CN108996461A - 一种直径小于10nm的玻璃纳米孔、制备方法及其用于检测DNA的应用 - Google Patents

一种直径小于10nm的玻璃纳米孔、制备方法及其用于检测DNA的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种直径小于10nm的玻璃纳米孔、制备方法及其用于检测DNA的应用，直接优化激光拉制器的拉制参数和拉制过程，缩小圆锥形玻璃毛细管纳米孔的直径。通过这种方法，可以容易地获得直径小于10nm的玻璃微孔纳米孔。该方法简单，直接，且对环境无害，而不依赖昂贵的真空设备。本发明制备的玻璃毛细管纳米孔的收缩不仅降低了可检测DNA的浓度，而且显著提高了DNA转运信号和信噪比，使得该方法和玻璃纳米孔有望用于DNA转运研究。

Description

一种直径小于10nm的玻璃纳米孔、制备方法及其用于检测DNA 的应用
技术领域
本发明属于纳米材料制备领域，具体涉及一种直径小于10nm的玻璃纳米孔、制备方法及其用于检测DNA的应用。
背景技术
随着生命科学的迅速发展,人们对生命现象的研究已经深入到单分子、单细胞水平。为此需要具有检测灵敏度达到了单分子水平的分析手段与该发展相适应。在众多的单分子检测技术中,基于库尔特计数器原理的纳米孔单分子检测技术方法简便、准确,在快速廉价的DNA检测上表现出很大的应用潜力,而日益受到人们的关注。
虽然生物纳米孔最先被研究和应用检测DNA，但是人们在研究过程也发现它的不足。比如由于脂质双分子层本身的稳定性较差，生物纳米孔的使用寿命大概只有36小时；同时，它在不同pH值、不同温度以及盐溶液中都表现的不太稳定，这在一定程度上限制了生物纳米孔应用。随着微加工技术的发展，越来越多的研究小组开始关注固态纳米孔的应用。与生物纳米孔相比，固态纳米孔在化学、热学、力学稳定性上具有明显优势。此外，纳米孔可由传统常规半导体加工技术制成，可以实现大规模加工制造。纳米孔的直径也能得到控制，能够针对被检测物质的尺寸加工出合适直径使得信噪比最优。固态纳米孔在较广的pH范围内使用都不存在门控效应，因此可与电极和光探针结合使用。
虽然固态纳米孔对于生物分子检测和辨识在未来具有巨大潜力，但是还是存在不少的挑战和困难亟待解决。目前生物分子过孔引起电流信号的信噪比太低。在生物分子检测时，当纳米孔尺寸与生物分子直径相当，才能最大程度引起阻塞电流幅值变化。当生物分子尺寸远小于纳米孔尺寸时，所引起的电流变化量过小，不太容易将之与噪音信号区分。如果将检测信号进行放大，电流中噪音也会随之变大。因此，寻找的新的方法缩小纳米孔的尺寸提取有效信号，降低噪音，提高信噪比是目前需要解决第一大难题。
玻璃纳米孔作为固态纳米孔的一个有希望的候选者，具有独特的优点，如性能稳定，成本低廉，易于制造，具有可调整的和可重现的尺寸和形状。虽然它已被用于许多领域，例如扫描电化学显微镜/扫描离子电导显微镜(SECM/SICM)，单细胞手术，和电喷雾，玻璃微孔纳米孔在DNA转运研究中的应用仍然受到难以获得具有直径小于10nm的较小直径的毛细管纳米孔的严重阻碍。最近，玻璃毛细管纳米孔的低噪声特性(与氮化硅纳米孔相比)已被证明对DNA转运和生物传感有前景，但与生物纳米孔(如α溶血素，MspA或aerolysin)相比，阻碍玻璃微孔纳米孔对DNA的应用的主要缺点之一是由于其尺寸相对较大而导致灵敏度和特异性不足。
众所周知，具有单层厚孔径的二维平面固态纳米孔(如石墨烯纳米孔)优于基于玻璃毛细管的纳米孔进行DNA测序，因为后者具有更长的转运途径，从而限制了其检测灵敏度。然而，为了区分某些靶标(单碱基除外)的长度或大小，2D固态纳米孔看起来与玻璃纳米管相比没有明显的优势。此外，玻璃纳米管可用作电化学注射器。因此需要更复杂的附件来完成类似的工作。
因此，将玻璃毛细管纳米孔的直径减小到10nm以下，以增加信号幅度和信噪比(SNR)对于DNA转运研究和特殊应用(例如单细胞研究)来说，仍然是该领域的一大挑战。迄今为止，为了容易地制备具有小于10nm的微米直径的玻璃毛细管纳米孔，尝试是非常有限的。
为了增强纳米孔在生物传感器领域的适应性，主要有两种经典途径来对固态纳米孔的内表面进行化学修饰。第一个策略是将功能分子直接固定在纳米孔的内表面，如基于溶液反应的以共价键结合方式的改性，静电自组装,和等离子体修饰。第二个策略包含两步：第一步，通过各种方法使纳米孔表面金属化，如无电镀沉积，离子溅射沉积和电子束蒸发法；第二步，由于金属表面与含有-SH或S-S基团的分子之间自发形成了Au-S和Au-Pt键，在金属表面以共价键的形式自组装修饰上功能分子单层膜
近年来一些研究表明一些技术可以缩小纳米孔的尺寸。为了获得直径小于10nm的玻璃纳米孔，一些后处理方法通常是需要的。最近，Radenovic的小组通过电子辐射将玻璃毛细管纳米孔重新缩小并缩小到所需的直径。Edel的小组使用原子层沉积技术以亚纳米级精度降低直径。。一种湿化学方法，通过硅酸二钠水解将玻璃毛细管纳米孔的直径从几十纳米缩小到亚10纳米。
目前国际上为了获得直径小于10nm的玻璃纳米孔，主要有电子辐射和原子层沉积技术处理方法，与第二种方法相比，第一种方法的特色是可以直接实现孔的功能化，而且这种方法制备出的纳米孔与生物孔性质更加类似。但第一种方式比较难以控制化学修饰的密度。而第二种方法恰恰可以解决修饰不均匀这样的问题，而且金属化的孔表面都是比较稳定的。但第二种策略只适用于在SiN纳米孔外表面、长度约为1μm的纳米孔等进行修饰。它们都有个共同点，纵横比约为102。但对于纵横比为～104的玻璃纳米孔来说，是不适用的，因为玻璃纳米孔的尖端长度一般大于1mm，比这些聚合体纳米孔要长很多。第一种方法其制备的不可逆性和实验成本较高，而第二种方法由于方法的复杂性及其依赖性在昂贵的真空设备上，阻止它们广泛的实际使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种直径小于10nm的玻璃纳米孔及其制备方法。通过激光微电极拉制器，设计优化拉制参数和拉制过程，制备出直径小于10nm的纳米孔。
本发明还提供了上述直径小于10nm的玻璃纳米孔用于检测DNA的应用，降低了可检测DNA的浓度，而且显著提高了DNA转运信号和信噪比
本发明具体技术方案如下：
一种直径小于10nm的玻璃纳米孔的制备方法，包括以下步骤：
1)加热过程：将玻璃毛细管安装在P-2000激光微电极拉制器上，用夹具稳定两个移动棒，通过以下加热程序：加热＝550℃，灯丝＝3，速度＝99m/s，延迟＝20ms，拉＝50N，加热程序施加40秒，然后20秒冷却期，上述加热和冷却过程重复3-4次，得微孔预制棒；
2)拉制程序：将夹具从拉制器上移除，并且执行下面的拉制程序以将微孔预制棒拉成两个直径小于10nm的玻璃纳米孔，拉制程序参数：加热＝660℃，灯丝＝1，速度＝60m/s，延迟＝165ms，拉＝225-230N，拉断，即得2个直径小于10nm的玻璃纳米孔。
步骤1)所述玻璃毛细管内径：0.7mm；外径：1mm；长度10cm；购自Sutter公司；
本发明提供的一种直径小于10nm的玻璃纳米孔，采用上述方法制备得到。
本发明提供的一种直径小于10nm的玻璃纳米孔用于检测DNA的应用，具体方法为：
通过将Ag/AgCl电极插入拉制后玻璃纳米孔尾部作为工作电极，Ag/AgCl电极作为对电极，工作电极和对电极浸入到pH7.4的含10mM PBS的1.0M KCl溶液中，向溶液中加入不同浓度的pBR322-DNA，分别放大并收集循环伏安曲线CV和电流–时间(I-t)曲线，构建电信号和浓度的线性关系，进而实现对DNA检测的应用。
检测的DNA是λ-DNA(pBR322-DNA)购买于上海生工生物工程有限公司。
得到的线性关系为：Y＝9.6104X+0.5148，R2＝0.99918。
工作电极的制备：将用气相尖头微量进样器F2213-A25 25μL(容量25μL,针尖外径0.5mm，针长55mm.购于芯硅谷公司)从拉制后的纳米孔尾部注入10μL含10mM PBS的1.0MKCl(pH 7.4)溶液，然后将Ag/AgCl电极插入纳米孔尾部作为工作电极。将处理好的工作电极放在10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液，在电化学工作站上把电位固定在-1V到+1V，以50mV/s的扫速进行循环伏安扫描。由此得到如图4的不同直径纳米孔的循环伏安图。并且由公式和循环伏安曲线计算得出纳米孔的尺寸。
DNA的检测：将制备好的9.5nm的纳米孔工作电极(由上述方法制得)，浸入纳米孔外的电解质溶液的另一Ag/AgCl电极作为对电极，在电化学工作站上把时间固定在1000秒，以20mV/s的扫速进行计时电流法(I-t)，图5中a是在电位在+600mV下电解质溶液中未加入λ-DNA测得电流-时间曲线，图5中b在电位在+600mV下电解质溶液中加入浓度为1nMλ-DNA测得电流-时间曲线，图5中c在电位在-600mV下电解质溶液中加入浓度为1nMλ-DNA测得电流-时间曲线。由实验可得在9.5nm的纳米孔电极中在负电位下可测得电流脉冲信号。
本发明提供了一种简便而有效的方法，直接优化激光拉制器的拉制参数和拉制过程，缩小圆锥形玻璃毛细管纳米孔的直径。通过这种方法，可以容易地获得直径小于10nm的玻璃微孔纳米孔。该方法简单，直接，且对环境无害，而不依赖昂贵的真空设备。通过使用λ-DNA作为模型系统研究了直径小于10nm玻璃毛细管纳米孔用于DNA转运的优势。玻璃毛细管纳米孔的收缩不仅降低了可检测DNA的浓度，而且显著提高了DNA转运信号和信噪比，使得该方法和玻璃纳米孔有望用于DNA转运研究。纳米孔收缩策略以及低噪声特性使得玻璃微孔纳米孔有望用于生物分子传感应用，如DNA-蛋白质相互作用。此外，由于玻璃毛细管纳米孔很容易与流体流动系统集成，并可以位于流体孔的任何特定位置，所以具有超小型孔径的这种玻璃毛细管纳米孔系统可能会发现其他有前途的应用，例如将生物分子输送到单个细胞，SECM/SICM，电喷雾或3D打印。
附图说明
图1为纳米管制造过程的示意图；(I)用于制备纳米管的玻璃毛细管；(II)通过拉动玻璃毛细管形成锥形空纳米管；
图2为利用本发明制备的直径小于10nm的玻璃纳米孔检测DNA的实验装置示意图；
图3为实施例1制备的纳米孔收缩后的玻璃毛细管的TEM图像；
图4为实施例1制备的不同尺寸的纳米孔电极在10mM PBS的1.0M KCl溶液中的循环伏安图，图中a-40nm、b-9.5nm、c-6.3nm；
图5在没加入和加入浓度为1nMλ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中9.5nm的玻璃纳米孔的电流-时间响应；a和b的偏置电压为+600mV，c的偏置电压为-600mV；
a为显示了在偏压为+600mV的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中直径为9.5nm的玻璃纳米孔的电流-时间曲线，b显示了在偏压为+600mV的添加1nMλ-DNA后，在溶液中产生的电流-时间响应；c显示了在偏压为-600mV的添加1nMλ-DNA后，在溶液中产生的电流-时间响应。
图6为在没加入和加入浓度为5nMλ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中，40nm的玻璃纳米孔的电流–时间响应，a和b的偏置电压为+800mV，c的偏置电压为-800mV；
a为在未加入浓度为5nMλ-DNA的情况下40nm的玻璃纳米孔在10mM PBS的1.0M KCl(pH7.4)溶液的40nm纳米孔+800mV处的电流-时间响应；b为在加入5nMλ-DNA的情况下40nm的玻璃纳米孔在10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液的40nm纳米孔+800mV处的电流-时间响应；c为在加入5nMλ-DNA的情况下40nm的玻璃纳米孔在10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液的40nm纳米孔-800mV处的电流-时间响应。
图7为不同电位下浓度为1nMλ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中的9.5nm玻璃纳米孔的电流-时间曲线：-400mV(a)，-500mV(b)，-600mV(c)和-700mV(d)。
图8为不同浓度λ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中的9.5nm玻璃纳米孔的电流-时间曲线：1nM，2nM，3nM和4nM；
图9为不同浓度λ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中的9.5nm玻璃纳米孔的线性关系：1nM，2nM，3nM和4nM；线性关系是根据图8的数据用originPro软件线性拟合而成；得到的线性关系为：Y＝9.6104X+0.5148，R2＝0.99918。
具体实施方式
本发明所用试剂：
氯化钾(KCl)(上海百灵威有限公司)、λ-DNA(上海生工生物工程有限公司)所有试剂都是分析纯，所有溶液都是由二次蒸馏水配制。石英毛细管(内径：0.7mm,外径：1.0mm，Sutter仪器公司)。0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS)是由0.01mol/L的KH2PO4,K2HPO4按照一定比例混合而成:a.0.01mol/L磷酸二氢钾溶液的配制：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)0.3402g，用蒸馏水溶解后，倾入250mL容量瓶内，再稀释至刻度(250mL)。b.0.01mol/L磷酸氢二钾溶液的配制：称取无水磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5706g用蒸馏水溶解后，放入250mL容量瓶内，再加蒸馏水稀释至刻度(250mL)。c.取202mL的0.01mol/L的K2HPO4和51mL的0.01mol/L的KH2PO4充分混合即为0.01mol/L的PBS缓冲溶液(PH＝7.4)。
实施例1
一种直径小于10nm的玻璃纳米孔的制备方法，包括以下步骤：
1)玻璃毛细管内径：0.7mm；外径：1mm；长度10cm；购自Sutter公司；将玻璃毛细管安装在P-2000激光微电极拉制器上，用铝制夹具稳定两个移动棒，通过以下加热程序：加热＝550℃，灯丝＝3，速度＝99m/s，延迟＝20ms，拉＝50N，加热程序施加40秒，然后20秒冷却期，上述加热和冷却过程重复3-4次，得微孔预制棒。
2)将夹具从拉制器上移除，并且执行下面的拉动程序以将预制件拉成两个直径小于10nm的玻璃纳米孔：拉制程序参数：加热＝660℃，灯丝＝1，速度＝60m/s，延迟＝165ms，拉＝225-230N，拉断，即得2个直径小于10nm的玻璃纳米孔。
制备不同直径的纳米孔，在保持步骤(1)加热过程不变，改变步骤(2)拉制过程的参数以得到不同直径的纳米孔。参数如下表1所示:
表1
收缩玻璃毛细管纳米孔的表征：
从1.0M KCl，10mM PBS(pH 7.4)中测量的I-V曲线的斜率通过以下等式以电化学方式推断收缩纳米孔的直径：
其中R是测量的纳米孔的电阻，ρ是所用电解质的特定电阻率，θ/2是半圆锥角(在这种情况下为7-9°)，r是纳米孔尖端的纳米孔半径。
在这项研究中使用的激光拉制玻璃毛细管纳米孔具有40±6nm的初始内径，其可以通过电阻测量电化学估计并且通过生物显微镜观察进行确认。如图3所示，在优化拉制过程之后，玻璃毛细管纳米孔的侧壁变得稍薄，尖端孔的孔径和边缘模糊。与直接激光拉伸的玻璃微孔纳米孔不同，优化后的纳米电极具有比较小的孔径尺寸，但通常较薄的壁厚，在高能电子束照射下倾向于熔化并变形它们的尖端/孔眼，在纳米孔径收缩到小于10nm之后，成像对比度(用于玻璃壁可视化)降低。进一步进行电阻测量以电化学方法估计玻璃纳米孔的有效直径。电化学计算的孔径(～12nm)非常接近TEM获得的直径。由于透射电镜并不是用于表征具有较小直径的玻璃纳米孔的最佳方法，因此我们用电化学方法估算纳米孔的尺寸。图4显示了用于电阻测量的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中原始和收缩的玻璃毛细管纳米孔的I-V曲线。在室温下(25℃)10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中电导率ρ＝8.945，θ/2是半圆锥角(在这种情况下取8°)，纳米孔的电阻由循环伏安法测得(根据R＝U/I)由上述公式可知a,b,c的直径分别是40nm，9.5nm，和6.3nm。原始激光拉动玻璃毛细管纳米孔电导计算的直径为40纳米。随着孔径收缩，分别对应于9.5和6.3nm的有效孔径。该方法的有效性和可重复性(获得小尺寸的玻璃纳米管)非常好。在优化拉制过程后，激光拉入的玻璃毛细管可以有效使孔径尺寸减小到10nm。
实施例2
利用实施例1制备的一种直径小于10nm的玻璃纳米孔用于检测DNA的应用，具体方法为：
循环伏安(CV)、计时电流曲线(I-t)等化学实验都是在CHI 660C(上海华辰)电化学工作站上进行，使用双电极系统。通过将Ag/AgCl电极插入制备好的纳米孔尾部作为工作电极；对电极也是Ag/AgCl电极，浸入纳米孔外的溶液(在10mM PBS的1.0M KCl，pH7.4)中。详情见示意图2。通过用电流放大器(Axon 200b，Axon Instrument，Forest City，USA)和上海辰华电化学工作站放大并收集循环伏安曲线CV和电流–时间(I-t)曲线。检测的DNA是λ-DNA(pBR322-DNA)购买于上海生工生物工程有限公司。
DNA的检测：将实施例1制备好的9.5nm的纳米孔电极(由上述电极的制备方法制得)，浸入纳米孔外的电解质溶液的Ag/AgCl电极作为对电极，在电化学工作站上把运行时间固定在1000秒，以20mV/s的扫速进行计时电流法(I-t)(以下未特殊说明的，都是用同一扫速和运行时间进行电流-时间曲线的测定)。向电解质溶液中加入不同浓度的pBR322-DNA，分别放大并收集循环伏安曲线CV和电流–时间(I-t)曲线，构建电信号和浓度的线性关系，进而实现对DNA检测的应用。图8为在-600mV电压下，不同浓度λ-DNA的10mM PBS的1.0MKCl(pH 7.4)溶液中的9.5nm玻璃纳米孔的电流-时间曲线：1nM，2nM，3nM和4nM
图9为在-600mV电压下，不同浓度λ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中的9.5nm玻璃纳米孔浓度与电流脉冲频率的线性关系：1nM，2nM，3nM和4nM(线性关系是根据图8的数据用originPro软件线性拟合而成)
从图8和图9可以看出，在-600mV电压下，电流脉冲信号频率与纳米粒子浓度在1-4nM范围内成正比。
图5中a是9.5nm的纳米孔电极在电位在+600mV下电解质溶液中未加入λ-DNA测得电流-时间曲线，图5中b在电位在+600mV下电解质溶液中加入浓度为1nMλ-DNA测得电流-时间曲线，图5中c在电位在-600mV下电解质溶液中加入浓度为1nMλ-DNA测得电流-时间曲线.由实验可得在9.5nm的纳米孔电极中在负电位下可测得电流脉冲信号。图6中a是40nm的纳米孔电极电位在+800mV下电解质溶液中未加入λ-DNA测得电流-时间曲线，图6中b在电位在+800mV下电解质溶液中加入1nMλ-DNA测得电流-时间曲线，图6中c是电位在-800mV下电解质溶液中加入浓度为5nMλ-DNA测得电流-时间曲线.由实验可得在40nm的纳米孔电极中在正电位下浓度为5nMλ-DNA可测得微弱的电流脉冲信号。图7是9.5nm的纳米孔电极在电解质溶液中加入浓度为1nMλ-DNA施加不同电位(通过电化学工作站)测得电流-时间曲线。
图5在没有加入(a)和加入(b、c)浓度为1nMλ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中9.5nm的玻璃纳米孔的电流–时间响应。a和b的偏置电压为+600mV，c的偏置电压为-600mV。
图5中a显示了在偏压为+600mV的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中，直径为9.5nm的玻璃纳米孔的电流-时间曲线。图5中b显示了添加1nMλ-DNA后，在溶液中产生的电流-时间响应。当偏压从+600至-600mV，如图5中c所示，检测到有脉冲信号。只有当施加负偏压才会发生DNA转运，这意味着DNA的转运位于电场的方向。这一结果表明，λ-DNA的转运是由电渗流引起的，而不是电泳力驱动。电渗驱动的DNA转运可能是由于小尺寸和玻璃纳米孔的负表面电荷以及相对较小的电场(因此有较小的电泳驱动力)。
DNA的转运可能来自以下四种不同的机制：压力驱动的流动，电泳，电渗和扩散。本发明中，只考虑电泳和电渗的原因如下：首先，因为在纳米孔的不同侧面没有压力差，所以压力驱动的流动可以忽略；第二，由于DNA在纳米孔内的浓度较低，且能量较大，因此扩散的贡献很小。因此，在这种条件下会产生较大的电渗流。
图6为在没有和加入浓度为5nMλ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中，40nm的玻璃纳米孔的电流–时间响应。a和b的偏置电压为+800mV，c的偏置电压为-800mV。
电泳力会以相反的方向驱动DNA分子。然而，与电渗流相比，它可能不那么重要。在传统的纳米孔型实验中，膜的厚度通常在10-100nm的量级。因此，当在膜上施加100mV的电压时，纳米孔内的电场可能高达107V/m，这比纳米孔中的电场大几乎3个数量级。因此，当存在强电渗时，可以忽略电泳驱动力。由于电渗效应随着纳米孔尺寸更大而降低，所以当使用更大的纳米孔时，人们会期望看到电泳驱动的DNA转运。事实上，当直接拉制的纳米孔(具有更大直径，d＝40nm和更小长度l＝15μm)被用于实验时，观察到DNA迁移被电泳驱动。图6显示了在10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中的40nm纳米孔+800mV处的电流-时间响应在未加入(图6中a)和加入(图6中b)5nMλ-DNA的情况下。图6中c显示了电压从+800切换到-800mV时的电流-时间响应。电流脉冲仅在电压存在正电压时才会显示，这表明DNA分子在电场的相反方向上被驱动。由于纳米孔的尺寸在这种情况下几乎大一个数量级，因此检测到的电流脉冲信号很少。因此，电泳驱动的流动可以主导DNA的转运。
由图5和图6比较可得，尺寸小于10纳米的纳米孔用于DNA的检测，可以在较低浓度下明显检测到DNA电流脉冲信号。而在传统直径大约在40纳米的纳米孔中，只有在存在较高浓度的DNA时，才能够检测到电流脉冲的信号且信号频率较少，难以用于实际样品的检测。
不同施加电位对DNA转运的影响：
图7为不同电位下浓度为1nMλ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中的9.5nm玻璃纳米孔的电流-时间曲线：-400mV(a)，-500mV(b)，-600mV(c)和-700mV(d)。
已发现DNA转运的频率取决于所施加的电压。在低于-400mV的电压下没有观察到DNA的转运，这可能表明DNA分子在驱动通过纳米孔时解开的最小驱动力的存在。当电压增加时它会增加。图7显示在含1nMλ-DNA的10mM PBS的1.0M KCl(pH 7.4)溶液中，在9.5nm孔的不同电压下DNA转运的电流-时间响应。如图7中a所示，当施加-400mV偏压时，当前时间响应中不存在电流脉冲。图7中b显示电压增加到-500mV时的电流-时间响应。电流脉冲开始出现在当前时间在这个电压下的响应。然而，与较高电压相比，DNA转运频率相对较低。当电压增加到-600mV时，如图7中c所示，观察到更频繁的电流脉冲。比较图7的部分b和c的结果还表明，较高电压下的脉冲长度高于较低电压下的脉冲，反映纳米孔内DNA转位速度的差异。d部分是相对abc有更加频繁的电流脉冲说明在-400mV到-700mV下，随着电压的变化，电流脉冲频率持续增加。

Claims (6)

1.一种直径小于10nm的玻璃纳米孔的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)加热过程：将玻璃毛细管安装在P-2000激光微电极拉制器上，用夹具稳定两个移动棒，通过以下加热程序：加热＝550℃，灯丝＝3，速度＝99m/s，延迟＝20ms，拉＝50N，加热程序施加40秒，然后20秒冷却期，上述加热和冷却过程重复3-4次，得微孔预制棒；
2)拉制程序：将夹具从拉制器上移除，并且执行下面的拉制程序以将微孔预制棒拉成两个直径小于10nm的玻璃纳米孔，拉制程序参数：加热＝660℃，灯丝＝1，速度＝60m/s，延迟＝165ms，拉＝225-230N，拉断，即得2个直径小于10nm的玻璃纳米孔。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述玻璃毛细管内径：0.7mm；外径：1mm；长度10cm；购自Sutter公司。
3.一种直径小于10nm的玻璃纳米孔，采用权利要求1所述方法制备得到。
4.一种权利要求3所述的直径小于10nm的玻璃纳米孔用于检测DNA的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测方法为：通过将Ag/AgCl电极插入拉制后纳米孔尾部作为工作电极，Ag/AgCl电极作为对电极，工作电极和对电极浸入到pH7.4的含10mM PBS的1.0M KCl溶液中，向溶液中加入不同浓度的pBR322-DNA，分别放大并收集循环伏安曲线CV和电流–时间(I-t)曲线，构建电信号和浓度的线性关系，进而实现对DNA检测的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述pBR322-DNA购买于上海生工生物工程有限公司。
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