CN105954336A - 一种无酶超氧阴离子电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法，是先用L‑半胱氨酸对多壁碳纳米管进行功能化，得到Cys‑MWCNTs，然后采用电化学法将银纳米粒子沉积到Cys‑MWCNTs修饰电极的表面得到的。本发明还提供应用该方法制备得到的无酶超氧阴离子电化学传感器及其应用。本发明首次利用银纳米粒子对活性氧的催化作用代替SOD酶以达到对超氧阴离子的检测目的，方法简单、易操作，且不易失活，可以长期保存使用。并且将该修饰电极成功应用于检测活细胞（PC12）释放的超氧阴离子。本发明构建的修饰电极对O2·−有很好的电化学响应，具有线性范围宽、灵敏度高、响应时间短、稳定性以及重复性好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种无酶超氧阴离子电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
活性氧(ROS)是重要的细胞内信号分子,主要调节DNA损伤、蛋白质合成、细胞凋亡等等。其中，超氧阴离子(O2·−)作为最重要且最活跃的ROS之一,参与了许多生理和病理过程，会对生物器官造成损伤。近年来，O2·−浓度与人类健康之间的关系引起了极大关注，从体内应用学的角度,要求O2·−的动态检测线性范围宽，不仅在毫摩尔、微摩尔的摩尔浓度,甚至需要延伸至纳摩尔级别的摩尔浓度。与此同时，由于O2·−极不稳定, 很容易衰变为其它活性氧单元，因此，建立高效、可靠的定性定量检测方法仍是一个难点。
近年来电化学方法由于其简单易用、低成本、可靠性高、灵敏度高、选择性好、检出限低而受到广泛关注。研究较为广泛的是将铜-锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD）固定在电极表面构建酶传感器。然而，由于酶的活性中心被表面蛋白质覆盖，造成电子传递困难。此外，酶的价格昂贵，容易失活，对环境要求较高，酶电极的制备较为繁琐且不易储存，这些不足都大大限制了酶传感器的发展。因此，研制具有低检测限的无酶O2·−传感器就显得尤为重要。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种无酶超氧阴离子电化学传感器及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法，是先用L-半胱氨酸（L-Cys）对多壁碳纳米管（MWCNTs）进行功能化，得到Cys-MWCNTs，然后采用电化学法将银纳米粒子(AgNPs)沉积到Cys-MWCNTs修饰电极的表面得到的。
作为优选，所述用L-半胱氨酸（L-Cys）对多壁碳纳米管（MWCNTs）进行功能化的具体方法为：将纯化后的多壁碳纳米管与L-半胱氨酸分散于超纯水中，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20-28h，离心后水洗，配成分散液；作为优选，所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的加入量均为多壁碳纳米管质量的20倍。
作为优选，所述多壁碳纳米管与L-半胱氨酸的质量比为1:1。
作为优选，所述采用电化学法将银纳米粒子(AgNPs)沉积到Cys-MWCNTs修饰电极的表面的具体方法为：将L-半胱氨酸功能化的多壁碳纳米管分散液滴涂于预处理的裸玻碳电极，烤干后，得到L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；再将此修饰电极插入含有硝酸银的硝酸钾电解质溶液中，进行电化学沉积，制得沉积有银纳米粒子的无酶超氧阴离子电化学传感器。
作为优选，所述电化学沉积是在0V下用计时电流法电化学沉积1-300s；作为优选，电化学沉积200s。
在该电化学沉积时间内，均能得到修饰电极，当电化学沉积时间为200s时，修饰电极对超氧阴离子的电化学响应峰电流最大。
作为优选，所述硝酸银的浓度为0.01-3mmol/L；作为优选，浓度为1mmol/L。
在该浓度范围内，均能得到修饰电极，当硝酸银的浓度为1mmol/L时，修饰电极对超氧阴离子的电化学响应峰电流最大。
本发明的第二个目的是提供应用上述方法制备得到的无酶超氧阴离子电化学传感器。
本发明的第三个目的是提供上述无酶超氧阴离子电化学传感器在检测超氧阴离子中的应用。
作为优选，所述超氧阴离子为被AA刺激的PC12细胞释放的。
作为优选，所述超氧阴离子为细胞PC12直接释放的。
本发明优点和产生的有益效果是：
1、本发明构建了一个基于L-半胱氨酸功能化碳纳米管和银纳米粒子的无酶O2·−传感器，首次利用银纳米粒子对活性氧的催化作用代替SOD酶以达到对超氧阴离子的检测目的，相比于传统酶传感器的价格昂贵，容易失活，制备繁琐且不易储存等缺点，该传感器制备方法简单，易操作，且不易失活，可以长期保存使用。
2、本发明的修饰电极对O2·−有超灵敏的电化学响应，响应时间短，宽的线性范围：7×10-11～7.41 ×10-5mol/L，低的检测限：2.33×10-11mol/L，以及好的稳定性和重复性等优点。
3、本发明的传感器不仅能够检测到被AA刺激的PC12细胞释放的O2•−， 还能直接检测细胞PC12释放的O2•−。这表明该修饰电极在生命病理分析中具有极大的潜在价值，并有望应用于与O2•−有关的医学疾病诊断。
表1 本发明与现有的O2•−传感器对O2•−检测性能的比较
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的修饰电极AgNps/Cys-MWCNTs/GCE的扫描电镜图（SEM）；
图2为a: 裸电极；b: AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE分别在含有1.0mM的O2·−的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。c是AgNps/Cys-MWCNTs/GCE在不含O2·−的N2饱和的0.2MPBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。扫速：50mV/s；
图3为AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE对不同浓度的O2·−检测的计时电流曲线图（图3A，3B,3D,3E）及O2·−的还原峰电流与其浓度之间的线性关系图（图3C, 3F）；
图4为AgNps/Cys-MWCNTs/GCE在含有1×105个鼠肾上腺嗜铬细胞（PC12）的生理PBS缓冲溶液中，通过连续滴加1µM抗坏血酸（AA）刺激，检测PC12释放出的O2·−的计时电流曲线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本发明实施过程中所使用的仪器和药品：
CHI 660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）用于进行循环伏安、计时电流的实验，石英管加热式自动双重纯水蒸馏器（1810B，上海亚太技术玻璃公司）用于蒸超纯水。电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司），用于称量药品。超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。三氧化二铝打磨粉（0.30μm，0.05μm，上海辰华仪器试剂公司）用于处理玻碳电极。饱和甘汞参比电极，铂对电极，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾、硝酸银、硝酸钾（西安化学试剂厂）；多壁碳纳米管（深圳纳米港有限公司）。实验过程中使用的水均为超纯水，实验所用的试剂均为分析纯。
本发明的一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法如下：
a. 多壁碳纳米管的纯化：以混酸为氧化剂对多壁碳纳米管（MWCNTs）进行纯化，将MWCNTs与体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合溶液超声后，70℃加热回流8h，用超纯水洗涤至中性，50℃真空干燥；
b. 制备L-半胱氨酸-多壁碳纳米管复合材料：取等质量纯化后的多壁碳纳米管与L-半胱氨酸分散于超纯水中，随后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，两者的加入量均为碳纳米管（或L-半胱氨酸）质量的20倍。1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为交联剂，可以促进碳纳米管上的羧基和L-半胱氨酸上的氨基发生酰胺化反应产生酰胺键，室温搅拌24h，12000rmp离心，水洗4次，配成1.0mg·mL-1的分散液，待用；
c. 制备AgNps/Cys-MWCNTs修饰电极：将6μL 的L-半胱氨酸功能化的多壁碳纳米管分散液滴涂于预处理的裸玻碳电极，置于红外灯下烤干，制得L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；再将此修饰电极插入含有0.01-3mM硝酸银的0.1M硝酸钾电解质溶液中，在0V下用计时电流法电化学沉积1-300s，从而制得沉积有银纳米粒子的L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极（AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE）。
实施例1
本发明的一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法如下：
a. 多壁碳纳米管的纯化：以混酸为氧化剂对多壁碳纳米管（MWCNTs）进行纯化，将MWCNTs与体积比为3:1的浓硫酸和浓硝酸的混合溶液超声后，70℃加热回流8h，用超纯水洗涤至中性，50℃真空干燥；
b. 制备L-半胱氨酸-多壁碳纳米管复合材料：取等质量纯化后的多壁碳纳米管与L-半胱氨酸分散于超纯水中，随后加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，两者的加入量均为碳纳米管（或L-半胱氨酸）质量的20倍。1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为交联剂，可以促进碳纳米管上的羧基和L-半胱氨酸上的氨基发生酰胺化反应产生酰胺键，室温搅拌24h，12000rmp离心，水洗4次，配成1.0mg·mL-1的分散液，待用；
c. 制备AgNps/Cys-MWCNTs修饰电极：将6μL 的L-半胱氨酸功能化的多壁碳纳米管分散液滴涂于预处理的裸玻碳电极，置于红外灯下烤干，制得L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；再将此修饰电极插入含有0.1mM硝酸银的0.1M硝酸钾电解质溶液中，在0V下用计时电流法电化学沉积200s，从而制得沉积有银纳米粒子的L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极（AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE）。
图1为本发明所制备修饰电极（AgNps/Cys-MWCNTs/GCE）的扫描电镜图（SEM）。从图中可以看出通过电沉积合成银纳米粒子-L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰电极中，尺寸约在20nm的球形银纳米粒子均匀地分布在多壁碳纳米管壁上，且没有团聚现象。
d. 采用步骤c所得到的修饰电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，将其共同浸入含有1.0mM O2·−的N2饱和的0.2M pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，循环伏安技术的电位窗设置为-0.8V-0.2V，得到修饰电极对O2·−的电化学响应。
图2为a: 裸电极；b: AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE分别在含有1.0mM的O2·−的N2饱和的0.2M PBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线。c是AgNps/Cys-MWCNTs/GCE在不含O2·−的N2饱和的0.2M PBS（pH=7.0）中的循环伏安曲线，扫速为50mV/s。
由图可得：相比于裸电极，O2·−在AgNPs /Cys-MWCNTs/GCE上的还原峰电位发生了明显的正移，且还原峰电流显著的增大，这表明AgNPs /Cys-MWCNTs/GCE对O2·−的还原有明显的电催化作用，这主要归因于银纳米粒子对O2·−的还原有很强的催化性能，而且Cys-MWCNTs作为支持基质，不仅可以有效的提高修饰电极的导电性，其大的比表面积还可以负载更多的的银纳米粒子，这将进一步提高O2·−在修饰电极上的电化学响应。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于：硝酸银的浓度为0.01mM，在0V下用计时电流法电化学沉积时间为300s。其余步骤均与实施例1相同。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于：硝酸银的浓度为3mM，在0V下用计时电流法电化学沉积时间为1s。其余步骤均与实施例1相同。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于：硝酸银的浓度为2mM，在0V下用计时电流法电化学沉积时间为20s。其余步骤均与实施例1相同。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于：硝酸银的浓度为1.5mM，在0V下用计时电流法电化学沉积时间为100s。其余步骤均与实施例1相同。
实施例6 本发明的修饰电极AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE对O2·−检测的线性范围
以本发明实施例1制备的修饰电极为工作电极，铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，在N2饱和的0.2M pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中，对不同浓度O2·−进行循环伏安扫描，电位窗设置为-0.8V-0.2V，结果参见图3。
图3为AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE对不同浓度的O2·−检测的计时电流曲线图（A、B、D、E,图B为图A的局部放大图，图E为图D的局部放大图）、O2·−的还原峰电流与其浓度的线性关系图（C、F）。由图可知，对O2·−检测的线性范围为7× 10-11～7.57×10-8 mol/L、5.59×10-7～7.41×10-5mol/L，检测限为2.33×10-11mol/L。本发明与其他O2·−传感器相比，检测范围宽，检测限低，检测过程简单，灵敏度高、快速简便。
实施例7 应用本发明的修饰电极AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE对活细胞中超氧阴离子（O2·−）的电化学检测
a. 鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12)在湿度为95%的37℃恒温的DMEM培养基中培育24小时，该培养基的主要成分包括：10%热灭活的胎牛血清，100U/mL的青霉素，100mg/mL的链霉素，5%的CO2。将培养好的PC12细胞的培养基移除，用磷酸盐缓冲溶液洗涤三次，后加入3mL磷酸盐缓冲溶液于待测细胞中。PC12细胞数目约为1×105个/孔板；
b. 以本发明实施例1制备的修饰电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，将此三电极体系共同浸入含有鼠肾上腺嗜铬细胞（PC12）的0.2MPBS（PH=7.4）中，连续滴加1μM L-抗坏血酸（AA）刺激PC12释放O2·−，并用计时电流法进行检测，得到修饰电极对O2·−的计时电流曲线；
c. 采用origin软件作图，绘制步骤a、b所得循环伏安曲线、计时电流曲线以及O2·−峰电流与其浓度对数、浓度之间的线性关系图。
图4显示了AgNps/Cys-MWCNTs/GCE在含有1×105个鼠肾上腺嗜铬细胞（PC12）的0.2M PBS（PH=7.4）中，通过连续滴加1μM抗坏血酸（AA）刺激，检测PC12释放出的O2·−的计时电流曲线图。作为对照实验，图a, b, d分别对应着在空白0.2M PBS（pH=7.0）中滴加1μMAA, PC12以及在含有300U/mL SOD的PC12中滴加1μM AA的计时电流检测图。
由图可知，当在空白PBS中滴加1μM AA（图a）或未刺激的PC12（图b）时，均无明显电流变化产生，且图b的稳态电流明显高于图a，这可能是因为超灵敏的修饰电极可以检测到PC12自身所产生的ROS。当连续加入1μM AA刺激PC12时，电流响应明显增加（图c）。这说明PC12在刺激下能够短时间内释放大量O2·−。为了证实增加的电流响应是由刺激的PC12所释放的O2·−引起的，将300U/mL超氧阴离子的特异性酶（SOD）与PC12混合，并加入1μM AA刺激。由图d可知，此时响应电流变为平缓，说明本修饰电极能够成功检测到PC12所释放的O2·−，且图d的稳态电流依旧高于空白PBS（图a），这说明SOD酶特异性消除了细胞溶液中的O2·−，其他ROS仍然存在。这为进一步研究与O2·−相关的生理学及病理学奠定了基础。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种无酶超氧阴离子电化学传感器的制备方法，其特征在于：是先用L-半胱氨酸对多壁碳纳米管进行功能化，得到Cys-MWCNTs，然后采用电化学法将银纳米粒子沉积到Cys-MWCNTs修饰电极的表面得到的。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述用L-半胱氨酸对多壁碳纳米管进行功能化的具体方法为：将纯化后的多壁碳纳米管与L-半胱氨酸分散于超纯水中，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌20-28h，离心后水洗，配成分散液；作为优选，所述1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的加入量均为多壁碳纳米管质量的20倍。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述多壁碳纳米管与L-半胱氨酸的质量比为1:1。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于：所述采用电化学法将银纳米粒子沉积到Cys-MWCNTs修饰电极的表面的具体方法为：将L-半胱氨酸功能化的多壁碳纳米管分散液滴涂于预处理的裸玻碳电极，烤干后，得到L-半胱氨酸功能化多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；再将此修饰电极插入含有硝酸银的硝酸钾电解质溶液中，进行电化学沉积，制得沉积有银纳米粒子的无酶超氧阴离子电化学传感器。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述电化学沉积是在0V下用计时电流法电化学沉积1-300s；作为优选，电化学沉积200s。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述硝酸银的浓度为0.01-3mmol/L；作为优选，浓度为1mmol/L。
7.应用权利要求1-6任一所述的方法制备得到的无酶超氧阴离子电化学传感器。
8.权利要求7所述的无酶超氧阴离子电化学传感器在检测超氧阴离子中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述超氧阴离子为被AA刺激的PC12细胞释放的。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述超氧阴离子为细胞PC12直接释放的。
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Effective date of registration: 20191225 Address after: No.58 Xinfu Road, Xinjie community, yonganzhou Town, Gaogang District, Taizhou City, Jiangsu Province Patentee after: Lin Zefeng Address before: 730070 No. 805 Anning East Road, Anning District, Gansu, Lanzhou Patentee before: Northwest Normal University |
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Effective date of registration: 20201104 Address after: 274000 No. 1633, Lanzhou Road, hi tech Zone, Shandong, Heze Patentee after: SHANDONG ODA COMPOSITE MATERIALS Co.,Ltd. Address before: No.58 Xinfu Road, Xinjie community, yonganzhou Town, Gaogang District, Taizhou City, Jiangsu Province Patentee before: Lin Zefeng |
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Effective date of registration: 20231026 Address after: No. 999, Changcheng Road, Heze City, Shandong Province 274000 Patentee after: Heze Vocational College Address before: 1633 Lanzhou Road, hi tech Zone, Heze City, Shandong Province Patentee before: SHANDONG ODA COMPOSITE MATERIALS CO.,LTD. |
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Effective date of registration: 20231128 Address after: 274000 a-405 in jinguangcai incubator, No. 2166, Lanzhou Road, high tech Zone, Heze City, Shandong Province (office only) Patentee after: Heze smart new material technology Co.,Ltd. Address before: No. 999, Changcheng Road, Heze City, Shandong Province 274000 Patentee before: Heze Vocational College |
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