CN103343126B - 莱克多巴胺适配体与检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器 - Google Patents
莱克多巴胺适配体与检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种莱克多巴胺适配体以及检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。本发明所述的莱克多巴胺适配体为含有AGTGCGGGC序列、长度为13-20bp的单链DNA探针，且5’端修饰了氨基即5’-NH2-(CH2)6-。本发明所述的检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器含有所述的莱克多巴胺适配体。传感器提高了检测莱克多巴胺的灵敏性，最低可以检测出0.1ng/mL的莱克多巴胺；大大降低了检测莱克多巴胺的成本，操作简单方便，可实现对莱克多巴胺的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，涉及一种莱克多巴胺适配体以及检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。
背景技术
莱克多巴胺(RAC)是苯乙醇胺类β2-肾上腺素兴奋剂，能够显著提高动物胴体的瘦肉率和降低体内脂肪的沉积率，因而被大量非法用于畜牧生产。食用残留有RAC的动物内脏，常造成人急性或慢性食物中毒。此外，RAC还是一种食源性兴奋剂，是大型运动赛事动物源性食品安全监控的重要项目。世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会(JECFA)规定RAC在肝脏、肾脏、肌肉中最大残留限量(maximalresiduelimits，MRLs)分别为40.0、90.0、10.0ng/mL。
目前关于莱克多巴胺类抗生素的检测方法有免疫分析法、毛细管电泳法、电化学法、质谱连用法和高效液相色谱法等，其中免疫分析法特异性较高，但存在高背景吸收、操作繁琐(需大量的孵育及洗涤步骤)以及酶易受样品影响等缺点，毛细血管法分析速度快、分离效率高、运行成本低，但技术不是很成熟，且不适用于小分子的检测，质谱连用法和高效液相色谱法需要大型的仪器，价格昂贵。电化学方法具有操作简单、特异性好、灵敏度高、可在线和易于微型化等优点，目前已引起了人们的广泛关注。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于样品中莱克多巴胺含量快速检测的生物传感器。该生物传感器灵敏度更高，响应时间更快，并且可快速用于样品中莱克多巴胺检测的生物传感器及其组装方法。
为了解决现有莱克多巴胺检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的缺点，本发明的第一个目的是提供一种莱克多巴胺适配体。
本发明所述的莱克多巴胺适配体为含有AGTGCGGGC序列、长度为13-20bp的单链DNA探针，且5’端修饰了氨基即5’-NH2-(CH2)6-。
本发明的第二个目的是提供一种检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器。
本发明所述的检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器，含有本发明所述的莱克多巴胺适配体。
本发明的第三个目的是提供一种适配体电化学生物传感器的制备方法。
本发明所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用超纯水超声清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液于20-25℃下活化10分钟，得到活化的裸金电极；
(2)活化电极的适配体修饰：合成如本发明所述的适配体，配制100μmol/L的适配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L适配体组装液；将步骤(1)所得的活化的裸金电极浸入适配体组装液中，密封4℃下组装24小时，得到所述的适配体电化学生物传感器。
根据本发明所述的适配体电化学生物传感器的制备方法的进一步特征，所述步骤(1)中采用的Piranha溶液中，浓硫酸与30％H2O2的体积比是7:3。
本发明的第四个目的是提供一种本发明所述的适配体电化学生物传感器的用途，即将本发明所述的适配体电化学生物传感器用于检测莱克多巴胺的用途。
本发明的第五个目的是提供一种检测莱克多巴胺的方法，该方法是基于本发明所述的适配体电化学生物传感器的检测方法。
本发明所述的基于如本发明所述的适配体电化学生物传感器的检测莱克多巴胺的方法，包括以下步骤：
(1)对莱克多巴胺标准溶液进行检测，建立标准曲线：
将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；
将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]电解液中，电解液含浓度0.1mol/L的KCl，差分脉冲伏安法(DPV)分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到适配体传感器的DPV图谱及其峰电流值Ip0；
将差分脉冲伏安分析后的适配体传感器用超纯水冲洗后浸入浓度0.05ng/mL的莱克多巴胺水溶液中，室温孵育15min，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的莱克多巴胺，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]，含浓度0.1mol/LKCl的电解液中进行差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到浓度0.05ng/mL的莱克多巴胺标准液的DPV图谱及其峰电流值Ip1。
同理，将上述修饰电极依次放入浓度0.1ng/mL、0.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×102ng/mL的莱克多巴胺标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行差分脉冲伏安分析，记录其对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn(n＝2,3…7)，并计算各标准液相对初始的适配体传感器的峰电流变化值ΔIp即各标准液对应的峰电流值Ipn(n＝1,2,3…7)减去适配体传感器对应的峰电流值Ip0。
以浓度为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×102ng/mL的莱克多巴胺标准液浓度的对数为横坐标，以这7种标准液对应的峰电流变化值△Ip为纵坐标作图，建立标准曲线；
(2)对含莱克多巴胺的样品溶液进行定量检测：
根据GB/T21317-2007所述方法对样品中的莱克多巴胺进行提取纯化；将得到的莱克多巴胺干粉用超纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测；
将差分脉冲伏安分析后的适配体传感器用超纯水冲洗后浸入从实际样品溶液中提取纯化得到的莱克多巴胺水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]，含浓度0.1mol/LKCl的电解液中进行差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到实际样品中莱克多巴胺溶液检测的DPV图谱及其峰电流值Ips。
通过步骤(1)建立的标准曲线，计算出Ips-Ip0对应的莱克多巴胺浓度即为实际样品中莱克多巴胺的浓度。
本发明所述的检测方法的原理是：在有莱克多巴胺存在的情况下，本发明中所述适配体与莱克多巴胺特异性结合，引起所述适配体的空间构象及其在金电极表面取向的变化，进一步影响电解液中电化学活性指示剂铁氰化钾与电极界面的电子转移速率，即表现为电子转移阻抗变化，通过电化学活性指示剂铁氰化钾显示的峰电流值与莱克多巴胺浓度的对数之间的线性关系，建立莱克多巴胺的快速电化学传感器检测技术。
本发明的有益效果在于：
(1)提供了一种对目标莱克多巴胺非常敏感的适配体作为分子识别元件。与抗体相比，核酸适配体具有靶分子范围广，亲合力强，特异性高，稳定性好，制备、修饰方便快速，变性复性可逆，分子量小，无毒性、无免疫原性、组织渗透性好等优点。
(2)基于本发明所述的适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器，可以将样品中莱克多巴胺目标物的存在转变为电信号进行快速检测。它将电化学方法的高灵敏性和适配体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生，不受样品中脂血、溶血情况干扰。
(3)本发明解决了现有莱克多巴胺检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长的缺点。本发明采用可特异性识别莱克多巴胺的核酸适配体应用于电化学传感器，大大提高了检测的灵敏性和特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性，是一种检测快速，检测成本低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。
附图说明
图1为莱克多巴胺适配体修饰电极在不同浓度莱克多巴胺标准溶液中检测的差分脉冲伏安图谱。
图2为莱克多巴胺适配体修饰电极在不同浓度莱克多巴胺标准溶液中检测的信号变化趋势图。
图3为莱克多巴胺标准品溶液检测得到的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步地描述。
实施例一：适配体电化学生物传感器的构建
(1)裸金电极表面的抛光及活化处理
将裸金电极用0.3μm的氧化铝粉末打磨10分钟，再用0.05μm的氧化铝粉末打磨20分钟，然后用超纯水超声清洗2次，每次5分钟，彻底去除非特异性吸附在裸金电极表面的氧化铝粉末。将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液(浓硫酸:30％H2O2＝7:3，V:V)于室温下活化10分钟，得到活化的裸金电极。然后分别用超纯水和无水乙醇超声清洗2次，每次5分钟。
(2)适配体电化学传感器的修饰
取2μL浓度100μmol/L的莱克多巴胺适配体溶液加入到98μL浓度1mol/L的NaCl溶液中，配制成2μmol/L适配体组装液，转入50mL离心管中；将步骤(1)抛光活化处理后的裸金电极放入50mL离心管并浸入适配体组装液中，密封后，4℃下组装24小时，即得到莱克多巴胺核酸适配体修饰的电极。
莱克多巴胺核酸适配体序列从5’端到3’端的核酸序列如：ACGCAGTGCGGGCGA(SEQIDNO.1)，5’端修饰了氨基即5’-NH2-(CH2)6-。
浓度100μmol/L的莱克多巴胺适配体溶液是5’端修饰了氨基即5’-NH2-(CH2)6-的DNA适配体探针溶液。
实施例二：莱克多巴胺适配体电化学生物传感器对莱克多巴胺标准溶液的电化学响应
(1)将实施例一制作的电化学核酸适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极。将实施例一制作的电化学核酸适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]电解液中，电解液含浓度0.1mol/L的KCl，差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到适配体传感器的DPV图谱及其峰电流值Ip0。
(2)将步骤(1)所述的适配体传感器用超纯水冲洗后浸入浓度0.05ng/mL的莱克多巴胺水溶液中，室温孵育反应15min，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的莱克多巴胺，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]，含浓度0.1mol/LKCl的电解液中。差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到浓度0.05ng/mL的莱克多巴胺标准液的DPV图谱及其峰电流值Ip1。
(3)同理，将步骤(2)所述的适配体电极依次放入浓度0.1ng/mL、0.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×102ng/mL的莱克多巴胺标准液中，分别于室温下孵育反应15min，分别进行差分脉冲伏安分析，记录其对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn(n＝2,3…8)。
(4)计算步骤(2)与步骤(3)中各标准液相对步骤(1)中适配体传感器的峰电流变化值ΔIp即各标准液对应的峰电流Ipn(n＝1,2,3…8)减去适配体传感器对应的峰电流Ip0。以浓度为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×102ng/mL的莱克多巴胺标准液浓度的对数为横坐标，以这8种标准液对应的峰电流变化值ΔIp为纵坐标作图，建立标准曲线。如图1和图2所示，随着莱克多巴胺浓度的增加，响应信号Ip呈现出递增趋势。在5.0×10-2ng/mL-1.0×102ng/mL浓度范围内，峰电流值的差值△Ip与莱克多巴胺浓度的对数呈现良好的线性关系(R2＝0.9749)，线性方程为△Ip(μA)＝1.3lgC(ng/mL)+2.3(图3)，检测限为0.1ng/mL。
实施例三：对含莱克多巴胺的配合饲料进行定量检测
配合饲料样品的处理：取5.00g配合饲料样品，加入不同浓度的莱克多巴胺，根据GB/T22147-2008所述方法对复合饲料中的莱克多巴胺进行提取纯化。将得到的莱克多巴胺干粉用超纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测。
将实施例一制作的电化学核酸适配体传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]电解液中，电解液含浓度0.1mol/L的KCl，差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到适配体传感器的DPV图谱及其峰电流值Ip0。
将差分脉冲伏安分析后的适配体传感器用超纯水冲洗后浸入从复合饲料中提取纯化得到的莱克多巴胺水溶液中，室温孵育15min，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]，含浓度0.1mol/LKCl的电解液中。差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到实际样品中莱克多巴胺溶液检测的DPV图谱及其峰电流值Ips。通过实施例二建立的标准曲线，计算出Ips-Ip0对应的莱克多巴胺浓度即为实际样品中莱克多巴胺的浓度。测试结果如表一所示。所测得样品的相对标准偏差在3.6％～6.7％之间，加标回收率在91.0％～95.1％之间，平均回收率为93.5％。
表一：配合饲料中莱克多巴胺含量的测定结果
实施例四：基于不同的适配体构建的电化学生物传感器
在上述实施例一至四中，通过实验验证了基于序列为SEQIDNO.1的莱克多巴胺核酸适配体构建的电化学生物传感器在检测莱克多巴胺样品的效果。
进一步的实验表明，在SEQIDNO.1即ACGCAGTGCGGGCGA中，核心序列是AGTGCGGGC，而其他碱基可以任意搭配，只要符合长度为13-20bp的要求。表2是实验中设计的一系列适配体及其实验结果：
表2：莱克多巴胺适配体
注：上述SEQIDNO.2至14是专门设计的极端序列，在序列AGTGCGGGC的两端加上连续的A或G或C或T碱基，通过实验表明这些序列的检测灵敏度与随机设计的SEQIDNO.1的相当，证明以序列AGTGCGGGC是关键序列，可以其他碱基可以任意搭配为莱克多巴胺适配体，序列长度符合13-20bp即可。
Claims (5)
1.一种莱克多巴胺适配体，其特征在于，所述适配体为含有AGTGCGGGC序列、长度为13-20bp的单链DNA探针，且5’端修饰了氨基即5’-NH2-(CH2)6-；所述适配体的序列如SEQIDNO:1-14所示。
2.一种检测莱克多巴胺的适配体电化学生物传感器，其特征在于：所述的电化学生物传感器中含有如权利要求1所述的适配体。
3.如权利要求2所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用超纯水超声清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液于20-25℃下活化10分钟，得到活化的裸金电极；
（2）活化电极的适配体修饰：合成如权利要求1所述的适配体，配制100μmol/L的适配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L适配体组装液；将步骤（1）所得的活化的裸金电极浸入适配体组装液中，密封4℃下组装24小时，得到所述的适配体电化学生物传感器。
4.根据权利要求3所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中采用的Piranha溶液中，浓硫酸与30%H2O2的体积比是7:3。
5.一种基于如权利要求2所述的适配体电化学生物传感器的检测莱克多巴胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对莱克多巴胺标准溶液进行检测，建立标准曲线：
将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；
将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]电解液中，电解液含浓度0.1mol/L的KCl，差分脉冲伏安法即DPV分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到适配体传感器的DPV图谱及其峰电流值Ip0；
将差分脉冲伏安分析后的适配体传感器用超纯水冲洗后浸入浓度0.05ng/mL的莱克多巴胺水溶液中，室温孵育15min，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的莱克多巴胺，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]，含浓度0.1mol/LKCl的电解液中进行差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到浓度0.05ng/mL的莱克多巴胺标准液的DPV图谱及其峰电流值Ip1；
同理，将上述修饰电极依次放入浓度0.1ng/mL、0.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×102ng/mL的莱克多巴胺标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行差分脉冲伏安分析，记录其对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn，其中n=2,3…7，并计算各标准液相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△Ip即各标准液对应的峰电流值Ipn，其中n=1,2,3…7减去适配体传感器对应的峰电流值Ip0；
以浓度为0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、1.0×102ng/mL的莱克多巴胺标准液浓度的对数为横坐标，以这7种标准液对应的峰电流变化值△Ip为纵坐标作图，建立标准曲线；
（2）对含莱克多巴胺的样品溶液进行定量检测：
根据GB/T21317-2007所述方法对样品中的莱克多巴胺进行提取纯化；将得到的莱克多巴胺干粉用超纯水溶解后过0.45μm滤膜，然后进行电化学检测；
将差分脉冲伏安分析后的适配体传感器用超纯水冲洗后浸入从实际样品溶液中提取纯化得到的莱克多巴胺水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]，含浓度0.1mol/LKCl的电解液中进行差分脉冲伏安分析，扫描高电位为0.7V，低电位为0.3V，扫速为0.02V/s，振幅为0.05V，得到实际样品中莱克多巴胺溶液检测的DPV图谱及其峰电流值Ips；通过步骤（1）建立的标准曲线，计算出Ips-Ip0对应的莱克多巴胺浓度即为实际样品中莱克多巴胺的浓度。
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| CN101852720A (zh) * | 2010-05-12 | 2010-10-06 | 山东省农业科学院中心实验室 | 一种检测猪肉中莱克多巴胺的生物传感器方法 |
| CN101980018A (zh) * | 2010-10-29 | 2011-02-23 | 上海交通大学 | 用于测定莱克多巴胺的免疫生物传感器的制备方法 |
| CN103063833A (zh) * | 2013-01-21 | 2013-04-24 | 济南大学 | 一种快速检测瘦肉精无标记免疫传感器的制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 基于核酸适配子的生物传感器的研究;杨慧;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）信息科技辑I140-102》;20091215;权利要求3 * |
| 莱克多巴胺核酸适配体电化学生物传感器的研制;陈丹 等;《2013年饲料毒理学术报告会暨饲料毒理学专业委员会第五届全国代表大会材料集》;20130424;摘要 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103343126A (zh) | 2013-10-09 |
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