CN112114020A - 双敏感金修饰的dna功能化玻璃纳米孔门控系统、构筑方法及应用 - Google Patents

双敏感金修饰的dna功能化玻璃纳米孔门控系统、构筑方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统、构筑方法及应用，通过拉制玻璃纳米孔，获得更小尺寸的玻璃纳米孔，通过紫外光下利用辛基苯基聚氧乙烯醚TX‑100还原氯金酸得到金修饰的玻璃纳米孔，同时通过金硫键修饰上富含胞嘧啶的DNA，得到对Ag+和pH双敏感的纳米门控系统，可进行对Ag+和半胱氨酸检测，而且检测限低，检测范围广，检测性能准确、稳定。

Description

双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统、构筑方法及 应用
技术领域
本发明属于纳米孔传感器领域，具体涉及双敏感超薄金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统、构筑方法及应用，对Ag+和pH双敏感，实现对pH传感和Ag+检测。
背景技术
生物医学的快速发展和实际需求为生物传感分析提出了新挑战，疾病早期诊断及复杂生物样品中的灵敏、准确检测的迫切要求促进分析化学传感技术由传统的定性与定量分析向更高的单分子检测水平发展。
自库尔特计数器发明以来，随着单通道电流的记录技术及纳米微加工技术的日趋成熟，纳米孔检测技术以其独特的低成本、操作简单快速、高通量、实时在线和免标记等优势，已在分析化学领域获得广泛的关注和发展。基于纳米孔构建的电化学传感器已被广泛用于检测各种离子、生物分子、单分子蛋白及DNA等。
最先被广泛研究的纳米孔是生物纳米孔，如α-溶血素，生物纳米孔的孔径精确、固定，在区分短的寡核苷酸片段及单链DNA方面有绝对优势。但是，此类纳米孔本身也具有一定局限性，因其机械稳定性差、对实验条件(温度、pH、盐浓度等)要求苛刻而限制了广泛应用。
随着微加工技术的发展，越来越多的研究人员开始关注固态纳米孔。固态纳米孔具备较好的机械强度、优异的化学稳定性和热稳定性，能够适应更加复杂的检测环境，还可重复使用，节约成本。固态纳米孔的形状和尺寸可调控，且能在其表面进行灵活的化学或生物修饰，能够用于多种复杂结构分子目标物的检测。此外，其稳定的结构有助于与其他微型探测器和探针或分析电路相集成，构建更加灵敏的单分子检测的生物传感器。
为了增强固态纳米孔在生物传感器领域的适应性，主要有两种经典途径来对固态纳米孔的内表面进行化学修饰。第一个策略是将功能分子直接固定在纳米孔的内表面，如基于溶液反应的以共价键结合方式的改性，静电自组装,和等离子体修饰。第二个策略包含两步：第一步，通过各种方法使纳米孔表面金属化，如无电镀沉积，离子溅射沉积和电子束蒸发法；第二步，由于金属表面与含有-SH或S-S基团的分子之间自发形成了Au-S和Au-Pt键，在金属表面以共价键的形式自组装修饰上功能分子单层膜。
另外，固态纳米孔中的玻璃固态纳米孔具有突出的优点，如成本低、刚度大、易于制造、尺寸和形状可调且可重复。另外，由于玻璃纳米孔的尖端尺寸非常小，并且具有针状的几何形状，因此是分析测量中易于使用的理想工具。基于玻璃纳米孔的技术已经被证明是基础研究和生物传感应用的一种有前途的新方法，目前正受到极大关注。
一些研究小组致力于玻璃纳米孔的改性，使用化学方法进行内部修饰。首先，可以通过修饰功能分子(如脱氧核糖核酸)来实现特异性检测适体、抗体和分子印迹聚合物；其次，提供了一种研究生物分子之间相互作用的可能方法；第三，分子和离子运输的智能控制可以通过附着刺激相应分子和施加刺激(如酸碱度、光和温度)来实现。
比为了提高玻璃纳米孔的生物化学应用，金薄膜由于金-硫化学反应的便利，通常被涂覆在玻璃纳米孔的内壁上。许多课题组已经开发了许多方法来制备金膜，例如化学电镀、电沉积、溅射沉积等等。虽然上述方法简单成熟，但是过程难以控制，纳米孔的尖端容易堵塞。最近，湿法化学方法被引入到金修饰锥形玻璃纳米孔中制备金膜。例如通过葡萄糖氧化酶催化还原氯金酸或紫外线乙醇还原氯金酸制备金修饰锥形玻璃纳米孔；Cao et al报道了一种基于牛血清白蛋白还原能力制备金修饰玻璃纳米孔的仿生方法。尽管上述方法在各种应用中表现出良好的性能，但是制备过程相对复杂，改性纳米孔的传感应用很少，蛋白质制成的纳米通道门控只能在脂质膜的环境中起作用而限制了应用。
调节离子透过细胞膜渗透的离子通道对于生命过程中各种重要生理功能的实现非常重要。生物离子通道是蛋白质孔，可通过复杂的“门控”机制控制。但是，基于蛋白质的纳米孔及其包埋的脂质双层在不断变化的外部环境中容易变质。
近年来迅速发展的固态玻璃纳米孔可以避免这种缺陷，并大大提高其应用范围。到目前为止，一经采用了高效的方法来构建智能的、受生物启发的纳米通道设备，可以通过设计更复杂的功能与案件来对其进行精确控制。
Ag+对环境具有严重影响，并且对生物具有剧毒，因此探究能够检测痕量的Ag+吸引越来越多的研究。目前，许多课题组已使用多种技术方法，包括表面等离子体共振(SPR)，比色法等，然而，由于这些方法耗时或灵敏度不足等缺点，限制了Ag+传感器的进一步发展
发明内容
本发明的目的在于提供双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统及构筑方法，通过拉制玻璃纳米孔，获得更小尺寸的玻璃纳米孔，通过紫外光下利用辛基苯基聚氧乙烯醚TX-100还原氯金酸得到金修饰的玻璃纳米孔，同时通过金硫键修饰上富含胞嘧啶的DNA，得到对Ag+和pH双敏感的纳米门控系统。
本发明还提供了双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统对Ag+检测和半胱氨酸检测的应用。
本发明具体技术方案如下：
双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统的构筑方法，包括以下步骤：
1)拉制玻璃毛细管，获得玻璃纳米孔；
2)将HAuCl4溶液和TX-100溶液混合，混合溶液注入步骤1)获得的玻璃纳米孔内，紫外灯照射；
3)将富含胞嘧啶的单链DNA溶液注入步骤2)处理后的玻璃纳米孔中，室温下温育；
4)步骤3)制备的DNA功能化的纳米孔内注入硝酸银溶液，使单链DNA形成刚性四链结构；
5)再向纳米孔内注入半胱氨酸溶液，将Ag+竞争下来，使四链DNA重新恢复到单链柔性状态。
步骤1)具体为：将内径0.7mm外径1.0mm长度10cm的玻璃管放置在激光微电极拉制仪的轨道上，用铝制夹具固定拉制仪移动棒，设置加热程序I：设置参数，加热＝640，灯丝＝3，速度＝90，延迟＝80，拉＝95，在此加热程序I条件下加热40s，然后冷却20s，将此加热程序和冷却程序重复三次后取下夹具，切换程序II：设置参数，加热＝660，灯丝＝3，速度＝95，延迟＝80，拉＝99，按照程序II参数设置继续加热3-4s，玻璃管被拉成两个尖端直径为20-25nm的玻璃纳米孔。
进一步的，所述毛细玻璃管拉制前，先用丙酮超声10min清洗，再用乙醇超声清洗10min，随后用蒸馏水清洗10min,最后用氮气吹干，放入烘箱干燥。
步骤2)具体为：将HAuCl4溶液和TX-100以体积比1:1的比例混合，混合后HAuCl4浓度为3.9×10-5M,TX-100的浓度为9.9×10-2M；用气相尖头微量进样器吸取10μL混合溶液注入步骤1)获得的玻璃纳米孔内，在显微镜下观察到纳米孔内溶液无气泡后，室温下将纳米孔直接置于距紫外灯下3cm处照射，照射40min后，用蒸馏水注入至纳米孔内冲洗多余的溶液，然后在25℃下干燥6h，放入60℃的烘箱内烘干2h后取出，备用。
步骤2)中所述HAuCl4溶液混合前浓度为7.8×10-5M；TX-100溶液混合前，浓度为0.198M。
步骤3)中，富含胞嘧啶的单链DNA溶液浓度为0.01mmol/L。
步骤3)富含胞嘧啶的单链DNA溶液配置方法为：将富含胞嘧啶的单链DNA置于PBS缓冲溶液中，制得0.01mmol/L的溶液，置于4℃条件下，备用。
所述富含胞嘧啶的单链DNA序列为：
5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAATAACCCTAACCCTAACCCTAACCC-3’，
步骤3)中，由于富含胞嘧啶的单链DNA的5’端含巯基，通过金硫键形成配位键，从而能接枝在金膜修饰的纳米孔内壁上，在pH7.4中性缓冲溶液中，单链DNA呈无规则柔性卷曲状态，对纳米孔尖端直径大小没有明显影响；改变pH至5.5弱酸性，或者保持pH7.4的条件在溶液中加入硝酸银溶液，银离子会联结在胞嘧啶的非典型位点上，形成C-Ag+-C错配结构，此时单链DNA折叠起来，形成刚性的四链结构，有效的减小纳米孔直径。
步骤4)：在单链DNA修饰在玻璃纳米孔的内壁后，将配置好的10μl 0.05μmol/L的硝酸银溶液，通过气相尖头微量进样器注入到玻璃纳米孔内，并在室温下反应2h，这一步的目的是为了使Ag+与DNA单链中的胞嘧啶错配，形成C-Ag+-C的刚性四链结构。
步骤5)具体为：在加入Ag+的DNA功能化纳米孔内，用气相尖头微量进样器吸取10μl0.1μmol/L的半胱氨酸溶液，室温下反应1-2h，然后将纳米孔置于电化学工作站进行电流-电压检测，半胱氨酸通过与Ag+的特异性结合，将Ag+从DNA链上竞争下来，从而使DNA恢复至柔性单链状态，纳米孔有效直径增加，电流增大。
本发明提供的双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统通过上述方法构筑的得到。
本发明还提供了双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统用于对Ag+和半胱氨酸检测的应用。
本发明通过将i-motif结构的刺激相应构象变化的功能性DNA分子结合到纳米孔内壁上，以真正实现单个玻璃纳米孔的门控功能。本发明实现了金修饰DNA功能化的玻璃纳米孔作为可逆门控。在Ag+存在下，单链DNA分子形成碱基错配，由柔性松散的单链状态折叠为紧密堆积的刚性四链体结构，从而有效的减小纳米孔的有效直径。当加入半胱氨酸后，Cys能够与Ag+相互作用，因此Ag+检测系统可以进一步发展为半胱氨酸检测系统。半胱氨酸和Ag+的组合可能导致DNA从四重i-基序结构变为柔性单链结构。本发明进一步探究了半胱氨酸浓度对该传感器的影响。当将半胱氨酸(0.1μM)添加到溶液中时，离子电流从低电导状态变为高电导状态。DNA分子重新松弛成松散的单链状态，导致更高的电导率。将高离子电流视为“ON”状态，低离子电流成为“OFF”状态。在未来的研究工作中，更复杂的生物分子，例如多肽和蛋白质酶，可用于构建具有更精确控制功能的新型纳米孔门控传感机器。
传统的Ag+测定方法，如原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法等，需要复杂的样品制备和昂贵的仪器。使用DNA功能化的玻璃纳米孔检测Ag+，方法简便、操作容易、价格低廉。
与现有技术相比，本发明优化纳米孔镀金方法，使用TX-100和HAuCl4通过紫外还原方法在纳米孔尖端内镀金；在DNA功能化单纳米孔内进行Ag+和半胱氨酸检测。而且检测限低，检测范围广，检测性能准确、稳定。
附图说明
图1为本发明拉制玻璃毛细管获得玻璃纳米孔的示意图；
图2为检测Ag+的实验示意图；
图3为未修饰的玻璃纳米孔的TEM图像；
图4为紫外照射后金修饰成功的玻璃纳米孔的TEM图像；
图5为未经修饰的裸纳米孔的I-V曲线；
图6为金修饰后玻璃纳米孔、接枝DNA后玻璃纳米孔的I-V曲线；
图7为不同条件下纳米孔的I-V曲线；
图8位三种样品在不同条件下的I-V曲线；
图9为不同条件下不同构象DNA的圆二色光谱图；
图10为加入不同浓度Ag+后纳米孔的I-V曲线；
图11为本发明检测Ag+线性关系；
图12为加入不同浓度半胱氨酸后纳米孔的I-V曲线
图13为本发明检测半胱氨酸线性关系。
具体实施方式
本发明所用试剂的厂家、规格：
ss-DNA序列为：5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAATAACCCTAACCCTAACCCTAACCC-3’，生工生物(上海)工程有限公司；硝酸钾(KNO3，Aldrich),氯化钾(KCl,Aldrich),硝酸银(AgNO3,Aldrich)辛基苯基聚氧乙烯醚TX-100(Sangon Biotech),氯金酸(HAuCl4，SangonBiotech),半胱氨酸，PBS缓冲溶液。以上试剂都是分析纯，所有溶液都是由二次蒸馏水配制。
0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)是由0.01mol/L的KH2PO4、K2HPO4按照以下方法制备而成:
a.0.01mol/L磷酸二氢钾溶液的配制：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.3402g，用蒸馏水溶解后，倒入250mL容量瓶内，再稀释至刻度，即得0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液。
b.0.01mol/L磷酸氢二钾溶液的配制：称取无水磷酸氢二钾(K2HPO4)0.4354g，用蒸馏水溶解后，转移至250mL容量瓶内，再加蒸馏水稀释至刻度(250mL)，得到0.01mol/L的磷酸氢二钾溶液。
c.取202mL的0.01mol/L的K2HPO4和51mL的0.01mol/L的KH2PO4充分混合即为0.01mol/L的PBS缓冲溶液(PH＝7.4)。
本发明所用设备：
气相尖头微量进样器(容量：25μl，外径：0.5mm；芯硅谷)
紫外灯ZF-7，波长365nm；
所有离子循环伏安法(CV)、计时电流法(i-t)使用CHI 660C电化学分析仪(中国上海辰华)；
生物显微镜(BX53+DP72,日本)。
实施例1
双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统的构筑方法，包括以下步骤：
1)拉制玻璃毛细管，获得玻璃纳米孔：
将内径0.7mm外径1.0mm长度10cm的玻璃毛细管，先用丙酮超声10min清洗，再用乙醇超声清洗10min，随后用蒸馏水清洗10min,最后用氮气吹干，放入烘箱干燥。
将上述处理后的玻璃毛细管放置在激光微电极拉制仪的轨道上，用铝制夹具固定拉制仪移动棒，设置加热程序I：设置参数，加热＝640，灯丝＝3，速度＝90，延迟＝80，拉＝95，在此加热程序I下加热40s，然后冷却20s，然后在加热程序I条件下加热40s，然后冷却20s，然后再在加热程序I条件下加热40s，然后冷却20s，取下夹具，切换程序II：设置参数加热＝660，灯丝＝3，速度＝95，延迟＝80，拉＝99，在此条件下继续加热3-4s，玻璃管会被拉成两个尖端直径为20-25nm的玻璃纳米孔。
2)将10ml浓度7.8×10-5M的HAuCl4溶液和10m浓度为0.198M TX-100溶液混合，混合后，HAuCl4浓度为3.9×10-5M,TX-100的浓度为9.9*10-2M，用气相尖头微量进样器吸取10微升混合溶液并注入步骤1)获得的玻璃纳米孔内，在显微镜下观察到纳米孔内溶液无气泡后，室温下直接置于距紫外灯下3cm处照射，照射40min后，再用蒸馏水注入至纳米孔内冲洗多余的溶液，然后在室温25℃下干燥6h，放入60℃的烘箱内烘干，2h后取出制备好的纳米孔备用。
3)将10微升0.01mmol/L富含胞嘧啶的单链DNA溶液用微量进样器注入步骤2)处理后的玻璃纳米孔中，室温下温育1h，单链DNA中的5’端含巯基通过金硫键形成共价键，从而能接枝在金膜修饰的纳米孔内壁上。
4)在单链DNA修饰在玻璃纳米孔的内壁后，将配置好的10μl 0.05μmol/L的硝酸银溶液，通过气相尖头微量进样器注入到玻璃纳米孔内，并在室温下反应2h，这一步的目的是为了使Ag+与DNA单链中的胞嘧啶错配，形成C-Ag+-C的刚性四链结构。
5)在加入Ag+的DNA功能化纳米孔内，用气相尖头微量进样器吸取10μl 0.1μmol/L的半胱氨酸溶液，室温下反应1-2h，然后将纳米孔置于电化学工作站进行电流-电压检测，半胱氨酸通过与Ag+的特异性结合，将Ag+从DNA链上竞争下来，从而使DNA恢复至柔性单链状态。
将步骤1)获得的未经修饰的裸玻璃纳米孔进行TEM表征，图3为裸纳米孔的TEM表征图，尖端直径约为23nm,θ约为16°。图4为步骤2)制备的紫外照射后超薄金修饰纳米孔的TEM图像。与裸纳米孔TEM图像相比，图4说明金膜装饰在玻璃纳米孔的内表面上，没有大块团聚颗粒，孔隙中出现一些气泡状形貌，是由于电子束辐照过程中金膜的轻微熔化和塌陷导致。在进行高放大透射电镜测量时，高能电子束照射后(在高放大倍数下)玻璃纳米尖端和修饰的超波金纳米膜会熔化并变形为不完整的机构。
从100mmol/L KCl，1mM PBS缓冲溶液中(pH 7.4)中测量的I-V曲线的斜率通过以下等式(1)以电化学方式推断裸纳米孔的直径：
Figure BDA0002680471590000071
其中a是纳米孔尖端的直径，R是纳米孔的电阻，k是100mM KCl的比电导(1.288Sm-1)，θ/2是半锥角(本实验中纳米孔的半锥角为3°-4°)。图5显示了用于电阻测量的100mmol/L KCl，1mM PBS缓冲溶液(pH7.4)中裸纳米孔的I-V曲线。电阻由循环伏安法测得(根据R＝U/I)，U＝-1V，R＝-1.12nA(循环十次以上实验所得电阻的平均值)，由公式(1)可计算得直径为19nm。裸玻璃纳米孔尖端直径从TEM图像可得大约为20nm，这与使用公式(1)计算I-V斜率所获得的结果基本一致。
纳米金紫外还原后成功沉积在纳米孔超细尖端内壁，可以从纳米孔与Ag/AgCl参比电极组合后，通过电化学工作站测得相应的离子电流整流(ICR)的变化看出。ICR为不对称电流-电压(I-V)曲线，整流比是在特定电势差下测量的相反极性下平均电流之间的比率，其中正电位(负电位)下的电流高于负电位(正电位)下的电流。ICR的大小通常由整流比公式(2)r表示:
Figure BDA0002680471590000072
i-1为纳米孔在-1V时的电流，i+1为纳米孔在+1V时的电流
在沉积上金后，纳米孔的整流系数与图5相比发生变化，整流比r增加到4.8，可以由图6中得到。根据报道，锥形纳米孔的ICR行为受到纳米孔表面电荷的强烈影响，整流比的增加是由于强烈吸附金后，纳米孔表面带过多负电荷。
步骤3)中，获得的金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统，在中性缓冲溶液中(pH7.4)，单链DNA呈无规则柔性卷曲状态，对纳米孔尖端直径大小没有明显影响；改变pH至弱酸性(pH5.5)，或者保持pH7.4的条件在溶液中加入硝酸银溶液，银离子会联结在胞嘧啶的非典型位点上，形成C-Ag+-C错配结构，此时单链DNA折叠起来，形成刚性的四链结构，有效的减小纳米孔直径。
将富含胞嘧啶的单链DNA接枝到金修饰的纳米孔内壁上后，改变电解质pH，在该纳米孔通道内发现了高导电状态和低导电状态。从-1V逐步增加电势到1V，测量跨膜离子电流。裸纳米孔内壁电荷量相同，整流比约为1左右，在镀金后，负电荷增加导致整流比增大。图6显示了修饰单链DNA后的纳米孔的I-V曲线，由曲线可得，整流比r约为6.7左右，与裸纳米孔、镀金后的纳米孔相比，整流比发生明显变化，这是由于DNA附着在纳米孔的内壁后，内壁上所带负电荷继续增加，造成更大的离子电流差。
步骤4)中，在单链DNA修饰在玻璃纳米孔的内壁后，将配置好的10μl 0.05μmol/L的硝酸银溶液，通过气相尖头微量进样器注入到玻璃纳米孔内，并在室温下反应2h，这一步的目的是为了使Ag+与DNA单链中的胞嘧啶错配，形成C-Ag+-C的刚性四链结构，即得Ag+修饰的DNA功能化纳米孔。
步骤5)中，使用气相尖头微量进样器吸取10μl 0.1μmol/L的半胱氨酸溶液，室温下反应1-2h，然后将纳米孔置于电化学工作站进行电流-电压检测。从图7可以看到，加入半胱氨酸后，纳米孔内的离子电流增大。这是由于半胱氨酸通过与Ag+的特异性结合，将Ag+从DNA链上竞争下来，从而使DNA恢复至柔性单链状态，纳米孔有效直径增加，呈现为高通量电流状态。在分别修饰DNA、Ag+和半胱氨酸后，整流比都会有明显的变化，以此可以判定纳米孔被成功修饰。
在0.01mol/L PBS(pH＝7.4)、0.1mol/L KNO3电解质条件下，测试3个样品I-V曲线，样品分别为：三份修饰了同样浓度DNA的纳米孔电极样品。A样品中电极只修饰了DNA溶液，并无Ag+溶液，pH为7.4；B样品中向纳米孔内加入10μl 0.1μmol/L Ag+溶液，保持溶液pH为7.4；C样品电极在加入10μl 0.1μmol/L Ag+溶液后，继续加入10μl 0.1μmol/L半胱氨酸溶液，溶液pH为7.4。记录由-1V到+1V的跨膜电流。由图8可看出，B样品中出现低离子电流，整流比r约为1.2，在A样品中，呈现出高离子电流状态，r约为6.7，这是由于DNA的构象变化导致。C样品中同样也显示较高的离子电流，是因为半胱氨酸将Ag+从DNA链上竞争下来，使四链i-motif结构的DNA重新恢复至柔性单链，整流比也随之增大。图9圆二色光谱图显示了三种条件下的DNA构象变化。(图9中A曲线)为在pH7.4条件下，没有银离子参与时，DNA保持单链结构，在圆二色光谱中，单链DNA的阳极特征峰在272nm左右，阴极特征峰在248nm左右，而当单链DNA保持中性pH但有Ag+参与时(图9中B曲线)，会折叠成四链结构，构象发生变化，因此特征峰也发生改变，阳极峰约为290nm，阴极特征峰约为260nm。Ag+存在时，胞嘧啶和质子化胞嘧啶之间形成了了分子内非经典碱基互补配对，会形成C-Ag+-C错配结构，形成四链DNA结构。DNA的结构转变会引起纳米孔有效直径的变化。具有四链基序结构的DNA相对密集的堆积在孔内壁，有效的减小了孔的直径，导致电导率降低，离子电流明显减小，而具有柔性单链结构的DNA松散分布在孔内壁，无法有效减小直径，不会导致离子电流减小，呈现高导电性。另一方面，单链DNA的分子骨架带负电荷，可以显著增加整流比。再继续加入半胱氨酸溶液后(图9中C曲线)，半胱氨酸将四链DNA结构中的Ag+竞争下来，Ag+离开DNA骨架并与半胱氨酸结合，四链DNA由于Ag+的离开，重新恢复至柔性单链结构，构想发生变化后，圆二色光谱的特征峰也因此发生变化，阳极特征峰移至275nm左右，阴极特征峰移至245nm左右，与单链DNA的特征峰位置相符。
如图2，在玻璃纳米孔内插入一根镀上AgCl的银丝，将电化学工作站的工作电极端的导电夹夹住这根银丝，参比电极与对电极的夹子夹住另一根镀上AgCl的银丝，并将这根银丝插入溶液内。这样，就可以通过在玻璃毛细管纳米孔内的Ag/AgCl电极和面向纳米孔的外部Ag/AgCl参比电极之间施加电势来收集电流。对纳米孔内部的电极施加电势。用电流放大器Axopatch 200B(Molecular Devices)使用10kHz的低通滤波器收集离子电流，并用DigiData1440A数字转换器(Molecular Devices)以100kHz的采样率对其进行数字化。向电解质池中加入不同浓度的Ag+或改变溶液pH值，得到纳米孔电极在不同情况的高、低离子电流。
实施例2
双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统检测Ag+的应用，具体为：
向实施例1步骤3)制备的DNA接枝在金膜修饰的纳米孔内壁上的玻璃纳米孔中注入不同浓度的硝酸银溶液，具体为：
在中性条件下(pH＝7.4)，Ag+的存在会诱导附着在纳米孔内壁的DNA折叠成四链结构，DNA中的胞嘧啶与Ag+形成C-Ag+-C结构，导致纳米孔的直径有效减小，这使纳米通道呈现关闭状态。向步骤3)制备的DNA接枝金膜修改的纳米孔内分别加入浓度为1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L、500nmol/L的AgNO3溶液，均在0.1mol/L PBS缓冲溶液、0.1mol/L KNO3溶液中检测，并测得I-V曲线，如图10。从图10中可看出，当AgNO3浓度为500nmol/L时显示为低离子电流状态，此时通道处于关闭状态，Ag+与单链DNA中的碱基胞嘧啶错配，形成C-Ag+-C的结构，这就使单链DNA折叠为刚性的四链结构，纳米孔内有效直径减小，离子电流被阻塞，形成低离子通量。AgNO3浓度越小，纳米孔的离子电流越大，通道开始呈现打开状态，当AgNO3为1nmol/L时，纳米孔处于完全开放状态，整流比r恢复到6.9左右，此时Ag+浓度过小，无法对纳米孔内壁的单链DNA造成构象变化。通过改变AgNO3溶液浓度经过多次循环试验得到，此纳米孔对Ag+的检测范围为10nM—500nM，检测限为3.6nmol/L，线性方程为r＝-0.009972C+6.1848；纵坐标是整流比r，x也就是横坐标是浓度C；线性相关系数平方R2＝0.9976；线性关系如图11所示。
实施例3
双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统检测半胱氨酸的应用，具体为：
根据实施例1的制备方法，向0.5μmol/L相同浓度的Ag+溶液修饰后的纳米孔内加入浓度为10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L、500nmol/L、600nmol/L的半胱氨酸溶液，并测得I-V曲线，如图12所示。通过改变半胱氨酸溶液浓度经过多次循环试验得到半胱氨酸的最佳检测范围为50nM—500nM，检测限为21nmol/L，线性方程为r＝0.00818C+1.2827；纵坐标是整流比r，x也就是横坐标是浓度C；线性相关系数平方R2＝0.9984；线性关系如图13所示。
通过与其它方法所比较，本发明门控系统对Ag+和半胱氨酸的检测范围良好，检测限更低，且操作简单，对样品检测过程中所需的样品体积要求更少，具有良好的重现性和稳定性。

Claims (10)

1.双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统的构筑方法，其特征在于，所述构筑方法包括以下步骤：
1)拉制玻璃毛细管，获得玻璃纳米孔；
2)将HAuCl4溶液和TX-100溶液混合，混合溶液注入步骤1)获得的玻璃纳米孔内，紫外灯照射；
3)将富含胞嘧啶的单链DNA溶液注入步骤2)处理后的玻璃纳米孔中，室温下温育；
4)步骤3)制备的DNA功能化的纳米孔内注入硝酸银溶液；
5)再向纳米孔内注入半胱氨酸溶液。
2.根据权利要求1所述的构筑方法，其特征在于，步骤1)具体为：将内径0.7mm外径1.0mm长度10cm的玻璃管放置在激光微电极拉制仪的轨道上，用铝制夹具固定拉制仪移动棒，设置加热程序I：设置参数，加热＝640，灯丝＝3，速度＝90，延迟＝80，拉＝95，在此加热程序I条件下加热40s，然后冷却20s，将此加热程序和冷却程序重复三次后取下夹具，切换程序II：设置参数，加热＝660，灯丝＝3，速度＝95，延迟＝80，拉＝99，按照程序II参数设置继续加热3-4s，玻璃管被拉成两个尖端直径为20-25nm的玻璃纳米孔。
3.根据权利要求1或2所述的构筑方法，其特征在于，步骤2)具体为：将HAuCl4溶液和TX-100以体积比1:1的比例混合，混合后HAuCl4浓度为3.9×10-5M,TX-100的浓度为9.9×10-2M；用气相尖头微量进样器吸取10μL混合溶液注入步骤1)获得的玻璃纳米孔内，在显微镜下观察到纳米孔内溶液无气泡后，室温下将纳米孔直接置于距紫外灯下3cm处照射，照射40min后，用蒸馏水注入至纳米孔内冲洗多余的溶液，然后在25℃下干燥6h，放入60℃的烘箱内烘干2h后取出，备用。
4.根据权利要求1或2所述的构筑方法，其特征在于，步骤3)中，富含胞嘧啶的单链DNA溶液浓度为0.01mmol/L。
5.根据权利要求1或4所述的构筑方法，其特征在于，所述富含胞嘧啶的单链DNA序列为：5’-SH-(CH2)6-AAAAAAAAATAACCCTAACCCTAACCCTAACCC-3’。
6.根据权利要求1所述的构筑方法，其特征在于，步骤4)：在单链DNA修饰在玻璃纳米孔的内壁后，将配置好的10μl 0.05μmol/L的硝酸银溶液，通过气相尖头微量进样器注入到玻璃纳米孔内，并在室温下反应2h。
7.根据权利要求1所述的构筑方法，其特征在于，步骤5)具体为：在加入Ag+的DNA功能化纳米孔内，用气相尖头微量进样器吸取10μl 0.1μmol/L的半胱氨酸溶液，室温下反应1-2h。
8.一种权利要求1-7任一项所述方法制备的双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统。
9.一种权利要求1-7任一项所述方法制备的双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统用于检测Ag+。
10.一种权利要求1-7任一项所述方法制备的双敏感金修饰的DNA功能化玻璃纳米孔门控系统用于检测半胱氨酸。
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