CN103954673A - 离子液体功能化石墨烯修饰电极用于检测5-羟色胺和多巴胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种离子液体功能化石墨烯修饰电极用于同时检测5-羟色胺和多巴胺的方法。氨基端的咪唑类离子液体和氧化石墨烯片层的环氧基团之间发生一个亲核的开环反应形成离子液体功能化石墨烯，然后将其修饰在玻碳电极上形成一层修饰层，对5-羟色胺和多巴胺同时进行检测。本发明研究表明，离子液体功能化石墨烯修饰电极对5-羟色胺和多巴胺的氧化具有很好的电催化活性，既可以单独检测5-羟色胺或多巴胺，也可以同时检测5-羟色胺和多巴胺，且检测过程简单、灵敏度高、快捷简便。

Description

离子液体功能化石墨烯修饰电极用于检测5-羟色胺和多巴胺的方法

技术领域

本发明涉及一种5-羟色胺和多巴胺的检测方法。具体是指用离子液体功能化石墨烯修饰电极对5-羟色胺和多巴胺进行检测。

背景技术

石墨烯（Graphene）是由单层碳原子以正六边形紧密排列成蜂窝状的二维平面结构，是一种典型的纳米材料，具有化学结构稳定、比表面积大等优异的力学、电学和化学性质，在电化学传感器中具有潜在的应用价值。然而，分子间作用力使得石墨烯层与层之间容易发生团聚，这不利于其在电极表面的修饰，也不利于修饰后其优点的发挥。

离子液体（IL）是指室温及接近室温下完全由阴、阳离子组成的液体物质，不但具有稳定性好和难挥发的特点，而且还具有电化学窗口宽，能促进电子传递，好的导电性和良好的生物兼容性等优点。结合石墨烯和离子液体的优点，石墨烯的团聚可以得到有效的抑制，从而提供更大的比表面积以负载更多的检测物，增强响应的灵敏性，促进各种氧化还原生物分子有效的电子转移，可以用来检测不同类型的分子。

5-羟色胺（5-HT）和多巴胺（DA）是生理体系中重要的儿茶酚胺类神经递质，也参与记忆和学习等一些认知功能。许多研究显示，5-羟色胺和多巴胺在其各自的释放中相互影响，因此同时检测5-羟色胺和多巴胺非常重要，它可以为许多疾病如帕金森病、精神疾病、抑郁症、智力缺陷、自闭症等的诊断提供信息。目前高效液相色谱法，库仑法，毛细管电泳，反相离子对高效液相色谱-电化学检测，薄层色谱法，质谱等方法已用于同时测定5-羟色胺和多巴胺的浓度。但是，以这些技术为基础的方法需要昂贵的仪器和溶剂，花费时间进行预处理，检测速度慢，成本高，而且在人体血液中其他电活性分子影响5-羟色胺和多巴胺的检测，选择性差。鉴于检测5-羟色胺和多巴胺的重要性，需要研究一个稳定、简单、有效的方法来快速监测这两种化合物。虽然，电化学方法可以满足上述要求，但通常传统的电化学方法灵敏度低，选择性差。所以，研制稳定、简单和有效的修饰电极用于同时检测5-羟色胺和多巴胺有着重大的意义。

发明内容

基于上述，本发明的目的在于提供一种制备离子液体功能化石墨烯修饰电极的方法。本发明的另一目的是用离子液体功能化石墨烯修饰电极检测5-羟色胺和多巴胺的方法。本发明与传统的方法相比，这种功能化界面的修饰电极能很好的识别5-羟色胺和多巴胺，即5-羟色胺和多巴胺在该电极上有分开的氧化峰，从而实现了对5-羟色胺和多巴胺的同时检测。

本发明的目的是这样实现的：

一种制备离子液体功能化石墨烯修饰电极的方法，其步骤是：

a.在冰浴条件下，将石墨加入到浓硫酸中，持续搅拌，再加硝酸钠和高锰酸钾，得到的浑浊混合物冷却至室温；取水加到上述混合物中，15分钟后，再加入25℃温水将其稀释，然后加入30%的双氧水，溶液变成了亮黄色；将溶液过滤，得到的氧化石墨烯真空干燥；

b.称取氨基化的离子液体加到氧化石墨烯分散液中，再加入氢氧化钾，然后将得到的混浊混合物进行超声处理，分散液呈透明、均匀的液体，并将其在80℃剧烈搅拌24 h，得到的产品进行离心分离，用水和无水乙醇洗涤，风干，然后把制得的离子液体功能化石墨烯超声分散在二次蒸馏水中得到0.5mg/mL的分散液，待用；

c.将裸玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，依次经体积分数为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗，得到处理后的裸玻碳电极；插入含有1mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用裸玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征，再将裸玻碳电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用；

d.在上述处理好的裸玻碳电极上滴涂的离子液体功能化石墨烯分散液，并置于红外灯下烤干，制得离子液体功能化石墨烯修饰的玻碳电极。

用离子液体功能化石墨烯修饰的玻碳电极同时检测5-羟色胺和多巴胺的方法，其步骤是：

a.以离子液体功能化石墨烯修饰的玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极组成三电极体系，并将其共同浸入含有不同浓度5-羟色胺和多巴胺的0.2M pH为7.0磷酸盐缓冲溶液中进行差示脉冲扫描，得到不同浓度5-羟色胺和多巴胺的差示脉冲伏安曲线图;

b.采用origin软件作图，绘制IL-graphene/GCE在不同浓度5-羟色胺和多巴胺溶液中的差示脉冲伏安曲线和相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。

本发明优点和产生的有益效果是： 

1、本发明制备的离子液体功能化石墨烯修饰电极与传统检测5-羟色胺、多巴胺的方法相比，本发明提供的离子液体功能化石墨烯修饰电极用于同时检测5-羟色胺和多巴胺的方法，具有制备简单、响应快、重现性及选择性好等优点。既可以对5-羟色胺溶液或多巴胺溶液进行单独检测，也可以同时检测5-羟色胺和多巴胺。在检测5-羟色胺和多巴胺时表现出灵敏度高，线性范围宽，较好的选择性等优异的性能。这主要是由于离子液体具有高的离子导电性，促进了5-羟色胺和多巴胺的电子转移速率，而且通过离子液体的静电排斥作用提高了材料的分散性，为负载5-羟色胺和多巴胺提供了大的有效面积，使更多的5-羟色胺和多巴胺分子附着在修饰电极的表面，增加其峰电流响应，在差示脉冲伏安扫描中的峰电流增大，降低该修饰电极对5-羟色胺和多巴胺的检测限。而且该修饰电极在差示脉冲伏安扫描中显示出不同的峰电位响应，有分开的氧化峰，能很好的识别5-羟色胺和多巴胺，实现该修饰电极对5-羟色胺和多巴胺的同时检测。

2、与目前5-羟色胺和多巴胺测定通常采用的高效液相色谱法和毛细管电泳法相比，本发明中的化学修饰电极不需要昂贵的设备和复杂的过程，其制备简单迅速，成本低，样品用量少，方法可靠。基于5-羟色胺和多巴胺特征峰位置不同，可以根据其各自的特征峰快速、准确的检测出5-羟色胺和多巴胺的浓度，也可以避免其他电活性分子（尿酸、抗环血酸等）的干扰，抗干扰性好,在5-羟色胺和多巴胺的同时测定中具有优异的特性，而且可以用来估算人体血清中5-羟色胺和多巴胺的含量。

3．离子液体功能化石墨烯修饰电极不论是对5-羟色胺和多巴胺的单独检测，还是对其同时检测，都具有线性范围宽，检测限低，检测过程简单，灵敏度高及快速简便的优点，有很好的应用前景。

附图说明

图1为不同修饰（玻碳）电极在含有5.0 mM 铁氰化钾和亚铁氰化钾的0.1M KCl溶液中的电化学阻抗谱图。其中，a: 裸电极；b: 氧化石墨烯修饰电极；c: IL-graphene修饰电极。

图2. 裸电极(a)、氧化石墨烯修饰电极(b)、IL-graphene修饰电极(c)在含有0.1mM 5-羟色胺的0.2M 磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）中的循环伏安曲线。扫速：50mV/s。

图3. 裸电极(a)、氧化石墨烯修饰电极(b)、IL-graphene修饰电极(c)在含有0.1mM多巴胺的0.2M 磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）中的循环伏安曲线。扫速：50mV/s。

图4. 裸电极(a)、氧化石墨烯修饰电极(b)、IL-graphene修饰电极(c)在含有0.1mM 5-羟色胺和多巴胺的混合溶液的0.2M 磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）中的循环伏安曲线。扫速：50mV/s。

图5. IL-graphene/GCE电极在5-羟色胺溶液中的差示脉冲伏安曲线图（从 a到j：0.7，2，5，10，20，30，40，50，70和90 μM）, 插图是相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。

图6 . IL-graphene/GCE电极在多巴胺溶液中的差示脉冲伏安曲线图（从a到j：1.5，3，7，10，20，30，50，70，90和100 μM）, 插图是相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。

图7. IL-graphene/GCE电极在含3mM 多巴胺的5-羟色胺溶液中的差示脉冲伏安曲线图（从a到k：0.2，0.5，0.8，1，2，3，4，5，7，8和10 μM），插图是相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。

图8. IL-graphene/GCE电极在含1mM 5-羟色胺的多巴胺溶液中的差示脉冲伏安曲线图（从a到j：1，5，9，10，20，30，40，60，80和100 μM），插图是相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。

图9为本发明IL-graphene/GCE对5-羟色胺和多巴胺同时检测的差示脉冲伏安曲线图，插图为相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。

具体实施方式

为了更清楚的说明本发明的内容，下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明：

本发明实施过程中所使用的仪器和药品：

CHI 660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）用于进行循环伏安的实验。石英管加热式自动双重纯水蒸馏器（1810B，上海亚太技术玻璃公司）用于蒸二次蒸馏水。电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司），用于称量药品。超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。三氧化二铝打磨粉（0.30                                                m，0.05m，上海辰华仪器试剂公司）用于处理玻碳电极。饱和甘汞参比电极，铂柱对电极，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钾（西安化学试剂厂）。石墨（99.99% SP-1，平均粒径45μ M）、硝酸钠、高锰酸钾、浓硫酸、5-羟色胺、多巴胺（Sigma公司）。实验过程中使用的水均为二次蒸馏水，实验所用的试剂均为分析纯。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的说明：

一种制备离子液体功能化石墨烯修饰电极的方法，包括以下步骤：

1.在冰浴条件下，将粒径45μM、2g石墨加入到持续搅拌的46mL的浓硫酸中，再加1g的硝酸钠和6g高锰酸钾，得到的浑浊混合物冷却至室温；将92mL的水加到上述混合物中，15分钟后，再加入25℃温水将其稀释，然后加入30%的双氧水，溶液变成了亮黄色；将溶液过滤，滤饼用二次蒸馏水反复冲洗，悬浮液进行离心分离，得到的氧化石墨烯真空干燥；

2.称取10mg氨基化的离子液体加到10mL氧化石墨烯分散液中，再加入10mg氢氧化钾，得到的混浊混合物进行超声处理，分散液呈透明、均匀的液体，将其在80℃剧烈搅拌24 h，得到的产品进行离心分离，用水和乙醇洗涤，风干。然后把制得的离子液体功能化石墨烯超声分散在二次蒸馏水中得到0.5mg/mL的分散液，待用；

3.将裸玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，再依次经体积分数为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗，得到处理后的裸玻碳电极；插入含有1mM铁氰化钾和1mM亚铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用以裸玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征；再将裸玻碳电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用；

4.在上述处理好的裸玻碳电极上滴涂3μL的离子液体功能化石墨烯分散液，并置于红外灯下烤干，制得离子液体功能化石墨烯修饰的玻碳电极；

5.用离子液体功能化石墨烯修饰电极检测5-羟色胺和多巴胺的电化学表征：

在电化学工作站的技术选项中选择循环伏安技术和电化学阻抗技术，饱和甘汞电极为参比电极，铂柱为对电极，直径3mm的玻碳电极为工作电极。并将其共同浸入含有5-羟色胺和多巴胺的0.2M磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)中进行差示脉冲扫描，采用origin软件作图，得到不同浓度5-羟色胺和多巴胺的差示脉冲伏安曲线图和相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。循环伏安技术的电位窗设置为0V-0.8V、-0.2V-0.6V和-0.2V-0.8V。

图1为本发明不同修饰（玻碳）电极在含有5.0 mM 铁氰化钾和亚铁氰化钾的0.1M KCl溶液中的电化学阻抗谱图。其中，a: 裸玻碳电极；b: 氧化石墨烯修饰电极；c: IL-graphene修饰电极。电化学阻抗谱（EIS）可以得到电极表面阻抗变化的信息。一般一个典型的阻抗谱图包括两部分，其中高频区测得的半圆部分由电子传递过程控制，其直径大小等于电极表面电子传递电阻（Ret）的数值，反映的是一个典型的受电子传递控制的过程；而在低频部分是一段和特征半圆相连的直线，反映的是一个由扩散控制的电子传递过程。图1中，a裸玻碳电极的阻抗谱是由一个小的半圆（电阻:74Ω）和一条接近于直线的尾线组成，从图1中可以看出裸玻碳电极的电阻比较大，阻碍了溶液中电子的传递。当氧化石墨烯修饰到玻碳电极表面后，形成了与a曲线相似的b曲线，但是电子转移时的电阻值增加到157Ω，电阻值的增加主要是由于氧化石墨烯片层上含有许多的含氧官能团，阻碍了电子的转移，而且氧化石墨烯上有许多带负电的离子化的官能团，和带负电荷的[Fe(CN)₆]^3-/4-会产生排斥力，使氧化石墨烯修饰电极的导电性比裸电极还差。然而，当IL-graphene修饰到玻碳电极表面后，高频区几乎是一条直线c，该修饰电极的导电性比较好，有利于溶液中电子的传递，这说明离子液体对氧化石墨烯导电性的提高起着重要的作用。

图2、图3、图4分别为不同修饰电极在含有0.1mM 5-羟色胺、0.1mM多巴胺和0.1mM 5-羟色胺和多巴胺的混合溶液的0.2M磷酸盐缓冲溶液（pH 7.0）中的循环伏安曲线。其中a: 裸电极；b: 氧化石墨烯修饰电极；c: IL-graphene修饰电极。由图2、3、4中可以看出：5-羟色胺和多巴胺在IL-graphene/GCE电极上的循环伏安响应比其在GO/GCE和裸玻碳电极上都大得多，究其原因，离子液体对促进5-羟色胺和多巴胺的电化学氧化起着重要的作用，离子液体具有高的离子导电性，促进了5-羟色胺和多巴胺的电子转移速率。而且通过离子液体的静电排斥作用提高了IL-graphene材料的分散性，为负载5-羟色胺和多巴胺提供了大的有效面积，为证明此结论，并根据Randles–Sevcik方程计算了修饰电极的有效面积。

Ip = 2.69 × 10⁵ × A × D^1/2 × n^3/2 × v ^1/2 × c                   (1)

此方程中Ip表示氧化还原峰电流，A表示修饰电极的有效面积，溶液中分子的扩散系数D是(6.70+0.02)×10^-6 cm²/s，n表示电子转移数，c表示氧化还原探针的浓度(mol/cm³)，v表示扫速(V/s)。根据方程(1)，用DA分子作为电化学探针，得到了A的近似值，IL-graphene/GCE电极的有效面积(0.192 cm²)比GO/GCE (0.119 cm²)和裸GCE (0.071 cm²)电极都大，这为负载5-羟色胺和多巴胺提供了大的有效面积，使该修饰电极对溶液响应的峰电流明显增大。

图5、图6、图7、图8分别为IL-graphene/GCE电极在5-羟色胺溶液（图5），多巴胺溶液(图6)，含3μM 多巴胺的5-羟色胺溶液(图7)，含1μM 5-羟色胺的多巴胺溶液(图8)中的差示脉冲伏安曲线图，图中的插图是相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。由图5、图6、图7、图8可以看出，分别检测5-羟色胺和多巴胺时，5-羟色胺的线性范围为0.7-90μM，检测限为0.23μM，多巴胺的线性范围为1.5-100μM，检测限为0.5μM。在含3μM 多巴胺的5-羟色胺溶液的混合溶液中测定5-羟色胺时，5-羟色胺的线性范围为0.2-10μM，检测限为0.067μM。含1μM 5-羟色胺的多巴胺溶液的混合溶液中测定多巴胺时，多巴胺的线性范围为1.0-100μM，检测限为0.33μM。从图5、图6、图7、图8中可以得知，如果用修饰的玻碳电极(IL-graphene/GCE)单独检测5-羟色胺溶液或多巴胺溶液时，它们的线性范围一致，都约为两个数量级，但5-羟色胺的检测限低于多巴胺的检测限；若同时检测含多巴胺的5-羟色胺溶液或含5-羟色胺的多巴胺溶液时，共存物质对检测物的检测没有影响，它们的线性范围也基本一致，也都约为两个数量级，且5-羟色胺的检测限还是低于多巴胺的检测限。

图9为IL-graphene/GCE分别对1，3，5，7，9，20，30和40 μM的5-羟色胺和多巴胺同时检测的差示脉冲伏安曲线图，图中的插图为相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。由图9可以看出，同时检测5-羟色胺和多巴胺的线性范围为1.0-40μM。图5、图6、图7、图8和图9说明：本发明与现有传感器相比，既能分别检测5-羟色胺溶液或多巴胺溶液，也能同时检测5-羟色胺和多巴胺，从而实现了对5-羟色胺和多巴胺的同时检测。这主要是由于该修饰电极能很好的识别5-羟色胺和多巴胺，即5-羟色胺和多巴胺在该修饰电极上的差示脉冲伏安扫描的特征峰位置不同，有分开的氧化峰，可以根据其各自的特征峰快速、准确的检测出5-羟色胺和多巴胺的浓度，而且该修饰电极良好的离子导电性提高了5-羟色胺和多巴胺的检测限，检测过程简单，灵敏度高，快速简便。解决了传统的电化学方法检测5-羟色胺和多巴胺灵敏度低，选择性差的问题。

6.修饰电极的后处理：

检测完毕后，将修饰电极从电化学检测池中取出，用 0.05 μM的三氧化二铝抛光，电极表面的离子液体功能化石墨烯可以完全脱落。

Claims (2)

1.一种制备离子液体功能化石墨烯修饰电极的方法，其步骤是：

a.在冰浴条件下，将石墨加入到浓硫酸中，持续搅拌，再加硝酸钠和高锰酸钾，得到的浑浊混合物冷却至室温；取水加到上述混合物中，15分钟后，再加入25℃温水将其稀释，然后加入30%的双氧水，溶液变成了亮黄色；将溶液过滤，得到的氧化石墨烯真空干燥；

b.称取氨基化的离子液体加到氧化石墨烯分散液中，再加入氢氧化钾，然后将得到的混浊混合物进行超声处理，分散液呈透明、均匀的液体，并将其在80℃剧烈搅拌24 h，得到的产品进行离心分离，用水和无水乙醇洗涤，风干，然后把制得的离子液体功能化石墨烯超声分散在二次蒸馏水中得到0.5mg/mL的分散液，待用；

c.将裸玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm的三氧化二铝悬浊液抛光成镜面，依次经体积分数为95 %的乙醇、二次蒸馏水超声清洗，得到处理后的裸玻碳电极；插入含有1mM铁氰化钾探针分子的0.1M氯化钾电解质溶液中，并采用裸玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极的三电极体系进行循环伏安扫描，对裸玻碳电极进行表征，再将裸玻碳电极取出用二次蒸馏水冲洗并吹干，备用；

d.在上述处理好的裸玻碳电极上滴涂的离子液体功能化石墨烯分散液，并置于红外灯下烤干，制得离子液体功能化石墨烯修饰的玻碳电极。

2.权利要求1制备的离子液体功能化石墨烯修饰的玻碳电极用于同时检测5-羟色胺和多巴胺的方法，其步骤是：

a.以离子液体功能化石墨烯修饰的玻碳电极为工作电极、铂柱为对电极、饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，并将其共同浸入含有不同浓度5-羟色胺和多巴胺的0.2M pH为7.0磷酸盐缓冲溶液中进行差示脉冲扫描，得到不同浓度5-羟色胺和多巴胺的差示脉冲伏安曲线图；

b.采用origin软件作图，绘制IL-graphene/GCE在不同浓度5-羟色胺和多巴胺溶液中的差示脉冲伏安曲线和相应的氧化峰电流与其浓度的线性关系图。