CN109596690A - 一种阳离子二肽与金杂化微球及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了阳离子二肽与金杂化微球及其制备方法与应用。本发明涉及的微米球由具有生物相容性的肽生物分子与氯金酸在搅拌、加热条件下反应制备而成。具体制备方法包括以下步骤：通过溶剂将肽溶解后加入氯金酸的水溶液中，搅拌一定时间后再加热即形成微米球。本发明涉及的微米球制备方法具有简单易行、条件温和及重复性好等特点；本发明中的微米球具有非常好的稳定性与生物相容性，而且制备的微米球中金的掺杂提高了微米球的导电性能和对于生物检测应用的催化性能，可以有效提高电化学传感器的性能，该方法所制备的阳离子二肽与金杂化微球可应用于生物传感分析中，所获得的酶电极能够用于胆固醇的检测，且有较高的灵敏度和快速的响应性能。

Description

一种阳离子二肽与金杂化微球及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于材料领用，涉及一种阳离子二肽与金杂化微球及其制备方法与应用。
背景技术
以生物基元构筑微纳结构用于传感领域是当前研究的热点之一，且生物分子的自组装特性为构筑多种形貌的结构提供了新颖简便的方法。多肽因其具有的分子识别能力、生物兼容性和易修饰特性在电化学传感器中具有广阔的应用前景。在众多肽基构筑基元中，苯丙氨酸二肽(FF)分子及其衍生物是最简单的，其自组装可形成纳米管、纳米线、囊泡、纳米球等多种微纳结构；FF纳米管具有比表面积大、电子传输效率高、稳定性好和表面有较多功能基团等优势，展现出一些新颖的光学、机械以及电化学性能。
FF基自组装结构材料可显著提高生物传感器的响应性能，目前己有相关报道这些结构用于生物传感器中(Yan X H,Zhu P L,Li J B,Chem.Soc.Rev.,2010,39,1877.)。Gazit研究小组将纳米管或Boc-FF纳米球修饰电极用于电化学检测。一方面，可直接将FF纳米管沉积在石墨电极表面，以铁氰化钾为模型体系进行循环伏安、时间-电流曲线测试，结果发现石墨电极经肽纳米管修饰后，其检测灵敏度提高了一倍(Yemini M,Reches M,Rishpon J,Gazit E,Nano Lett.,2005,5:183.)；另一方面，该小组对二肽纳米管进行巯基修饰，进而固定在金电极上,以过氧化氢为模型体系，考察该修饰电极的伏安曲线。结果发现，在0.4V电位下肽修饰电极对10mmol/L H2O2的响应值是裸电极的16倍。上述结果表明FF纳米管能够显著提高电子传输效率。进一步，再将葡萄糖氧化酶(GOD)或乙醇脱氢酶(ADH)固定在二肽纳米管上，构建了一种新型电化学酶传感器，利用示差脉冲伏安法实现了葡萄糖和乙醇的高灵敏检测(Yemini M,Reches M,Gazit E,Rishpon J,Anal.Chem.,2005,77:5155.)。Gong等人采用一步合成法，制备得到FF-Au自组装纳米结构。进一步将辣根过氧化物酶(HRP)作为模型分子，固定到FF-Au自组装纳米材料，该材料修饰电极对H2O2的还原性表现出良好的催化活性(Gong Y F,Chen X,Lu Y L,Yang W S,Biosens.Bioelectron.,2015,66:392.)。此外，有报道发现Boc-FF纳米球(Adler-Abramovich L,Badihi-Mossberg M,Gazit E,Rishpon J,Small,2010,6:825.)、苯丙氨酸二肽纳米线(Sasso L,VedarethinamI,Emnéus J,Svendsen W E,Castillo-León J,Nanosci.Nanotechnol.,2012,12:3077.)也可用于电化学检测。Castillo等人报道了通过偶联反应巧妙地将叶酸(FA)修饰的二肽纳米管滴涂到石墨烯修饰的电极上，利用FA与宫颈癌细胞的特异性识别，以K3[Fe(CN)6]为电化学探针，实现对癌细胞的早期诊断检测。培养10分钟便可以检测出250per mL-1的癌细胞，获得了低检测线、宽线性范围的检测结果(Castillo J J,Svendsen W E,Rozlosnik N,Escobar P,Martínez F,Castillo-León J,Analyst,2013,138:1026.)。
尽管也取得了一定的进展，但FF基材料导电性弱也限制了所构建的生物传感器的检测性能。贵金属纳米粒子具有杰出的导电性、良好的生物相容性以及大比表面积等优势。因此，将二肽分子与贵金属金纳米粒子相结合得到优势互补的材料，有望能提高二肽自组装结构在电化学传感器中的应用性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种阳离子二肽与金杂化微球及其制备方法与应用。
本发明提供的制备阳离子二肽与金杂化微球的方法，包括：
将阳离子二肽溶解得到含肽溶液后，与氯金酸水溶液混合后先搅拌再加热而得。
上述方法中，肽为FF(苯丙氨酸)-阳离子二肽(简称CDP)；
所述肽溶解步骤中，所用溶剂为六氟代异丙醇(HFIP)；
所述含肽溶液的浓度为1-5mg/mL；具体为1、2-4mg/mL；
所述氯金酸水溶液的浓度为0-2mmol/L；具体为0.5mmol/L；
所述搅拌步骤中，时间为5-120min；具体为30min；
所述加热步骤中，温度为20-80℃；具体为60℃；加热时间为1-5h；具体为2h；
所述加热在黑暗条件下进行。
按照上述方法制备得到的阳离子二肽与金杂化微球，也属于本发明的保护范围。具体的，所述阳离子二肽与金杂化微球的直径0.8-1.8μm；具体为1.2μm。
本发明还要求保护一种生物酶电极，该生物酶电极是以所述阳离子二肽与金杂化微球、酶、壳聚糖和电极为原料制得。
本发明提供的制备所述生物酶电极的方法，包括：将所述阳离子二肽与金杂化微球与壳聚糖的醋酸溶液混匀后，涂覆在已沉积普鲁士蓝的电极表面，再在其上修饰酶而得。
上述方法所述沉积普鲁士蓝的步骤中，沉积方法为电沉积；
所用试剂为FeCl3和K3[Fe(CN)6]的水溶液；FeCl3和K3[Fe(CN)6]在所述试剂中的浓度均为2-100mM；具体为5mM；
电沉积电位为+0.4V；电沉积时间为30-200s；具体为60-150s；
然后再将普鲁士蓝修饰电极进行电化学活化处理即可；
所述壳聚糖的醋酸溶液中，壳聚糖的质量百分浓度为0.1％-5％；具体为1％；所述醋酸溶液的质量百分浓度为1％-10％；具体为2％；
所述阳离子二肽与金杂化微球与壳聚糖的醋酸溶液的体积比为1-5：1；具体为1.5:1。
所述酶为氧化酶；具体为胆固醇氧化酶或葡萄糖氧化酶；
所述酶以酶的缓冲溶液形式进行修饰；
所述酶的缓冲溶液中，缓冲溶液具体为磷酸缓冲溶液；pH值具体为7；酶在所述酶的缓冲溶液中的浓度为9-11mg/mL；具体为10mg/mL；
所述酶的缓冲溶液与阳离子二肽与金杂化微球的体积比为1-10：0-10，且不为0；具体为3：5。
所述方法还包括：在所述涂覆步骤之后，修饰步骤之前，将涂覆所得电极静置晾干；具体的，所述静置晾干步骤中，温度为室温；时间为1-24h；具体为6-12h；
在所述修饰步骤之后，将所得电极进行二次静置晾干；具体的，所述二次静置晾干步骤中，温度为0-25℃；具体为4℃；时间为1-48h；具体为24h。
另外，上述本发明提供的阳离子二肽与金杂化微球或所述生物酶电极在电化学传感分析、胆固醇检测或葡萄糖检测中的应用，也属于本发明的保护范围。
其中，所述电化学传感分析中，以所述生物酶电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。以胆固醇检测为例，具体步骤如下：以所述生物酶电极作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极构筑三电极体系，单室电解池持续搅拌，在0V电位下应用电化学工作站检测加入不同浓度的胆固醇后的时间-电流曲线，计算其线性范围和检测限，响应时间约为10s。
本发明提供了一种简单快速制备阳离子二肽与金杂化微球的方法及其应用。本发明涉及的微米球由具有生物相容性的肽生物分子与氯金酸在搅拌、加热条件下反应制备而成。具体制备方法包括以下步骤：通过溶剂将肽溶解后加入氯金酸的水溶液中，搅拌一定时间后再加热即形成微米球。本发明涉及的微米球制备方法具有简单易行、条件温和及重复性好等特点；且制备的微米球中金的掺杂提高了微米球的导电性能和对于生物检测应用的催化性能，可以有效提高电化学传感器的性能，该方法所制备的阳离子二肽与金杂化微球可应用于生物传感分析中，所获得的酶电极能够用于胆固醇或葡萄糖的检测，且有较高的灵敏度和快速的响应性能。
附图说明
图1为CDP与金纳米粒子杂化微球的扫描电子显微镜图像。
图2为不同修饰电极在胆固醇溶液中的循环伏安图。
图3为胆固醇氧化酶修饰电极检对不同浓度胆固醇的响应曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1、制备阳离子二肽纳米金杂化微球及其应用
1)FF-阳离子二肽(CDP)与金纳米粒子杂化微球(CDP-AuNPs)的制备：
称取CDP的冻干粉，用六氟代异丙醇(HFIP)作为溶剂溶解CDP，静置一会后振荡均匀，使得其为无色透明的溶液，CDP浓度为100mg/mL；
用移液枪吸取一定量该溶液加入到一定体积的0.5mmol/L的氯金酸溶液中，稀释CDP使得其浓度为2mg/mL；
磁力搅拌30min后于黑暗条件下60℃加热2h后取出，得到浅紫色的悬浮液，即为CDP-AuNPs杂化微球悬浮液。
2)修饰电极的制备：
GCE的前处理：依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末在电极布上打磨电极。每打磨完一次粉末就水洗超声30秒；
打磨好的电极不要放置太长时间，否则表面易再次生成氧化膜，短时间内放置可以放在水液面以下隔离空气中的氧；
制备普鲁士蓝膜：将打磨好的电极放入5mM FeCl3和5mM K3[Fe(CN)6]混合溶液中，在+0.4V电位下电沉积60s生成普鲁士蓝薄膜；
然后再将普鲁士蓝膜修饰电极进行电化学活化，电极使用之前用氮气吹干。
酶修饰电极：将壳聚糖(CS)溶于2％的醋酸溶液并磁力搅拌1h得到1％的壳聚糖醋酸溶液；
取步骤1)中所得CDP-AuNPs 3μL与2μL壳聚糖溶液混合均匀，将其滴涂在普鲁士蓝修饰电极上，于室温静置6h晾干；
随后将5μL胆固醇氧化酶(Chox,10mg/mL)的磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)滴涂在修饰电极表面，于4℃下静置24h晾干；
所有的修饰电极在进行电化学测试之前都用二次水清洗3次，去除掉未被固定的酶，电极不使用时放在4℃条件下保存。
3)修饰电极用于生物传感检测分析：
将步骤2)所得胆固醇氧化酶电极作为工作电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极构筑三电极体系，单室电解池持续搅拌，应用电化学工作站检测加入不同浓度的胆固醇后的时间-电流曲线，计算其线性范围和检测限，响应时间约为10s。
图1所示的是制备得到的阳离子二肽与金杂化微球的扫描电子显微镜图片，微球的直径大约是1.2μm，从图中也可以看出金镶嵌在微球的表面。图2所示是不同修饰电极在胆固醇溶液中的循环伏安图，从图中可以知道电极修饰杂化微球后对于胆固醇的响应得到了提高。图3为胆固醇氧化酶及杂化微球修饰电极检对不同浓度胆固醇的响应曲线图。由图可知，修饰后的工作电极对0.1-3.1mM范围内胆固醇具有很好的线性相关性。
实施例2、制备阳离子二肽纳米金杂化微球及其应用
1)FF-阳离子二肽(CDP)与金纳米粒子杂化微球(CDP-AuNPs)的制备：
称取CDP的冻干粉，用六氟代异丙醇(HFIP)作为溶剂溶解CDP，静置一会后振荡均匀，使得其为无色透明的溶液，CDP浓度为100mg/mL；
用移液枪吸取一定量该溶液加入到一定体积的0.5mmol/L的氯金酸溶液中，稀释CDP使得其浓度为4mg/mL；
磁力搅拌30min后于黑暗条件下60℃加热4h后取出，得到浅紫色的悬浮液，即为CDP-AuNPs杂化微球悬浮液。
2)修饰电极的制备：
GCE的前处理：依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末在电极布上打磨电极。每打磨完一次粉末就水洗超声30秒；
打磨好的电极不要放置太长时间，否则表面易再次生成氧化膜，短时间内放置可以放在水液面以下隔离空气中的氧；
制备普鲁士蓝膜：将打磨好的电极放入5mM FeCl3和5mM K3[Fe(CN)6]混合溶液中，在+0.4V电位下电沉积30s生成普鲁士蓝薄膜；
然后再将普鲁士蓝膜修饰电极进行电化学活化，电极使用之前用氮气吹干。
酶修饰电极：将壳聚糖(CS)溶于2％的醋酸溶液并磁力搅拌1h得到1％的壳聚糖醋酸溶液,
取步骤1)中所得CDP-AuNPs 3μL与2μL壳聚糖溶液混合均匀，将其滴涂在普鲁士蓝修饰电极上，于室温静置12h晾干；
随后将10μL胆固醇氧化酶(Chox,10mg/mL)滴涂在修饰电极表面，于4℃下静置24h晾干；
所有的修饰电极在进行电化学测试之前都用二次水清洗3次，去除掉未被固定的酶，电极不使用时放在4℃条件下保存。
3)修饰电极用于生物传感检测分析：同实施例1步骤3)；
实施例3、制备阳离子二肽纳米金杂化微球及其应用
1)FF-阳离子二肽(CDP)与金纳米粒子杂化微球(CDP-AuNPs)的制备：
称取CDP的冻干粉，用六氟代异丙醇(HFIP)作为溶剂溶解CDP，静置一会后振荡均匀，使得其为无色透明的溶液，CDP浓度为100mg/mL；
用移液枪吸取一定量该溶液加入到一定体积的0.5mmol/L的氯金酸溶液中，稀释CDP使得其浓度为1mg/mL；
磁力搅拌30min后于黑暗条件下60℃加热3h后取出，得到浅紫色的悬浮液，即为CDP-AuNPs杂化微球悬浮液。
2)修饰电极的制备：
GCE的前处理：依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化铝粉末在电极布上打磨电极。每打磨完一次粉末就水洗超声30秒；
打磨好的电极不要放置太长时间，否则表面易再次生成氧化膜，短时间内放置可以放在水液面以下隔离空气中的氧；
制备普鲁士蓝膜：将打磨好的电极放入5mM FeCl3和5mM K3[Fe(CN)6]混合溶液中，在+0.4V电位下电沉积150s生成普鲁士蓝薄膜；
然后再将普鲁士蓝膜修饰电极进行电化学活化，电极使用之前用氮气吹干。
酶修饰电极：将壳聚糖(CS)溶于2％的醋酸溶液并磁力搅拌1h得到1％的壳聚糖醋酸溶液,
取步骤1)中所得CDP-AuNPs 3μL与2μL壳聚糖溶液混合均匀，将其滴涂在普鲁士蓝修饰电极上，于室温静置24h晾干；
随后将3μL胆固醇氧化酶(Chox,10mg/mL)滴涂在修饰电极表面，于4℃下静置24h晾干；
所有的修饰电极在进行电化学测试之前都用二次水清洗3次，去除掉未被固定的酶，电极不使用时放在4℃条件下保存。
3)修饰电极用于生物传感检测分析：同实施例1步骤3)。

Claims (10)

1.一种制备阳离子二肽与金杂化微球的方法，包括：
将阳离子二肽溶解得到含肽溶液后，与氯金酸水溶液混合后先搅拌再加热而得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述阳离子二肽肽为苯丙氨酸-阳离子二肽；
所述肽溶解步骤中，所用溶剂为六氟代异丙醇；
所述含肽溶液的浓度为1-5mg/mL；
所述氯金酸水溶液的浓度为0-2mmol/L；
所述搅拌步骤中，时间为5-120min；
所述加热步骤中，温度为20-80℃；时间为1-5h；
所述加热在黑暗条件下进行。
3.权利要求1-2任一所述方法制备得到的阳离子二肽与金杂化微球。
4.根据权利要求3所述的阳离子二肽与金杂化微球，其特征在于：所述阳离子二肽与金杂化微球的直径0.8-1.8μm。
5.一种生物酶电极，是以权利要求3或4所述阳离子二肽与金杂化微球、酶、壳聚糖和电极为原料制得。
6.一种制备权利要求5所述生物酶电极的方法，包括：将权利要求3或4所述阳离子二肽与金杂化微球与壳聚糖的醋酸溶液混匀后，涂覆在已沉积普鲁士蓝的电极表面，再在其上修饰酶而得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述沉积普鲁士蓝的步骤中，沉积方法为电沉积；
所用试剂为FeCl3和K3[Fe(CN)6]的水溶液；FeCl3和K3[Fe(CN)6]在所述试剂中的浓度均为2-100mM；
电沉积电位为+0.4V；电沉积时间为30-200s；
所述壳聚糖的醋酸溶液中，壳聚糖的质量百分浓度为0.1％-5％；所述醋酸溶液的质量百分浓度为1％-10％；
所述阳离子二肽与金杂化微球与壳聚糖的醋酸溶液的体积比为1-5：1。
8.根据权利要求5所述的生物酶电极或权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述酶为氧化酶；具体为胆固醇氧化酶或葡萄糖氧化酶；
所述酶以酶的缓冲溶液形式进行修饰；
所述酶的缓冲溶液中，缓冲溶液具体为磷酸缓冲溶液；酶在所述酶的缓冲溶液中的浓度为9-11mg/mL；
所述酶的缓冲溶液与阳离子二肽与金杂化微球的体积比为1-10：0-10，且不为0。
9.权利要求3或4所述阳离子二肽与金杂化微球或权利要求5所述生物酶电极在电化学传感分析、胆固醇检测或葡萄糖检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述电化学传感分析中，以权利要求5所述生物酶电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极。
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