CN113009159A

CN113009159A - 基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法

Info

Publication number: CN113009159A
Application number: CN202110216726.9A
Authority: CN
Inventors: 余鹏; 赵佳
Original assignee: Changsha Xinli Zhihe Technology Co ltd
Current assignee: Changsha Xinli Zhihe Technology Co ltd
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-06-22

Abstract

本发明涉及生物医学检测技术领域，具体是一种基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，包括：制备人绒毛膜促性腺激素肽适配体；制备检测电极体系；建立标准曲线和线性方程；对待检样品进行检测及定量分析。本发明的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，用了不同与现有技术的检测原理，利用HCG适配体与相应的配体结合的高亲和力和强特异性，精确检测样品中的人绒毛膜促性腺激素。本发明的检测方法中，HCG是和肽段结合，阻碍电极表面电子的传递，结合的蛋白越多，电阻越大，从而根据电阻的变化反应结合蛋白的量，完全回避了高浓度钩状反应这一现象。

Description

基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法

技术领域

本发明涉及生物医学检测技术领域，特别是涉及一种基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法。

背景技术

人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)主要存在于人体尿液和血液中。非妊娠妇女体内，血液中HCG的正常含量一般小于100mIUml-1，妊娠妇女体内在不同周期则呈现指数增长，正常妊娠时HCG于停经后60～70日达峰值(约50000-100000U/L)，持续1～2周开始下降，分娩后2周降至正常。

HCG是一种重要的妊娠期监测指标，对预测妊高征的发生，妊娠期高血压疾病的病程诊断有着重要的指导意义。同时也是一种重要的血清和尿液肿瘤标志物，与妊娠无关的HCG浓度升高还可见于生殖细胞、卵巢、膀胱、胰腺、胃、肺和肝脏肿瘤病人。

HCG早孕试纸应用免疫层析双抗体夹心法原理，可在5分钟内测定尿液标本中的HCG。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗体时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗HCG-α亚基单克隆抗体时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被线处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，与羊抗鼠对照线形成胶体金免疫复合物，呈现色带。尿检阳性提示β-HCG≥25U/L，T线的强弱反映HCG的浓度高低。

早孕试纸检测尿HCG并不能准确反应体内HCG的量。T线颜色在妊娠早期随HCG增高而加深，在接近峰值时出现高浓度钩状效应，随HCG增高而减弱。葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒毛膜癌、滋养细胞肿瘤等生殖系统疾病β-HCG均异常增高(>100000U/L)，同样会因浓度过高引起的高浓度钩状效应，使T线颜色减弱。异位妊娠8-9日后体内的β-HCG降至正常，尿检也可出现阳性。妊娠3个月后，HCG水平下降，尿液检测可能出现阴性或弱阳性。此外，试纸如果存放时间过长，保存不当，可能失效致检测结果假阴性。故临床上需结合血β-HCG、临床症状及影像学检查等辅助诊断判断是否妊娠或是否患相关疾病。医学上一般推荐血HCG检查，通过血液检查HCG值比用早孕试纸更灵敏、更准确地判断是否妊娠或患病。

除了胶体金免疫层系试纸外，目前还报道了很多HCG的检测方法：荧光免疫分析、共振散射光谱分析、光谱法、光致发光以及电化学免疫电极等，在这些方法中，罗氏的电化学发光法是目前应用最广泛的HCG检测方法。

罗氏是全球唯一应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商，通过以三联吡啶钌([Ru(bpy)₃]²⁺)为标记物，以三丙胺(TPA)为底物，在电极表面由电场引发的特异性化学发光反应，直接由三联吡啶钌[Ru(bpy)₃]²⁺标记抗体，反应时标记物直接发光。具体步骤：第一抗体标记生物素(生物素可与微磁珠结合)；第二抗体标记三联吡啶钌(三联吡啶钌产生光信号)；标记两种抗体与抗原形成抗原抗体夹心复合物；链霉素包被的磁珠非共价牢固结合生物素，加磁场吸附磁性微珠；通入ProCell溶液分离游离相和结合相(与磁珠结合的免疫复合物)；施加电压，开始反应；检测光信号。化学发光剂三联吡啶钌和电子供体三丙胺，在阳电极表面同时各失去一个电子发生氧化反应，二价的三联吡啶钌变成三价的，而三丙胺被氧化成阳离子自由基，两者高反应基团在电极表面迅速反应，它们之间存在的高电化学电位差，使三联吡啶钌变成激发态；再衰减成基态时，同时发射一个波长620nm的光子，这一过程在电极表面反复进行，产生许多光子，使光信号得以增强。

罗氏的电化学发光法检测范围0.100-10000mIU/mL，无法满足妊娠12～14周HCG超过10000mIU/mL的浓度检测，故检测时常需进行稀释后二次检测。该方法仪器复杂，试剂稳定性差，抗体的保存条件苛刻，必须由专业实验室人员操作，仪器对于样本要求高：不能有血凝块和气泡、样本量在150uL以上、稀释倍数无法确定、存在潜在交叉污染，以上缺陷使得该仪器主要存在于医院检验科或第三方体外诊断公司并常常报错，需要工程师及时解决问题，而无法普及。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，包括：

获取人绒毛膜促性腺激素肽适配体，包括：获取人绒毛膜促性腺激素多肽结构；修饰人绒毛膜促性腺激素多肽结构；

制备检测电极体系；

建立标准曲线和线性方程；

对待检样品进行检测及定量分析。

进一步的，所述“获取人绒毛膜促性腺激素多肽结构”包括：用M13噬菌体文库溶液对HCG进行孵育，将得到的结合噬菌体通过培养放大，进行结合实验；经过3～8轮重复筛选，确定肽段出现频次，筛选出具有最高结合亲和力的噬菌体菌落；翻译pIII蛋白结构域的DNA序列得到多肽结构6条，序列如下：

(SEQ ID NO.1)P1：MHLMRMKPLLLT；

(SEQ ID NO.2)P2：MHPRKMLQLMLN；

(SEQ ID NO.3)P3：STRLRRRSRRQT；

(SEQ ID NO.4)P4：PPLRINRHILTR；

(SEQ ID NO.5)P5：MKLKPMRIMINP；

(SEQ ID NO.6)P6：MKSRMLPLNRRL。

进一步的，所述“修饰人绒毛膜促性腺激素多肽结构”包括：分别对P1至P6所示的各序列进行极性甘氨酸修饰；所述极性甘氨酸修饰包括：在P1至P6所示的各序列的至少一端上加入三个极性甘氨酸(Gly，G)，以增加序列的亲水性和水溶性，增大与电极表面的距离，减小空间位阻。

优选的，经过极性甘氨酸修饰后的序列为P11至P61所示的序列：

(SEQ ID NO.7)P11：GGGMHLMRMKPLLLT；

(SEQ ID NO.8)P21：GGGMHPRKMLQLMLN；

(SEQ ID NO.9)P31：GGGSTRLRRRSRRQT；

(SEQ ID NO.10)P41：GGGPPLRINRHILTR；

(SEQ ID NO.11)P51：GGGMKLKPMRIMINP；

(SEQ ID NO.12)P61：GGGMKSRMLPLNRRL。

进一步的，所述“修饰人绒毛膜促性腺激素多肽结构”包括：在所述P1至P6所示的各肽链结构或所述P11至P61所示的各肽链结构的一端引入半胱氨酸(Cys，C)。所述半胱氨酸修饰提供与电极的锚定点。

进一步的，所述“制备检测电极体系”包括：

S1：制备基础电极体系，包括：基板选择和浆料选择；确定网版参数、电极参数等；制备工作电极；在所述工作电极的表面沉积金纳米颗粒层；

S2：用所述的人绒毛膜促性腺激素肽适配体对沉积有金纳米颗粒层的工作电极进行修饰；封闭未结合所述人绒毛膜促性腺激素肽适配体的空白活性位点。

进一步的，步骤S1中，所述在工作电极的表面沉积金纳米颗粒层的操作方法包括：配制1mM的氯金酸溶液，并将电极放入其中，采用循环伏安法进行电沉积；电沉积条件为：电压设置0～-1.4V，15圈，扫速0.5V/s。

进一步的，步骤S2中，所述用人绒毛膜促性腺激素的肽适配体对沉积有金纳米颗粒层的工作电极进行修饰的操作包括：配制成50mM TCEP溶液；用PBS作稀释剂，配制含人绒毛膜促性腺激素肽适配体浓度为2mg/mL的肽适配体溶液；取等体积的所述肽适配体溶液和所述TCEP溶液，配制浓度为1mg/mL(5mM)的肽标准溶液(TCEP浓度为25mM，还原比1:5)，重复操作，将肽标准溶液浓度稀释100倍至1μg/mL(50μM)；吸取肽标准溶液(50μM)滴加到工作电极表面，室温孵育进行自组装20～30h；PBS冲洗电极修饰表面，除去电极表面未结合上的游离寡肽，去除电极表面的残余液体。

进一步的，步骤S2中，所述“封闭未结合所述人绒毛膜促性腺激素肽适配体的空白活性位点”的操作包括：

用PBS作溶剂，配制浓度为1mM的六巯基己醇(MCH)溶液；吸取MCH溶液(1mM)滴加到工作电极表面，室温孵育；PBS冲洗电极修饰表面，晾干。

进一步的，所述“建立标准曲线和线性方程”包括：

将制得的所述检测电极体系的工作电极孵育不同浓度的HCG工作液，孵育结束后，在[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液体系中获得不同浓度的HCG工作液对应的电化学信号，构建一条测试的标准曲线和线性方程。

进一步的，所述“对待检样品进行检测及定量分析”包括：

将制得的所述检测电极体系的工作电极孵育待检样品，孵育结束后，在[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液体系中获得待检样品对应的电化学信号，利用所述标准曲线和线性方程分析得出待检样品中HCG的含量。

本发明的有益效果：

本发明的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，利用HCG适配体与相应的配体结合的高亲和力和强特异性，精确检测样品中的人绒毛膜促性腺激素。

本发明的人绒毛膜促性腺激素检测方法采用的人绒毛膜促性腺激素肽适配体，是进行甘氨酸和半胱氨酸修饰的肽适配体；甘氨酸修饰使肽适配体自身的性能更好，亲水性和水溶性，增大与电极表面的距离，减小空间位阻；半胱氨酸修饰提供与电极的锚定点，使本发明的肽适配体应用效果更好。

现有技术的方法在检测高浓度HCG时，由于抗原抗体的结合的不平衡，破坏了复合物的水合状态，从而出现沉淀，表现出高浓度钩状反应。本发明与现有技术与用了不同的检测原理，应用人绒毛膜促性腺激素肽适配体进行检测，蛋白是和肽段结合，阻碍电极表面电子的传递，结合的蛋白越多，电阻越大，从而根据电阻的变化反应结合蛋白的量，完全回避了这一现象。

本发明的人绒毛膜促性腺激素检测方法，进一步结合电化学传感器技术，通过将人绒毛膜促性腺激素(HCG)肽适配体自组装修饰到工作电极表面，使肽适配体更稳定，通过传感器将待检测物质信号放大，是检测结果更精确。

本发明的人绒毛膜促性腺激素检测方法可以准确检测生物样本如血、尿中HCG的含量，成本低、操作简单、灵敏度高、稳定性好，可以批量生产，有望实现小型化，用于家庭快速检测。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是本发明的电极体系结构示意图。

图2是网版设计图，其中图2A为导线与电极网板图、图2B为绝缘油墨网板图、图2C为两张网板印刷成品图。

图3是本发明的丝电极体系结构组装示意图。

图4是电阻电流随浓度变化情况。

图5是标准曲线，即电阻与浓度线性关系图，其中：纵坐标(Y)为各电极孵育HCG前后电阻差值，横坐标(X)为HCG工作液的浓度，浓度单位为mIU/mL。

具体实施方式

以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。

在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

本申请实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本申请实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

实施例本发明的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法一、制备人绒毛膜促性腺激素肽适配体

1、主要实验仪器及材料

-80℃超低温冰箱(中科美菱，合肥)；精密电子分析天平(Mettler Toledo，德国)；恒温振荡器(BOYN，杭州)；离心机(迈克尔，湖南)；涡旋混合器(莱普特科学仪器，北京)；移液枪(Eppendorf，德国)；电泳仪(Bio-Rad，美国)；转膜仪(Bio-Rad，美国)；磁力搅拌器(雷磁，上海)；制冰机(XUEKEKE，美国)；凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)；超纯水仪(Heal Force，香港)；金属浴恒温器(Kylin-Bell，海门)；HCG标准品(领潮生物，上海)；HCG-α单克隆抗体(领潮生物，上海)；肽适配体(科肽生物，上海)；三(2-羧乙基)膦(TCEP)(阿拉丁，上海)；Loading Buffer(Thermo，美国)；ECL显色液(Thermo，美国)；Marker(Thermo，美国)；丙烯酰胺试剂盒(Bio-Rad，美国)；PVDF膜(Millipore，美国)；BSA封闭液(索莱宝，北京)；HCG标准品(领潮生物，上海)；肽适配体(科肽生物，上海)；三(2-羧乙基)膦(TCEP)(阿拉丁，上海)；六巯基己醇(MCH)(阿拉丁，上海)；PBS(索莱宝，北京)；氯金酸(HAuCl4·H2O)(阿拉丁，上海)；人血清白蛋白(联迈生物，上海)；胎牛血清(Gibco，澳洲)；BSA封闭液(索莱宝，北京)；噬菌体文库(Invitrogen，新加坡)。

2、实验方法

2.1获取人绒毛膜促性腺激素多肽结构(肽适配体的筛选和优选)

将HCG添加到24孔板孵育(孵育条件：500μL的0.1mol/L的NaHCO₃(pH 8.6)，4℃，过夜)，使HCG蛋白固定在孔壁上；弃去废液，采用BSA封闭，PBS洗涤，加入M13噬菌体文库溶液孵育(孵育体系：0.1％(v/v)TBST缓冲液，50mM Tris-HCl,，pH 7.5，150mM NaCl和0.1％(v/v)Tween-20]；孵育条件：37℃孵育30min)，除去未结合的噬菌体，将得到的结合噬菌体通过培养放大，进行结合实验；经过3～8轮重复筛选(优选5轮)，收集到具有最高结合亲和力的噬菌体菌落，通过翻译pIII蛋白结构域的DNA序列得到多肽序列6条：

(SEQ ID NO.1)P1：MHLMRMKPLLLT；

(SEQ ID NO.2)P2：MHPRKMLQLMLN；

(SEQ ID NO.3)P3：STRLRRRSRRQT；

(SEQ ID NO.4)P4：PPLRINRHILTR；

(SEQ ID NO.5)P5：MKLKPMRIMINP；

(SEQ ID NO.6)P6：MKSRMLPLNRRL。

在一些实施例中，本发明得到6条多肽序列还可以进一步筛选，操作包括：扩增上述的6条高亲和力序列，再于24孔板与HCG孵育(孵育环境：4mL PEG/NaCl溶液(其中：20％，w/v PEG-8000,2.5M NaCl)，孵育条件：4℃孵育2h)，采用酸(1mL 0.2M甘氨酸-HCl(pH 2.2)和1mg/mL BSA)进行洗脱，计算单个噬菌体与HCG的结合率(结合噬菌体效价/输入噬菌体效价)，得到结合率最高的多肽作为肽适配体(P4：PPLRINRHILTR)。

2.2修饰人绒毛膜促性腺激素多肽结构

分析上述6条高亲和力序列，发现存在较多带正电荷的氨基酸(29.2％)和非极性疏水氨基酸(27.5％)，不存在负电荷残基，这可能是因为在筛选过程中，HCG(pI＝2.95)在TBST缓冲液(pH＝7.5)中带负电，说明HCG和多肽的结合力可能包括静电作用和疏水作用。分析这些肽适配体发现，其解离常数比商业抗体高两个数量级，并接近HCG受体中的单链可变区片段(抗原抗体互补决定区)的解离常数。Ascolia等在2002年报道HCG受体胞外结合区域存在一种名为富含亮氨酸重复的结构基序，这种基序在肽适配体中存在，可能与HCG的结合有关。

基于以上事实，本发明对上述筛选出来的多肽序列进行修饰；即分别在多肽序列的至少一端引入3个极性甘氨酸(Gly，G)，增加多肽结构的亲水性和水溶性，增大与电极表面的距离，减小空间位阻。以在肽链结构一端引入3个极性甘氨酸(Gly，G)为例，为P1至P6所示的序列经过极性甘氨酸修饰后的序列为P11至P61所示的序列：

(SEQ ID NO.7)P11：GGGMHLMRMKPLLLT；

(SEQ ID NO.8)P21：GGGMHPRKMLQLMLN；

(SEQ ID NO.9)P31：GGGSTRLRRRSRRQT；

(SEQ ID NO.10)P41：GGGPPLRINRHILTR；

(SEQ ID NO.11)P51：GGGMKLKPMRIMINP；

(SEQ ID NO.12)P61：GGGMKSRMLPLNRRL。

在一些实施例中，为使多肽序列在后续的应用中能稳定地固定在纳米金电极表面，对肽适配体或修饰后的肽适配体的NH2-末端进行半胱氨酸(Cys，C)修饰，提供与电极的锚定点；以P4(PPLRINRHILTR)序列为例，为使P4(PPLRINRHILTR)或P41的序列(GGGPPLRINRHILTR)能稳定地固定在纳米金电极表面，对肽适配体或修饰后的肽适配体的NH2-末端进行半胱氨酸(Cys，C)修饰，提供与电极的锚定点，从而得到肽适配体序列：CGGG-PPLRINRHILTR或C-PPLRINRHILTR。

二、制备检测电极体系

1、基础电极体系的制备

1.1材料选择

1.1.1基板：本实施例优选PET材料作为基板。

1.1.2浆料

本实施例优选采用三电极体系，选择银/氯化银(80/20)印制参比电极，，银与氯化银的比例为80：20；碳浆印制对电极、工作电极和导线；绿色热固化绝缘油墨印制绝缘层。

1.2、网版设计

根据三电极系统丝网印刷电极的需要，设计如图1所示的34mm*12mm的丝网印刷电极。其中包括：基板100、电极条200、工作电极400和绝缘层600；所述电极条200为导电材料形成的导电线路；所述电极条200与所述工作电极400连接，每一条电极条200连接一个工作电极400；所述电极条200和所述工作电极400位于所述基板100和所述绝缘层600之间；所述绝缘层600覆盖所述基板100和所述电极条200；所述绝缘层600上有电极曝露位610，用于曝露电极。在单通道电极中，所述工作电极400数量为一个；多通道电极中，所述工作电极400可以是多个。所述电极条200是导电浆料通过丝网印刷到所述基板100上的供电流行走的电流通道，其每一条连接一个电极(此处的电极包括但不限于工作电极400)。对电极300，所述对电极300与单独的一条所述电极条200连接。参比电极500，所述参比电极500与单独的一条所述电极条200连接。

如图2所示(其中图2A为导线与电极网板图、图2B为绝缘油墨网板图、图2C为两张网板印刷成品图)网版参数：张力20牛，网目300，膜厚20μm。

1.3、丝网印刷步骤

参见图3的电极体系结构组装示意图：

①将印刷基板100即PET聚酯膜清洗，120℃烘烤15min，以防止板在后续高温加热工序中变形，冷却后备用。

②将丝网网版、刮刀用洗网水进行清洗，待自然挥干后备用。

③印刷电极时，将刮刀与网版的倾斜角度调至控制在60～80度，并调整网距为h＝2～3mm，将网版固定。

刮刀的角度是指刮刀与网版所形成的夹角。网距指网版与承印物之间的距离，用h表示。网距的作用是使丝网要印刷时能以线接触或线分离的方式进行。h>0称离网印刷，并根据效果再适当调整。

④按照产品说明书调制好导电碳浆(生产商：依美集团)，用精密调速混匀器搅拌5min，放置在网版上。在片材上按图印刷导电银浆后，140℃烘干60min，回收浆料，即形成对电极300、工作电极400和导线(电极条200)；清洗网版、刮胶和刮刀，按照同样的方法印刷其它浆料，干燥条件如表1所示，形成参比电极500和绝缘层600。

表1：各浆料层干燥处理条件

⑤检测：随机抽取不同批次的丝网印刷电极进行电阻的测试，比较批内差异。通过循环伏安法研究丝网印刷电极在铁氰化钾溶液中电化学行为，扫描速度为100mV/s，结果显示批内差异RSD小于5％。

1.4、工作电极表面沉积氯金酸

配制1mM的氯金酸(HAuCl₄)，将电极放入其中，进行电沉积。沉积条件：循环伏安法(CV)电压设置0～-1.4V，15圈，扫速0.5V/s。电沉积前后电阻从700Ω降至50Ω，电流响应从150μA升至220μA。

2、用人绒毛膜促性腺激素肽适配体对电极进行修饰

2.1、肽适配体修饰工作电极

称取TCEP 72mg(mw＝286.65g/mol，99.4％)，加入5mLPBS，配制成50mM的TCEP还原剂溶液；向2mg的本发明的人绒毛膜促性腺激素肽适配体中加入1mLPBS，涡旋混匀，配制成2mg/mL的肽适配体溶液；取配制好的2mg/mL的肽适配体溶液100μL，加入100μL配制好的TCEP溶液，配制成1mg/mL(5mM)的肽适配体标准溶液(TCEP浓度为25mM，还原比1:5)，重复操作，将肽标准溶液浓度稀释100倍至1μg/mL(50μM)；吸取20μL肽标准溶液(50μM)滴加到工作电极表面，室温(25度)孵育进行自组装22h，PBS冲洗电极修饰表面，除去电极表面未结合上的游离寡肽，用洗耳球轻轻吹去电极表面的残余液体。

修饰完成后，在电解质[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中记录修饰电极的电化学性质，DPV(差分脉冲伏安法)参数：Pluse Height：25mV，Pluse Width：0.01s，Step Height：10mV，StepWidth：0.2s；EIS参数(频率范围)：10000Hz～1Hz。

2.2、六巯基己醇(MCH)封闭未结合所述人绒毛膜促性腺激素肽适配体的空白活性位点

称取1.37mg的MCH(AR，mw＝134.24，98％)，加入10mLPBS，配制成1mM的MCH溶液；吸取15μL MCH溶液(1mM)滴加到工作电极表面，室温孵育30min，PBS冲洗电极修饰表面，晾干。

封闭完成后，在三电极上滴加80μL的[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液，记录封闭后电极的电化学性质，DPV参数：Pluse Height：25mV，Pluse Width：0.01s，Step Height：10mV，StepWidth：0.2s；EIS参数(频率范围)：10000Hz～1Hz。

三、建立标准曲线和线性方程

工作液的配制：取1.2mg/mL(5000IU/mg)的HCG标准品4μL，加入996μLPBS稀释，配制成4800ng/mL(24IU/mL)的工作液HCG-1(工作液ID)。并在工作液HCG-1的基础上，按照表2的梯度配制其他浓度的HCG工作液。

表2：HCG工作液梯度浓度

分别取不同浓度的工作液20μL分别滴涂在同一批次的丝网印刷电极体系的工作电极上，室温孵育1h，孵育结束后用PBS清洗电极三次，以洗去未结合的HCG。记录各电极在5mM的[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中的CV、DPV和EIS图，利用ZSimpWin对EIS奈奎斯特图进行拟合，记录电阻与电流峰值，电阻电流随浓度变化情况如图4所示。采用1/X²作为权重建立标准曲线，通过最小二乘法进行线性回归运算，对方法的线性进行考察。以各电极孵育HCG前后电阻差值作为纵坐标(Y)，以HCG的浓度作为横坐标(X)，浓度单位为mIU/mL，建立标准曲线如图5所示。

结果显示，电阻变化值与浓度均具有良好的线性关系(n＝5)。线性方程为：Y＝0.3610*X+64.92，相关系数R²为0.9264。在25-1500mIU/mL范围内，阻抗变化与浓度成正比，DPV与EIS结果相互验证。

四、对基于HCG适配体的检测电极体系进行性能验证

将本发明的检测电极体系连接电化学工作站，进行检测。

特异性验证试验

以促甲状腺激素(TSH)、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成激素(LH)为干扰物质考察实施例一制得的肽适配体电极的选择性。在1:5还原的25mM肽适配体修饰的电极上测定干扰物质的梯度浓度与HCG定量下限浓度(肽适配体修饰电极定量下限为5mIU/mL)响应比较，干扰物质梯度浓度如表3所示。

表3：各干扰物质梯度浓度

干扰物质	正常参考值	低浓度	中浓度	高浓度
					TSH	0.35～5.5μIU/mL	1.0μIU/mL	8.0μIU/mL	25.0μIU/mL
FSH	2.49～16.4mIU/mL	5mIU/mL	15mIU/mL	50mIU/mL
					LH	2.75～49.7mIU/mL	6mIU/mL	20mIU/mL	60mIU/mL

结果表明：电极体系对三种干扰物质每个浓度响应均低于HCG定量下限浓度响应的3％，表明本发明构建的电极体系对HCG的检测具有特异性。

稳定性验证试验

按照实施例一的标准方法制备适配体修饰电极体系6支。首次测定：用三支测定浓度为5mIU/mL、125mIU/mL和1500mIU/mL的HCG工作液，另外三只电极4℃贮存。第二次测定：取4℃贮存30天后得另外三只电极，测定5mIU/mL、125mIU/mL和1500mIU/mL的HCG工作液，与首次测定的同一批次按照相同方法修饰的电极电阻变化和电流响应相比较，5mIU/mL电流响应为首次测定的95％，125mIU/mL为首次测定的92％，1500mIU/mL为首次测定的90％，结果表明，电极体系稳定性优异。

准确度和精密度

取HCG标准品重新配置工作液和浓度为5mIU/mL，125mIU/mL和1500mIU/mL的工作液，用同一批次按照实施例一的方法制备的电极体系进行测定，将响应代入线性方程(Y＝0.3610*X+64.92)得出的浓度与真实浓度比较，三个浓度准确度在85％～115％范围内，符合生物样本的检测需求。

在同样的条件下按照实施例一的方法制备五个修饰电极体系对同一浓度的HCG工作液(125mIU/mL)进行检测，相对标准误差分别是4.1％，小于15％，符合生物样本检测需求。

五、对待检样品进行检测及定量分析

将本实施例制得的检测电极体系的工作电极孵育待检样品，孵育结束后，在[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液体系中获得待检样品对应的电化学信号，利用所述标准曲线和线性方程分析得出待检样品中HCG的含量。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 长沙市信励致和科技有限责任公司

<120> 基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met His Leu Met Arg Met Lys Pro Leu Leu Leu Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met His Pro Arg Lys Met Leu Gln Leu Met Leu Asn

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Thr Arg Leu Arg Arg Arg Ser Arg Arg Gln Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Pro Pro Leu Arg Ile Asn Arg His Ile Leu Thr Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Lys Leu Lys Pro Met Arg Ile Met Ile Asn Pro

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Lys Ser Arg Met Leu Pro Leu Asn Arg Arg Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Gly Gly Met His Leu Met Arg Met Lys Pro Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gly Gly Met His Pro Arg Lys Met Leu Gln Leu Met Leu Asn

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gly Gly Ser Thr Arg Leu Arg Arg Arg Ser Arg Arg Gln Thr

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Gly Pro Pro Leu Arg Ile Asn Arg His Ile Leu Thr Arg

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Gly Met Lys Leu Lys Pro Met Arg Ile Met Ile Asn Pro

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Gly Gly Met Lys Ser Arg Met Leu Pro Leu Asn Arg Arg Leu

1 5 10 15

Claims

1.一种基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述检测方法，包括：

获取人绒毛膜促性腺激素肽适配体；

制备检测电极体系；

建立标准曲线和线性方程；

对待检样品进行检测及定量分析。

2.根据权利要求1所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述“获取人绒毛膜促性腺激素肽适配体”包括：用M13噬菌体文库溶液对HCG进行孵育，将得到的结合噬菌体通过培养放大，进行结合实验；经过3～8轮重复筛选，确定肽段出现频次，筛选出具有最高结合亲和力的噬菌体菌落；翻译pIII蛋白结构域的DNA序列得到多肽结构6条，序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求2所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述“获取人绒毛膜促性腺激素肽适配体”还包括：分别对P1至P6所示的各序列进行极性甘氨酸修饰，包括：在P1至P6所示的各序列的至少一端上加入三个极性甘氨酸，以增加序列的亲水性和水溶性，增大与电极表面的距离，减小空间位阻。

4.根据权利要求3所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述经过极性甘氨酸修饰后的序列如SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.12所示。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述“获取人绒毛膜促性腺激素肽适配体”还包括：在所述P1至P6所示的各肽链结构或所述P11至P61所示的各肽链结构的一端引入半胱氨酸。

6.根据权利要求1所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述“制备检测电极体系”包括：

S1：制备基础电极体系，在所述基础电极体系的工作电极的表面沉积金纳米颗粒层；

S2：用所述的人绒毛膜促性腺激素肽适配体对沉积有金纳米颗粒层的工作电极进行修饰。

7.根据权利要求6所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述在工作电极的表面沉积金纳米颗粒层的操作方法包括：配制1mM的氯金酸溶液，并将电极放入其中，采用循环伏安法进行电沉积；电沉积条件为：电压设置0～-1.4V，15圈，扫速0.5V/s。

8.根据权利要求6所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述用人绒毛膜促性腺激素的肽适配体对沉积有金纳米颗粒层的工作电极进行修饰的操作包括：配制浓度为50μM的肽标准溶液；将肽标准溶液滴加到工作电极表面，孵育20～30h；除去电极表面未结合上的游离寡肽和残余液体。

9.根据权利要求1所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述“建立标准曲线和线性方程”包括：

将所述检测电极体系孵育已知浓度的HCG工作液，孵育结束后，在Fe(CN)6^3-/4-溶液体系中获得已知浓度的HCG工作液对应的电化学信号，构建一条测试的标准曲线和线性方程。

10.根据权利要求1所述的基于人绒毛膜促性腺激素肽适配体的人绒毛膜促性腺激素检测方法，其特征在于，所述“对待检样品进行检测及定量分析”包括：

将所述检测电极体系的工作电极孵育待检样品，孵育结束后，在Fe(CN)6^3-/4-溶液体系中获得待检样品对应的电化学信号，根据所述标准曲线和线性方程分析得出待检样品中人绒毛膜促性腺激素的含量。