CN103604849B - 一种同时检测多巴胺、抗坏血酸和尿酸的电化学传感器 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于多巴胺、抗坏血酸和尿酸同时检测的电化学传感器。所述电化学传感器包含工作电极、参比电极和对电极，其中，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面修饰石墨烯与介孔四氧化三铁的复合材料，所述参比电极和对电极分别为饱和甘汞电极和铂丝电极。在最佳条件下，不仅实现了在较高浓度的共存物质存在时单一物质的测定，而且还可对多巴胺、抗坏血酸和尿酸进行同时检测。本发明的电化学传感器，不仅避免了多巴胺、抗坏血酸和尿酸峰电位相互重叠的现象，而且提高了已有方法的灵敏度、重现性与稳定性。

Description

一种同时检测多巴胺、抗坏血酸和尿酸的电化学传感器

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种电化学传感器，更具体而言，本发明涉及一种基于石墨烯与介孔四氧化三铁复合材料构建的电化学传感器，其用于多巴胺、抗坏血酸和尿酸的同时检测。

背景技术

多巴胺(Dopamine Acid，DA)是一种神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲。这种脑内分泌主要负责大脑的情欲、感觉，负责开心及兴奋的信息传递，也与上瘾有关。此外，体内多巴胺的失调是导致神经肌肉失调、帕金森氏症、心脏病和各种精神疾病的重要原因。

抗坏血酸(Ascorbic Acid，AA)是人体生命活动必需的一种水溶性维生素。在氧化还原代谢反应中起调节作用，缺乏抗坏血酸可引起坏血病。

尿酸(Uric Acid，UA)是嘌呤新陈代谢的最终产物。许多疾病的临床表现就是UA水平异常，如尿酸水平高往往是一些疾病如痛风、Lesch-Nyhan氏综合症、肥胖、糖尿病、高胆固醇、高血压等的征兆；而尿酸水平低则与肾病、威尔逊氏症等疾病有关。

通常情况下，多巴胺、抗坏血酸和尿酸在中枢神经系统细胞外液及血清等体液中是共存的。在一般的基体电极上，三组分均能发生电化学氧化，峰电位出现相互重叠现象，无法进行区分测定。近年来，纳米粒子、自组装膜及聚合膜修饰电极已应用于多巴胺、抗坏血酸和尿酸的同时测定中。但是，其选择性及检出限还不是很令人满意。因此，建立一种简便快捷的多巴胺、抗坏血酸和尿酸的同时测定方法是十分必要的。

本发明在电极上修饰石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物，对影响传感器性能的因素如石墨烯与介孔四氧化三铁的比例及其复合物的浓度、pH等条件进行了优化，成功制备了同时检测多巴胺、抗坏血酸和尿酸的电化学传感器。测试结果显示，上述方法制备的电化学传感器与现有电化学传感器方法相比线性范围宽、检出限低，具有高的灵敏度、选择性和稳定性，基于上述发现，发明人完成了本发明。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种电化学传感器，所述电化学传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面修饰石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物。

本发明的再一个目的在于提供一种电化学传感器的制备方法，所述方法制备的传感器灵敏度高、重现性好、操作简便。

本发明的另一目的是提供所述电化学传感器在同时检测多巴胺、抗坏血酸和尿酸中的用途。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的。

本发明的电化学传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面修饰石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物。所述工作电极与参比电极、对电极组成电化学传感器来同时检测多巴胺、抗坏血酸和尿酸。所述参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂丝电极。

本发明的电化学传感器的制备方法包括以下步骤：

a、合成石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物；

b、制备电化学传感器工作电极；

c、制作电化学传感器工作曲线。

其中，步骤a的合成石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物，具体包括以下步骤：

①氧化石墨烯的合成：将质量比1:6的石墨粉和高锰酸钾加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合液中，50℃油浴搅拌12h，反应结束后将样品倾倒在冰上，同时磁力搅拌，加入30%H₂O₂，反应0.5h，此后将得到的混合物离心、洗涤、弃去上清液，经干燥后得到棕黄色固体粉末氧化石墨烯；

②石墨烯的合成：将上述步骤①制得的氧化石墨烯，超声分散在40mL的超纯水中，磁力搅拌，在N₂的保护下慢慢滴加80%水合肼，100℃反应24h，得到黑色溶液，离心、弃去上清液，洗涤固体，室温下真空干燥24h，即得到所需的石墨烯；

③介孔四氧化三铁的合成：称取1g FeCl₃·6H₂O溶解在20mL乙二醇溶液中，形成透明的溶液，然后再加入3g NaAc和10mL乙二胺，混合物在强烈的搅拌下反应30min，然后封装在聚四氟乙烯的反应釜中，在200℃下加热8h，冷却至室温，利用磁铁将黑色固体分离，洗涤数次，直至上清液澄清，真空干燥24h，得到黑色粉末，即为介孔四氧化三铁；

④石墨烯与介孔四氧化三铁复合物的合成:石墨烯与介孔四氧化三铁以2:1～2:3的质量比混合，超纯水分散，振荡2h，磁力分离，超纯水洗涤。

优选，所述石墨烯与介孔四氧化三铁的质量比为1:1。

步骤b的制备电化学传感器工作电极的方法，具体包括以下步骤：

①将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；

②将步骤a制备的石墨烯与介孔四氧化三铁复合物滴到上述处理的玻碳电极上，室温晾干，即得到电化学传感器的工作电极；

其中，优选所述石墨烯与介孔四氧化三铁复合物的浓度为0.5～1.5mg·mL^-1，最优选其浓度为1.0mg·mL^-1。

步骤c的制作电化学传感器工作曲线，步骤如下：

①将作为参比电极的饱和甘汞电极、作为对电极的铂丝电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；

②以含有多巴胺、抗坏血酸和尿酸的pH=6.0～9.0的PBS作为底液，通过固定其中两种物质的浓度，而只改变另一种物质的浓度或同时改变三种物质的浓度，采用差分脉冲伏安法分别测定相应的电流值，绘制相应的工作曲线；其中，优选所述PBS缓冲溶液的pH值为7.0。

本发明的有益成果：

（1）本发明直接将石墨烯与介孔四氧化三铁复合物修饰到电极上，为单层修饰，大大避免了多层修饰带来的修饰误差，具有多层修饰电极不可比拟的稳定性。

（2）在本发明的制作方法中，石墨烯与介孔四氧化三铁复合物表现出很强的附着能力，薄膜均匀、稳定，制作电极所用时间短。

（3）由本发明的方法制备的电化学传感器，不仅避免了多巴胺、抗坏血酸和尿酸峰电位相互重叠的现象，而且提高了已有方法的灵敏度、重现性与稳定性。与现有电化学传感器方法相比具有线性范围宽、检出限低，操作简单，检测速度快的优点，可在短时间内实现多巴胺、抗坏血酸和尿酸的同时测定。

（4）由本发明的方法制备的电化学传感器，不仅可以在较高浓度的共存物质存在时实现单一物质的测定，而且还可对多巴胺、抗坏血酸和尿酸进行同时检测。

本发明的电化学传感器表现出了优良的准确性、稳定性、重现性与高的灵敏度，分析检测迅速、方便，可用于临床分析。

附图说明

下面结合附图说明和具体实施例对本发明做进一步详细描述。

图1为AA、DA、UA在本发明的石墨烯与介孔四氧化三铁复合物修饰电极(a)和裸玻碳电极(b)上的差分脉冲伏安图，其中，所述石墨烯与介孔四氧化三铁复合物中，二者的质量比为1:1。

图2为AA和DA存在时UA单独测定的差分脉冲伏安图。AA浓度为100μmol·L^-1AA；DA浓度为5.0μmol·L^-1；UA的浓度自下而上依次为1.0,5.0,10,20,40,70,100,150,200,300,400,450,500,550,600,650,700,750,800,850μmol·L^-1。

图3为AA、DA、UA三种物质同时检测时的差分脉冲伏安图。AA的浓度自下而上依次为10,100,200,300,400μmol·L^-1；DA的浓度自下而上依次为0.2,3.0,5.0,10,30μmol·L^-1；UA的浓度自下而上依次为3.0,20,30,80,170μmol·L^-1。

具体实施方式

本发明使用的多巴胺(98%)购自上海晶纯试剂有限公司，尿酸、氯化铁、石墨粉和铁氰化钾购自国药集团化学试剂有限公司，抗坏血酸(99.7%)购自天津市北方天医化学试剂厂，水合肼、过氧化氢、磷酸二氢钾和磷酸氢二钠均购于天津市广成化学试剂有限公司，整个实验过程用的均是超纯水。

CHI760D电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。

实施例1

（1）合成石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物

氧化石墨烯的合成：将0.3g的石墨粉和1.8g高锰酸钾混合，放入带有磁子的三口瓶中，将体积比为9:1混合的浓硫酸和磷酸混合液40mL加入到以上三口瓶中。将三口瓶放入油浴，加热到50℃，反应12h，反应结束之后，将样品倾倒到大约40mL的冰上，同时把磁子放到倾倒的冰水混合物上，慢慢的磁力搅拌，加入30%过氧化氢0.3mL，冰逐渐融化，磁力搅拌0.5h。反应结束后，将得到的混合物在8000R的转速下离心0.5h，然后分别用20mL的水、20mL30%的盐酸、20mL乙醇分别离心洗涤三次，弃去上清液，最后用20mL乙醚离心洗涤，弃去上清液，最后得到的固体样品放到真空干燥箱35℃干燥，干燥完后得到棕黄色固体粉末氧化石墨烯；

石墨烯的合成：称取0.3g上述步骤制得的氧化石墨烯，超声分散在40mL的超纯水中。磁力搅拌，在N₂的保护下慢慢滴加0.3mL80%水合肼，100℃反应24h，得到黑色溶液，离心、弃去上清液，将固体用超纯水洗涤三次，室温下真空干燥24h，即得到所需的石墨烯。通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜(TEM)可知，石墨烯呈现出不规则的纸状结构。

介孔四氧化三铁的合成：称取1g FeCl₃·6H₂O溶解在20mL乙二醇溶液中，形成透明的溶液，然后加入3g NaAc和10mL乙二胺，混合物在强烈的搅拌下反应30min，然后封装在聚四氟乙烯的反应釜中加热8h(200℃)，冷却至室温，利用磁铁将黑色固体分离用水洗涤数次，直至上清液澄清。真空干燥24h，得到黑色粉末，即介孔四氧化三铁。从介孔四氧化三铁的TEM可知，其孔径约为50nm且分散较好。

石墨烯与介孔四氧化三铁复合物的合成:将上述制备得到的石墨烯与介孔四氧化三铁分别以2:1、3:2、1:1、2:3的质量比混合，超纯水分散，振荡2h，磁力分离，超纯水洗涤。

在玻碳电极表面分别滴涂5μL浓度为1.0mg·mL^-1上述制备的石墨烯与介孔四氧化三铁复合物的溶液，晾干后采用差分脉冲伏安法进行扫描，用于考察石墨烯与介孔四氧化三铁不同比例对AA、DA、UA的电流响应的影响。实验表明，在裸玻碳电极上，DA和AA的氧化峰相互干扰无法分辨，而在电极上修饰石墨烯与介孔四氧化三铁复合物后，两者氧化峰明显分离，且三种检测物的峰电流都大大增加，如图1所示。当石墨烯与介孔四氧化三铁的比例1:1时，复合纳米材料所构建的电化学传感器可很好地将三种物质的电化学响应峰分开，对AA、DA、UA电流响应最大。

（2）制备电化学传感器工作电极

①将4mm直径的玻碳电极用1.0、0.3、0.05μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，乙醇超声清洗，再用超纯水冲洗干净，然后将电极置于0.05mol·L^-1铁氰化钾溶液中，在-0.2～0.6V扫描，使峰电位差小于110mV，用超纯水清洗电极表面，吹干，得到表面光洁的玻碳电极；

②将5～6μL质量比为1:1的石墨烯与介孔四氧化三铁复合物分别配成浓度为0.5mg·mL^-1,0.8mg·mL^-1,1.0mg·mL^-1,1.2mg·mL^-1和1.5mg·mL^-1的溶液，并分别滴到上述处理得到的表面光洁的玻碳电极上，室温晾干，即得到多个电化学传感器的工作电极。

当石墨烯与介孔四氧化三铁复合物的浓度增大到1.0mg·mL^-1时，AA、DA、UA的电流响应随石墨烯与介孔四氧化三铁复合物浓度的增大而增大。但当石墨烯与介孔四氧化三铁复合物浓度继续增大到1.0mg·mL^-1时，响应电流逐渐减小。因此选择1.0mg·mL^-1作为石墨烯与介孔四氧化三铁复合物的最佳浓度。

（3）制作电化学传感器工作曲线

打开电化学工作站，将作为参比电极的饱和甘汞电极、作为对电极的铂丝电极和石墨烯与介孔四氧化三铁的质量比为1:1、并且石墨烯与介孔四氧化三铁复合物的浓度为1.0mg·mL^-1时制备的工作电极正确连接在电化学工作站上；

在pH=6.0～9.0的PBS缓冲溶液中分别考察了底液酸度对AA、DA、UA峰电流的影响。相比较而言，DA和UA受pH的影响较大，而AA基本不受pH值的影响。随着pH的增加，DA和UA峰电流先增大后减少，当pH为7.0时电流响应值最大。

因此，将10mL pH7.0的PBS缓冲溶液作为底液，采用差分脉冲伏安法分别测定不同情况下多巴胺、抗坏血酸和尿酸的电流值；根据所得电流响应与多巴胺、抗坏血酸和尿酸标准溶液的浓度关系，绘制工作曲线。

实施例2抗坏血酸、多巴胺存在时尿酸的检测

按照实施例1的步骤构建电化学传感器用于尿酸的检测。固定DA和AA的浓度，改变UA的浓度，石墨烯与介孔四氧化三铁复合物修饰的电极对三种物质的差分脉冲伏安图如图2所示。由图2可以看出，三种物质的氧化峰明显分开且峰型较好。在1.0～850μmol·L^-1浓度范围内，UA的最大峰电流值与其浓度的平方根成正比，线性相关系数r=0.993，检出限为0.056μmol·L^-1。

实施例3尿酸、多巴胺存在时抗坏血酸的检测

按照实施例1的步骤构建电化学传感器用于抗坏血酸的检测。固定DA和UA的浓度，改变AA的浓度，绘制修饰电极对三种物质的差分脉冲伏安图。由图可以得到在5.0～1600μmol·L^-1浓度范围内AA最大峰电流值与其浓度的平方根成正比，线性相关系数r=0.984，检出限为0.074μmol·L^-1。

实施例4抗坏血酸、尿酸存在时多巴胺的检测

按照实施例1的步骤构建电化学传感器用于多巴胺的检测。固定AA和UA的浓度，改变DA的浓度，绘制修饰电极对三种物质的差分脉冲伏安图。由图可以得到在0.2～38μmol·L^-1浓度范围内，DA最大峰电流值与其浓度的平方根成正比，线性相关系数r=0.993，检出限为0.126μmol·L^-1。

将实施例2、3和4得到的结果和文献进行了对比。通过对比可以发现，本发明的电化学传感器的检出限较低，线性范围较宽，具有较高的灵敏度，这为多巴胺、抗坏血酸和尿酸的实际测定奠定了基础。

实施例5抗坏血酸、多巴胺和尿酸的同时检测

按照实施例1的步骤构建电化学传感器用于多巴胺、尿酸和抗坏血酸的同时检测。同时改变AA、DA、UA的浓度，绘制三种物质同时检测的差分脉冲伏安图，如图3所示。根据最大峰电流值与其浓度的平方根成正比的关系，得到AA、DA、UA的线性范围依次为10～400μmol·L^-1、0.2～30μmol·L^-1、3.0～170μmol·L^-1，检测限分别为0.15μmol·L^-1、0.05μmol·L^-1、0.39μmol·L^-1。

实施例6实际样品中抗坏血酸、多巴胺和尿酸的检测

表1实际样品中多巴胺、尿酸和抗坏血酸的检测结果(n为平行测定的次数)

按照实施例1的步骤构建电化学传感器用于实际样品中多巴胺、抗坏血酸和尿酸的检测。将维生素C注射液、盐酸多巴胺注射液及尿液用pH7.0的PBS缓冲溶液分别稀释500、600及50倍之后，测定出稀释后的样品中抗坏血酸、多巴胺和尿酸的含量。然后向稀释后的样品中加入一定浓度的标准溶液(见表1)，进行加标回收实验，通过测定计算得到的回收值与加入量的比值计算出平均回收率。

由表1检测结果可知，结果的相对标准偏差(RSD)小于4.0%，平均回收率为96.2～105%，表明本发明用于实际样品中多巴胺、尿酸和抗坏血酸的检测，方法精密度高，结果准确可靠。

综上分析，该修饰电极能够高灵敏地实现共存物质存在时单一物质的测定以及多巴胺、抗坏血酸和尿酸三种物质的同时测定，且具有较低的检出限和较宽的线性范围。

Claims (1)

1.一种同时检测多巴胺、抗坏血酸和尿酸的电化学传感器的制备方法，所述的电化学传感器包含工作电极、参比电极和对电极，其中，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面修饰石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物；

其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

a、合成石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物；

b、制备电化学传感器工作电极；

c、制作电化学传感器工作曲线；

其中，步骤a所述的石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物的具体制备步骤如下：

（1）在N₂的保护下，将80 %的水合肼加入到氧化石墨烯溶液中，100 ℃反应24 h，得到石墨烯；

（2）将FeCl₃·6H₂O溶解在乙二醇溶液中，然后再加入NaAc和乙二胺，在强烈的搅拌下反应30 min后，200 ℃下加热8 h，得到介孔四氧化三铁；

（3）石墨烯与介孔四氧化三铁以2:1~2:3的质量比混合，超纯水分散，振荡2 h，磁力分离，超纯水洗涤；

步骤b所述的制备电化学免疫传感器工作电极的具体步骤如下：

（1）将玻碳电极表面进行抛光处理使其表面光洁；

（2）取步骤a合成的0.5~1.5 mg·mL^-1石墨烯与介孔四氧化三铁的复合物5~6 μL，均匀滴涂在所述玻碳电极表面，室温下晾干备用；

步骤c所述的制作电化学免疫传感器工作曲线的具体步骤如下：

（1）将参比电极、对电极和上述制备的工作电极正确连接在电化学工作站上，所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极；

（2）以含有多巴胺、抗坏血酸和尿酸的pH=6.0~9.0的PBS作为底液，通过固定其中两种物质的浓度，而只改变另一种物质的浓度或同时改变三种物质的浓度，采用差分脉冲伏安法分别测定相应的电流值；绘制相应的工作曲线。