，即每次测定之前将含Pb²⁺和Cd²⁺的醋酸-醋酸钠缓冲液(HAc-NaAc)通氮气 15 min，测量时也保持在氮气氛围中进行；每次测量前，先在-1.1 V电位下恒电位沉积120 s，接着记录-1.1~-0.4 V范围内的示差脉冲伏安图。

其中，上述步骤（5）中，电化学测定结束后，将L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极置于pH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液(HAc-NaAc)溶液中于-1.1~-0.4 V范围内进行循环伏安法反复扫描10圈以除去电沉积在电极表面的Cd²⁺、Pb²⁺，恢复电极的电活性，恢复活性后的L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极室温下保存待用。

本发明的有益技术效果是：采用L-半胱氨酸/石墨烯修饰玻碳电极作为工作电极，利用差示脉冲阳极溶出伏安法对Pb²⁺和Cd²⁺进行同时测定，该三电极系统对Pb²⁺和Cd²⁺均具有高的催化活性，检测的灵敏度高，选择性好，是一种灵敏简便、稳定性好、抗干扰能力强的检测电极，而且其制备工艺简单，原理可靠，环境友好，测量速度快。

附图说明

图1中(A) 为实施例1制得的石墨烯修饰电极透射电镜照片；(B) 为实施例1制得的L-半胱氨酸/石墨烯饰电极的扫描电镜照片；

图2为实施例1制得的L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极及石墨烯修饰电极、裸电极、氧化石墨烯修饰电极测定20 μg/L的Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲溶出伏安曲线；

图3中(A)为实施例1制得的L-半胱氨酸/石墨烯饰电极测定不同浓度Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出伏安曲线；(B)为示差脉冲阳极溶出伏安电流强度- Cd²⁺、Pb²⁺浓度的标准曲线；

图4为实施例2制得电极的导电性能表征的循环伏安图(A)和交流阻抗图(B)；

图5为实施例3修饰电极检测Cd²⁺、Pb²⁺的沉积条件的优化：(A)沉积电位；(B)沉积时间；

图6为实施例4中Cd²⁺、Pb²⁺在L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极上在不同pH条件下，Cd^{2 +}、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出伏安峰电流强度随pH的变化趋势。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。

实施例1：将0.5 mg/mL氧化石墨烯与0.5% CS 按4：1的体积比混合超声，取5µL滴于洁净的玻碳电极表面，于室温干燥；待其干燥后将其浸于50%的水合肼溶液中与60℃-70℃水浴中恒温加热8小时；8小时后取出依次用二次蒸馏水、pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗，置于室温下干燥待用；将制得石墨烯修饰电极浸入含1.0×10⁻³ mol/L L-半胱氨酸，pH=7.0的PBS溶液中，于-0.6~2.5 V的电位窗口范围进行循环伏安扫描10圈，取出电极用PBS溶液冲洗，得L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极。

图1中(A)为制得的石墨烯修饰电极的透射电镜图，从图1(A)中可以看出，本实施例制得的石墨烯-壳聚糖具有褶皱的透明卷曲状结构，形貌良好，具有典型的石墨烯完整的二维平面结构，证明已成功通过原位化学还原法将氧化石墨烯上的含氧基团去除，还原成为石墨烯；图1中(B)为L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极的扫描电镜图，从图中可以看出，观察到L-半胱氨酸以小颗粒状有规律的生长在石墨烯基体上，说明L-半胱氨酸已被成功电聚合到石墨烯修饰电极表面。

将得到的L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/电极氯化银电极及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，在CHI660B电化学工作站上完成Cd²⁺和Pb²⁺的电化学测定；电化学测定的方法如下：将含Cd²⁺和Pb²⁺的醋酸-醋酸钠缓冲液通氮气15 min，整个测量过程在氮气保护下进行，测量前先在-1.1 V电位下恒电位沉积120 s，接着记录-1.1~-0.4 V范围内进行示差脉冲伏安分析；图2分别示出浓度均为20 μg/L的Cd²⁺、Pb²⁺在L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极(a)、石墨烯修饰电极(b)、未经修饰的裸电极(c)、氧化石墨烯修饰电极(d)上的示差脉冲阳极溶出伏安曲线；由图可观察到，Cd²⁺、Pb²⁺在未经修饰的裸电极、氧化石墨烯修饰电极均只出现了很弱的峰，说明未经修饰的裸电极和氧化石墨烯修饰电极导电性能差，且不利于Cd²⁺、Pb²⁺在其表面的沉积；当氧化石墨烯修饰电极被还原制得石墨烯修饰电极后，Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出伏安峰电流均显著增强，说明制得的石墨烯修饰电极的导电性能得到优化，促进了电子在电极表面的传递速率；当在石墨烯修饰电极表面进一步修饰L-半胱氨酸制得L-半胱氨酸/石墨烯电极后，Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出伏安峰电流显著增强，这是因为修饰的L-半胱氨酸上的硫原子、氮原子易与Cd²⁺、Pb²⁺进行配位，有利于Cd²⁺、Pb²⁺在电极表面的沉积，增加了其在电极表面的沉积量。

将含不同浓度Cd²⁺、Pb²⁺的醋酸-醋酸钠缓冲液通氮气 15 min，整个测量过程在氮气保护下进行，在-1.1~-0.4 V扫描区间内进行示差脉冲阳极溶出伏安法分析(图3(A))，并绘制标准曲线；如图所示3(B)所示，结果表明在Cd²⁺在0.56~67.2μg/L的浓度范围内，其示差脉冲阳极溶出伏安峰电流强度与浓度呈很好的线性关系，线性方程为：I(μA)=0.437C(μg/L)+2.842，线性相关系数R=0.9983，检测限为0.12μg/L (S/N=3)；Pb²⁺在1.04~62.1μg/L的浓度范围内，其示差脉冲阳极溶出伏安峰电流强度与浓度呈很好的线性关系，线性方程为：I(μA)=0.745C(μg/L)+4.539，线性相关系数R=0.9986，检测限为0.45 μg/L(S/N=3)。

将同一根修饰电极放入浓度均为20 μg/L Cd²⁺和Pb²⁺的醋酸-醋酸钠 (pH=4.5)的缓冲溶液中，平行测定8次，其示差脉冲阳极溶出伏安峰电流的相对标准偏差(RSD)分别为2.77%、2.86%；用同样的方法修饰相同的6根电极，分别置于浓度为20 μg/L Cd²⁺和Pb²⁺的醋酸-醋酸钠(pH=4.5)的缓冲溶液中测定，测试的RSD值分别为2.95%、2.68%；此外将修饰好的电极置于4 °C的恒温冰箱中保存7 天，再次测量，其电流值为原始的94.87%；以上结果表明用L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极电化学测定Cd²⁺和Pb²⁺具有良好的稳定性和重现性。

通过固定Cd²⁺和Pb²⁺的浓度，加入100倍 Cd²⁺和Pb²⁺浓度的常见无机离子和酚类污染物对L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极抗干扰能力进行考察；电解液中Cd²⁺和Pb²⁺的浓度为20μg/L，相对误差不超过±3％的情况下，100倍的无机盐离子和酚类污染物对Cd²⁺和Pb²⁺的示差脉冲溶出伏安峰电流强度的影响均小于5%，表明此方法具有较高的选择性，抗干扰性较好。

上述L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极测定完成后可重复利用，具体操作方法为：每次扫描结束后，将L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极置于pH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，用循环伏安法扫描至Cd²⁺和Pb²⁺的电化学响应消失，即恢复电极活性，恢复活性后的L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极室温下保存待用。

实施例2：L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极的电性能

分别采用循环伏安法(CV)和交流阻抗法(EIS)对修饰电极的导电性能进行表征；铁氰化钾的循环伏安过程是用来表征电极修饰过程及电子在电极表面传递速率非常有效、方便的一种方法；选择[Fe(CN)₆/Fe(CN)₆]^3-/4-作为电极修饰过程的表征探针；图4(A)分别为[Fe(CN)₆/Fe(CN)₆]^3-/4-在石墨烯修饰电极(a)，L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极(b)，未经修饰的裸电极(c)，氧化石墨烯修饰电极(d)上的循环伏安电流响应；由图可知，[Fe(CN)₆/Fe(CN)₆]^3-/4-在石墨烯修饰电极上电流响应最大，且△E为79 mV(曲线a)，是四个电极中最小的；说明[Fe(CN)₆/Fe(CN)₆]^3-/4-在石墨烯修饰电极表面的电子转移速率最快；当在石墨烯修饰电极表面修饰了L-半胱氨酸后，峰电流强度减弱，且△E增加到110 mV(曲线b)；说明在电极表面形成了聚合物，影响了电子的转移速率。

为了进一步说明修饰电极的导电性，用电化学交流阻抗法(EIS)对修饰电极的导电性能进行表征；交流阻抗谱图的半圆直径被称为电极表面电荷转移电阻值(R_ct)，它是氧化还原探针在电极表面电子传递动力学过程的重要表征方法；图4(B)为4种电极的交流阻抗谱图，由图可知，未经修饰的裸电极的R_ct值为678 Ohm(曲线c)，修饰氧化石墨烯后半圆直径很大，在图中不能完全显示(曲线d)，这是由于氧化石墨烯不导电，其膜电阻很大，电子的迁移过程受到极大的抑制；而原位还原得到石墨烯电极的半圆直径减小为102 Ohm(曲线a)，说明石墨烯修饰电极的导电性能非常好，电子在电极表面传递所受到的阻碍很小；在石墨烯修饰电极表面修饰了L-半胱氨酸后(曲线b)，半圆的直径增加至308 Ohm，说明在电极表面形成了聚合物，阻碍了电子的传递。

实施例3：沉积条件的优化

我们对Cd²⁺和Pb²⁺检测的最佳沉积条件进行了优化，有效的沉积可以将溶液中的Cd²⁺和Pb²⁺浓缩于电极表面，对之后的电化学测量增大电流强度起着关键作用；因此，实验中对沉积电位和沉积时间进行了优化，研究结果如图5所示；图5(A)为Cd²⁺、Pb²⁺为示差脉冲溶出峰电流强度随沉积电位的变化趋势；在-0.8~-1.1 V范围内，Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出峰电流强度均随着沉积电位减小而增大，在-1.1~-1.4 V范围内，均随之减小而减小；即Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲溶出峰电流强度均在-1.1 V时最大，因此实验选择-1.1 V作为Cd²⁺、Pb²⁺的沉积电位。

传感器的灵敏度通过增长沉积时间而提高，实验考察了Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出峰电流强度随沉积时间的变化；结果如图5(B)所示， Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲溶出峰电流强度均随沉积时间的增长而增强，但均在120 s时达到最大，且120 s之后增加幅度微弱，说明沉积时间为120 s时，Cd²⁺、Pb²⁺在电极表面的沉积均已接近饱和。为了有效的检测Cd²⁺、Pb²⁺，实验选择120 s作为Cd²⁺、Pb²⁺的沉积时间；综述所述，Cd²⁺、Pb²⁺的最佳沉积条件为：-1.1 V，120 s。

实施例4：溶液pH对Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出峰电流的影响

实验对缓冲溶液的pH对Cd²⁺、Pb²⁺的电化学响应的影响进行了研究；图6为pH在3.0~6.0范围内，Cd²⁺、Pb²⁺的电化学响应信号的的变化趋势；Cd²⁺、Pb²⁺的示差脉冲阳极溶出峰电流强度在3.0~4.5范围内均随pH值的增大而增强，在4.5~6.0范围内，均随pH值的增大而减弱，即均在pH=4.5时，示差脉冲阳极溶出峰电流强度达到最大；因此实验选择为pH=4.5 醋酸-醋酸钠缓冲溶液作为Cd²⁺、Pb²⁺的检测的支持电解液。

实施例5：利用该电化学方法对模拟水样进行分析

将此方法应用于实际环境水样的分析检测，实际水样取自洪泽湖湖中心、老山乡、泞淮、成子湖、韩桥、西顺河、高浪涧、蒋坝等8个采样点；将所取的水样分别先进行多次过滤至澄清，各取10 mL于100 mL容量瓶中，然后用pH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液稀释至刻度线；采用示差脉冲阳极溶出伏安法对其进行检测检测结果如表1所示：

表1

表1为实施例5中L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极对环境水样中Cd²⁺、Pb²⁺测定结果及回收率；并将检测结果与ICP-AES检测结果比较，比较结果如表2所示：

表2

表2为实施例5中L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极和ICP-AES对洪泽湖8个采样点水样中Cd²⁺和Pb²⁺的检测结果比较；两种方法检测结果的相对误差不超过5%，表明该分析方法十分可靠，适用于实际环境水样中Cd²⁺和Pb²⁺的检测。应当理解的是，上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围情况下，还可以做出替换、简单组合等多种变形，这些均落入本发明的保护范围内，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (2)

1.基于L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时测定Cd²⁺和Pb²⁺的电化学方法，首先选取氧化石墨烯为原料，通过控制氧化石墨与水合肼反应温度与反应时间，利用化学还原法制得纳米级片层结构的石墨烯制得石墨烯修饰电极；接着在所制得的石墨烯修饰电极表面进一步电聚合上L-半胱氨酸，制得L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极；最后，选取L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/氯化银电极及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，对Pb²⁺和Cd²⁺同时进行电化学测定；其特征是具体包括以下步骤：

（1）购买商品化的氧化石墨烯制备氧化石墨烯溶液，再将氧化石墨烯溶液与壳聚糖按一定体积比进行混合，超声形成均匀稳定的溶液；所述氧化石墨烯-壳聚糖溶液的制备方法是：称取称量5 mg 氧化石墨烯溶于10 mL 二次蒸馏水，超声溶解，形成0.5 mg/mL的氧化石墨烯溶液；将氧化石墨烯溶液与质量浓度0.5％的壳聚糖按4：1的体积比混合超声，得到氧化石墨烯-壳聚糖溶液；

（2）取步骤（1）得到的氧化石墨烯-壳聚糖溶液5 µL滴于洁净的玻碳电极表面，自然晾干，得氧化石墨烯修饰电极；

（3）将步骤（2）得到的氧化石墨烯修饰电极浸于水合肼中于60℃-70℃恒温水浴加热8小时，制得石墨烯修饰电极；

（4）将步骤（3）得到的石墨烯修饰电极浸入含1.0×10⁻³ mol/L L-半胱氨酸的pH=7.0的PBS溶液中，于-0.6~2.5 V的电位窗口进行循环伏安扫描10圈，扫速为100 mV/s，取出电极用PBS溶液冲洗，得L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极；

（5）将步骤（4）制得的L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极作为工作电极，与作为参比电极的银/氯化银电极以及作为对电极的铂丝电极组成三电极系统，在CHI660B电化学工作站上完成Pb²⁺和Cd²⁺的同时测定；电化学的测定方法如下：将含Pb²⁺和Cd²⁺的醋酸-醋酸钠缓冲液通氮气 15 min，整个测定过程在氮气保护下进行，测量前先在-1.1 V电位下恒电位沉积120s，接着记录-1.1~-0.4 V范围内的示差脉冲伏安图；测定时所用缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液由冰醋酸和醋酸钠按不同比例混合配制，并用醋酸和氢氧化钠调节至所需pH=4.5。

2.根据权利要求1所述的基于L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极同时测定Cd²⁺和Pb²⁺的电化学方法，其特征是：上述步骤（5）中，电化学测定结束后，将L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极置于pH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶液中于-1.1~-0.4 V范围内进行循环伏安法反复扫描10圈以除去恒电位沉积在电极表面的Cd²⁺、Pb²⁺，恢复电极的电活性，恢复活性后的L-半胱氨酸/石墨烯修饰电极室温下保存待用。