CN113008964A - 基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学检测及生物传感器技术领域,具体为基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极及其制备方法和应用。所述制备方法包括:在电极上进行电沉积纳米金修饰;将黄体酮核酸适配体自组装在所述纳米金修饰后的电极上。本发明方法制得的工作电极的应用包括使用方法,包括:S1:构建标准曲线和线性方程;S2:样品检测,收集电化学信号,计算黄体酮浓度。本发明的基于高特异性的截短核酸适配体的工作电极,通过结合小型电化学检测设备,快速准确且大批量的测定样本血液中黄体酮含量,不需要专业操作人员,昂贵的试剂盒,短时间内进行大量样本检测,大大提高了临床检测效率,还可再生重复使用,节约了成本。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测及生物识别传感器技术领域,特别是涉及一种基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极及其制备方法和应用。
背景技术
随着社会科技发展,日常健康管理对即时检测的需求不断增加,生物传感器作为一类高灵敏、微型化的生物标志物检测仪器,在即时检测中具有巨大的应用潜能。生物传感器是将生物活性物质固定化后作为敏感元件并结合适当的换能器组成的一种分析检测装置。一般样品无需预处理,被测组分的分离和检测可以同步进行,且具有响应快、准确度高及高灵敏度的特点。
黄体酮是一种小型疏水甾体激素,由卵巢的黄体细胞及妊娠期的胎盘组织所分泌。它是反映卵巢活动的精确指示剂,在雌性生殖的不同阶段,血浆黄体酮富有特征性的变化。排卵前血清中黄体酮浓度为1ng/mL,排卵中期血清中黄体酮浓度为20ng/mL,而妊娠期血清中黄体酮浓度超过300ng/mL。有研究显示,黄体酮能有效改变子宫肌细胞膜的通透性,能有效抑制子宫肌发生兴奋,促进胚胎继续发育,同时,该激素能能够抑制免疫反应,防止母体对胚胎出现排斥,从而避免妊娠终止。因此,临床黄体酮常作为药物来维持妊娠。许多文献报道显示外源性补充黄体酮对于治疗先兆流产效果理想,黄体酮给药剂量是影响患者预后质量的重要因素之一。黄体酮用于早孕保胎,目前无统一用药方案。临床应用中,保胎治疗建议持续至孕12周,但过量给予黄体酮会促使子宫出现生产抑制现象,减弱子宫收缩功能,严重时会导致死胎、稽留流产、胎儿畸形等危险事件。因此,妊娠期间黄体酮激素水平的监测尤为重要。
20世纪40年代,只能用化学方法测定24小时尿中黄体酮的代谢产物孕二醇的排泄量,以反映黄体酮分泌水平。50年代开始采用生物法、化学法和气相层析法等测定以反映黄体酮分泌水平。60年代末,开始应用放射性核素和蛋白竞争法。70年代先后又出现了放射免疫分析法和放射受体法,大大提高了测定的灵敏度和精确度。后来,血黄体酮测定广泛应用,尿孕二醇的测定已失去重要性。最为常用的血液中黄体酮检测方法主要分为两大类:色谱法和免疫法。色谱法是直接通过色谱仪器进行分析测定,如:高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS),这类方法的灵敏度非常高,检测限在0.01-0.21ng/L,但样品需要经过复杂的前处理,因此增加检测时间。免疫测定法(immunoassay,IA)是利用抗原与抗体之间的反应,来检测样品中微量物质的方法。由于抗原抗体反应的特异性和灵敏性,免疫法被广泛应用于医学检验的许多领域。包括:酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法、免疫荧光法等,但稳定性有限和高成本是免疫测定法需要面临的主要挑战。除此之外,这些方法大都需要昂贵的实验设备和专业操作技能,不适合大量样品定量分析及实时在线检测。目前临床对血液(主要是血清)中的黄体酮含量的监测手段主要是竞争性免疫测定,对血液样本要求较高,需要全程密封样品,离心并快速分离血清,需要消耗较为昂贵的免疫试剂盒,且由于免疫抗体的不稳定性,实验差异达到±12.5%。不仅如此,由于该方法需要抽取血样,无法实现密切监测。
电化学生物传感器是目前研究最多的一类生物传感器,由于响应快、费用低、操作简单、能够构建简单便携的快速筛查装置、现场/现场监测和高灵敏度而受到广泛关注。经过近40年的发展,由于生物传感器所使用的生物活性物质常常表现出不稳定的特性,从而造成生物传感器的重现性和稳定性较差,目前进入应用阶段的生物传感器较少。DNA相较于酶或抗体具有更稳定、更易合成的优点,因此近年来,核酸适配作为识别原件的生物传感器被广泛报道。核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集的配体系统进化技术,人工体外筛选出来的单链寡核苷酸片段,大约包含25-80个DNA或RNA,其功能类似于抗体,对特定的靶标有很高亲和力和选择性。与此同时,适配体具有易修饰性。适配体能够被荧光染料、生物素、放射性同位素等简单直接地标记,通过对核酸适配体进行精确的位点修饰,不仅可以保持适配体原有的生物学活性,还能够提高其稳定性,使其功能增加。首个黄体酮的核酸适配体与2015年被报道,并利用其修饰在金电极表面,采用交流阻抗的原理构建了一款电化学传感器,其检测限为:0.03-0.19μmol/L,最低检测限:2.86nmol/L。但该适配体被报道与其他甾体类似物如睾酮的结合力甚至高于黄体酮,导致传感器的选择性低。
虽然全长序列的适配体已经广泛应用于传感器,但仍存在序列较长、构型设计复杂、标记、成本较高等缺点。非标记型核酸适配体传感器是指不对适配体和靶分子进行修饰标记,而是将信号分子组装在电极上或是加入到测试底液里的传感器。这种传感器构筑成本要明显低廉,是当今核酸适配体传感器的主流设计类型。标记型核酸适配体传感器的标记过程复杂、花费高,而且在一定程度上会影响适配体和目标分子的结合亲和力。因此,构建简单、价廉和灵敏的非标记型电化学核酸适配体传感器具有重要的意义。
发明内容
基于此,本发明提供了一款基于高特异性的截短核酸适配体,能准确测定生物样本血液中黄体酮含量的工作电极,从而有助于临床早期妊娠黄体酮水平监测和及时补充,有效减低早期流产发生率并精确临床黄体酮给药方案。目前暂无利用该截断适配体构建无标记原理的传感器的公开信息。
本发明的另一目的在于提供上述基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的应用,包括将其再生方法和应用于电化学生物传感器,再进一步用于检测临床样本的方法。
本发明的技术方案如下:
一种基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,步骤包括:在电极上进行电沉积纳米金修饰;在所述纳米金修饰后的电极上自组装核酸适配体。
进一步的,所述核酸适配体的序列为:5’-GATTAACATTAGCCCACCGCCCACC-thiol-3’。其中“thiol”为巯基。
进一步的,所述基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,还包括:在进行电沉积纳米金修饰前,先用多壁碳纳米管修饰基础电极,进一步提高电极检测的精密度。
进一步的,所述“用多壁碳纳米管修饰基础电极”的操作包括:
在基础电极表面均匀滴涂终浓度为0.5-5mg/mL的羧基化多壁碳纳米管溶液,干燥固定。修饰多壁碳纳米管可以极大的增加电极的比表面积,使电极的电子传递效率增大,氧化还原峰电流值明显增大。
所述的基础电极的表面积(mm2)和所述多壁碳纳米管溶液的使用量(μL)之间的关系为0.2-1μL/mm2,即基础电极表面每平方毫米面积对应使用0.2-1μL多壁碳纳米管溶液。
所述羧基化多壁碳纳米管溶液的浓度如果过低,比如0.1mg/mL等,其修饰效果会很差,失去了优化修饰的意义。但如果浓度过高,多壁碳纳米管在溶液体系中易团聚,使得修饰效果存在较大差异。
优选的,所述羧基化多壁碳纳米管溶液的浓度为1mg/mL。
优选的,所述羧基化多壁碳纳米管溶液的溶剂为0.1-2mg/mL的壳聚糖乙酸溶液;优选浓度为0.5mg/mL。选用壳聚糖乙酸溶液作为溶剂可以羧基化多壁碳纳米管,使分散效果更好。
优选的,所述“干燥固定”的操作条件包括:35-60℃干燥时间20-45min;优选45℃热风干燥30分钟。
干燥固定可使多壁碳纳米管溶液充分干燥并牢固修饰在基础电极表面。干燥温度和时间呈现反比,温度越高,干燥时间越短。优选的,以热风(鼓风)形式干燥,流动的热风可以加速电极表面液滴的干燥速度。但温度过高的热风流,可能增加电极本身损坏风险。
进一步的,所述的“在电极上进行电沉积纳米金修饰”,操作包括:将电极放置于1mM HAuCl4溶液中,以石墨电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,在-1.4-0.0V范围内,扫速为0.1V/s,扫描15圈,自然晾干,得到纳米金修饰的电极。
纳米金能增加电极的比表面积,还可以为-HS-ssDNA提供结合位点。在-1.4-0.0V范围内,扫速为0.1V/s,扫描15圈可以是纳米金很好的结合在电极表面,自然晾干避免了外力干燥操作对纳米金颗粒和电极表面的结合稳固性带来影响。
进一步的,所述的“在所述纳米金修饰后的电极上自组装核酸适配体”的操作包括:将纳米金修饰后的电极置于浓度为2.5-10μM的核酸适配体溶液中,4-35℃下孵育10-25小时后取出,自然晾干。本发明采用升温孵育,其孵育效果优于现有技术公开的4℃低温孵育,高温有利于分子运动,加速自组装过程,且更长时间的孵育可以增加自组装适配体的数量,增大电极的检测范围。
优选的,所述核酸适配体溶液的浓度为5μM,35℃孵育时间为15小时。适当的升高温度可以加速分子的扩散,有利于溶液中的适配体分子的运动和自组装,但如果温度过高,一定程度会影响适配体的结构和性能,使得部分适配体降解。相对于肽适配体和抗体,只能在室温(25℃左右)反应,本发明采用核酸适配体自组装制作电极,在35℃情况下,核酸适配体本身结构和性能不受影响,还能提升自组装速度。
巯基可以与电极上的纳米金Au位点共价结合,使适配体牢固地自组装在电极表面,有利于准确检测。截短型的适配体较现有的的长适配体有更强的亲和力和特异性,且与靶标物质黄体酮结合之后引发的电信号变化更为明显,起到信号放大的作用。
本发明的核酸适配体为无标记型核酸适配体,相较于标记型核酸适配体传感器的标记过程复杂、花费高,而且修饰在电极上的电信号分子,如亚甲基蓝、二茂铁等在一定程度上会影响适配体和目标分子的结合亲和力,本发明的无标记型核酸适配体传感器,无需进行标记,简化了制备工艺,降低了制备成本,同时把电信号分子换成[Fe(CN)6]3-/4-,保证了检测效果上的同时,避免标记型核酸适配体传感器的各种弊端。
进一步的,所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,在“用多壁碳纳米管修饰基础电极”之前还包括对基础电极进行预处理;所述预处理包括:
打磨:将基础电极在金相砂纸初打磨,顺时针逆时针各20圈,去除电极表面氧化层;再在加有Al2O3粉末(0.05pm)的麂皮上打磨,打磨手法成平行“8”字,顺时针100圈,逆时针100圈;
清洗:抛光成镜面后,用去离子水冲洗电极表面,并将打磨好的电极竖直放入去离子水中超声3min,重复三次,确保电极表面无残留打磨浆;再进行化学清洗,分别在乙醇、1:1的HNO3溶液中各超声2min,电极取出后再用去离子水超声清洗3min,重复三次,冲净后用氮气吹干;
活化:接着在0.5mol/L的H2SO4溶液中用循环伏安法活化,扫描范围为:-1.0-1.0V,反复扫描直至获得稳定的伏安循环图为止。
经过预处理的基础电极循环伏安电势差在80-100mV。
优选的,所述基础电极包括玻碳电极。
进一步的,所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,在核酸适配体自组装完成后,还包括:在浓度为0.2mmol/L的巯基己醇中孵育30min,以封闭电极上多余的金位点。
本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的使用方法,包括:
S1:标准曲线和线性方程的构建:将本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极孵育不同浓度的黄体酮溶液,获得不同浓度的黄体酮溶液的电化学信号,从而构建一条测试的标准曲线和线性方程。
S2:样品检测及浓度计算:将本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极孵育待检样品,按照S1相同的方法步骤和操作参数获得电化学信号,用待检样品的电化学信号根据步骤S1得到标准曲线和/或线性方程中计算得出待检样品的黄体酮浓度。
进一步的,所述S1中黄体酮溶液的浓度分别是0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、200nM、400nM、500nM、1000nM;所述黄体酮溶液的溶剂为2%的牛血清白蛋白溶液(BSA);2%的牛血清白蛋白溶液(BSA)作为模拟血清基质。
进一步,所述S1中获得不同浓度的黄体酮溶液的电化学信号的具体方式包括:以石墨电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,将三电极体系与电化学工作站连接,通过交流阻抗法和差分脉冲伏安法在0.5mM[Fe(CN)6]3-/4-体系中扫描(扫描电位范围:-0.2-0.6V,脉冲高度为50mV,脉冲宽度为0.05s),记录电化学信号。
本发明中,把电信号分子换成[Fe(CN)6]3-/4-,保证了检测效果上的同时,避免标记型核酸适配体传感器的各种弊端。
临床应用中,同一批次修饰的电极只需要制定一次标准曲线和线性方程。
本发明的的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的再生方法,包括:电极使用后,采用二氯甲烷轻轻冲洗电极表面,使结合在适配体上的孕酮分子能充分解离,从而实现电极的再生。
由于黄体酮属于甾体类物质,几乎不溶于水,而极易溶于二氯甲烷,而二氯甲烷对DNA本身无影响,故可采用二氯甲烷对本发明的工作电极进行再生。但二氯甲烷具有一定的呼吸毒性,可以使用75%的乙醇水溶液替代。
本发明的有益效果:
相对于现有技术,本发明的基于高特异性的截短核酸适配体的黄体酮检测电极,通过结合小型电化学检测设备,能快速准确且大批量的测定生物样本血液中黄体酮含量,不仅不需要专业操作人员,昂贵的试剂盒,而且能实现较短时间内的大量样本的测量,大大提高了临床检测黄体酮的效率,节约的人力物力成本。
本发明采用的是核酸适配体制作电极,核酸适配体的结构和性质较多肽和抗体稳定,在电极制备过程中受温度、试剂等因素的影响较小,制作得到的电极也更稳定,检测准确率更高。本发明的核酸适配体长度进25个单位碱基,具有比较长适配体更好的结合亲和力和靶特异性,也更有利于提高灵敏度。
本发明利用高特异性和结合性的截短的DNA单链、两种纳米材料对电极进行修饰改性,能极大增强电极的电子传递效率,同时能特异性识别待测物黄体酮。在检测过程中,不需要对样本进行复杂的前处理,且无需添加外来电信号物质,便可实现流畅的检测过程,节约检测时间和人力物力成本。由于适配体与抗体具有相似的结合亲和性,但具有更为优越的化学和生化稳定性,且其合成较抗体更为简便。本发明采用的修饰步骤较相似研究更加简洁快速,能较好的控制修饰过程,从而保证电极检测的稳定性和可重现性。不仅如此,本发明制备的电极可以实现多次检测,通过采用特定有机溶剂重复清洗电极表面,可以除去大部分已结合的待测物,实现可再生性。
为了更好地理解和实施,下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备流程和反应原理图。
图2是实施例二中三电极系统进行电化学检测的阻抗图,其中如图中标注所示,竖直方向由上至下各条曲线分别代表1000nM、500nM、400nM、200nM、100nM、50nM、10nM、1nM、0.5nM和MCH-ssDNA-AuNPs-GCE。
图3是实施例二中三电极系统进行电化学检测的差分脉冲伏安图,通过标准由上至下分别是0-1000nM对应标准曲线制备的浓度。
图4是实施例二中三电极系统进行电化学检测得到的标准曲线图。
图5是实施例三中本发明的工作电极和检测方法的选择性验证的电流响应结果图。
具体实施方式
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反,它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本公开。在本公开和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式,除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解,本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
本申请实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。本申请实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购等途径获得的常规产品。
参见图1,是本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备流程和反应原理图。本发明基于核酸适配体的特异性识别功能,利用多壁碳纳米管和金纳米粒修饰玻碳电极(GCE),构建了一款能准确检测血液中黄体酮含量的可再生的生物电化学传感器。主要思路及原理如下:首先通过采用两种纳米材料—多壁碳纳米管和纳米金对玻碳电极进行修饰,纳米材料可以增加电极的比表面积增大电子的传递效率,起到放大信号的作用,不仅如此,纳米金的修饰还有利于核酸适配体在电极表面的固定,通过金硫键使适配体和金纳米粒自组装,从而使核酸适配体牢固的修饰在玻碳电极表面。核酸适配体作为黄体酮的特异性识别元件,由于黄体酮分子具有一定的分子量和分子体积,通过和电极上核酸适配体链的特异性结合,可以增加[Fe(CN)6]3-/4-电极在电子体系中高频段的阻抗值,三电极体系中通过工作电极的电流值减小,通过电化学信号的变化从而定量电极表面黄体酮的含量。
实施例一 基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法
本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备,包括以下操作:
(1)基础电极预处理
打磨:用玻碳电极作为基础电极;将玻碳电极先后分别在金相砂纸初打磨,顺时针逆时针各20圈,去除电极表面氧化层,再在加有Al2O3粉末(0.05pm)的麂皮上打磨,打磨手法成平行“8”字,顺时针100圈,逆时针100圈;
清洗:抛光成镜面后,用去离子水冲洗电极表面,并将打磨好的电极竖直放入盛有去离子水的烧杯中超声3min,重复三次,确保电极表面无残留打磨浆后,进行化学清洗,将上述处理好的电极分别用在乙醇、1:1HNO3溶液中超声2min,电极取出后再用去离子水超声清洗3min,重复三次,冲净后用氮气吹干;
活化:接着在0.5mol/LH2SO4溶液中用循环伏安法活化,扫描范围为:-1.0-1.0V,反复扫描直至获得稳定的伏安循环图为止(预处理好的玻碳电极循环伏安电势差在80-100mV)。
(2)用多壁碳纳米管修饰玻碳电极
在预处理好的电极上采用滴涂法,在电极表面均匀滴涂5μL浓度为1mg/mL的羧基化多壁碳纳米管后,在45℃鼓风干燥30分钟,使多壁碳纳米管充分干燥并牢固修饰在玻碳表面。
此操作中,羧基化多壁碳纳米管的溶剂是0.5mg/mL的壳聚糖乙酸溶液。羧基化多壁碳纳米管起到很好的分散效果。羧基化多壁碳纳米管溶液体积没有体积限制,只要能将基础电极表面涂满就可以了,本实施例中采用的电极对应使用5μL羧基化多壁碳纳米管溶液时效果最佳,能克服表面张力形成完整的液滴,并且保证液滴可以覆盖整个电极表面。
(3)在多壁碳纳米管-玻碳电极上电沉积纳米金
将修饰好壳聚糖多壁碳纳米管的玻碳电极(简称:MWCNTs-GCE)放置在1mM的HAuCl4溶液中,石墨电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,在-1.4-0.0V范围内,扫速为0.1V/s,扫描15圈,得到纳米金修饰多壁碳纳米管的玻碳电极,简写为:AuNPs-MWCNTs-GCE。自然晾干后备用。
(4)自组装核酸适配体
将纳米金修饰后的GCE,自然晾干后,将电极孵育在一端修饰巯基(-SH)的核酸适配体溶液中,核酸适配体的浓度为5μM,用量10μL,在35℃下孵育时间为15小时,孵育后将电极取出,自然晾干后备用。
(5)修饰了纳米金和核酸适配体的电极需要进一步在浓度为0.2mmol/L的巯基己醇中孵育30min,以封闭电极上多余的金位点。
实施例二 基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的应用
以三电极系统为例,用本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极进行电化学检测,操作包括:
工作电极为修饰好的ssDNA-AuNPs-MWCNTs-GCE电极,在工作电极上孵育不同浓度的黄体酮溶液(浓度分别是0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、200nM、400nM、500nM、1000nM,溶剂为2%的牛血清白蛋白溶液(BSA)),以石墨电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,将三电极体系与电化学工作站连接,通过交流阻抗法(结果参见图2)和差分脉冲伏安法(结果参见图3,为将电化学站收集到的原始数据导入专业作图软件graphpad-prism制成,通过标准由上至下分别是0-1000nM对应标准曲线制备的浓度)在0.5mM[Fe(CN)6]3-/4-体系中扫描,记录不同浓度下的电化学信号,从而构建一条测试的标准曲线(参见图4)和线性方程(Y=-52.033X+227.28,相关系数R2为0.992),用于后续检测。
本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极进行电化学检测后,电极的再生操作包括:采用二氯甲烷轻轻冲洗电极表面,使结合在适配体上的孕酮分子能充分解离,用去离子水将实际清洗干净后,晾干,实现电极的再生。再生电极还可重复进行检测和再生。
实施例三 本发明的工作电极和检测方法的选择性验证
以黄体酮(Progesterone)、雌二醇(Estradiol)、睾酮(Testosterone)和黄体酮在体内代谢的一种产物之一的17α-羟基黄体酮(17α-OH-Progesterone)为检测对象,考察实施例一制得的本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的选择性(特异性)。结果参见图5,虽然雌二醇(Estradiol)、睾酮(Testosterone)和17α-羟基黄体酮(17α-OH-Progesterone)三种物质化学结构与黄体酮十分相似,但电流响应却远远低于黄体酮,可以看出本发明的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极对黄体酮的特异性非常好。
实施例四 本发明的工作电极和检测方法的准确性验证
取一黄体酮片剂(购买市面品牌药物),说明书含量为50mg/mL,通过本专利方法对片剂进行溶解后的水溶液(总体积1mL)进行测量,所测得的浓度含量为48.35mg/mL。本发明的工作电极和检测方法的准确度可达96.7%。
应用实例:
取两个未知黄体酮浓度的血清样品(样品1和样品2),分别加入PBS离心,然后用传统的电化学发光法和包括本发明的工作电极的电化学生物传感器进行检测,样品1通过用本发明的检测方法测得的黄体酮含量为73.60±0.45nmol/L,而传统的电化学发光法所测黄体酮含量为:72.89±0.16nmol/L;样品2通过本发明的方法检测的黄体酮含量为100.16±0.23nmol/L;而传统的电化学发光法所测黄体酮含量为:100.57±0.09nmol/L。本发明的电极和检测方法的检测结果与现有方法检测结果一致。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:在电极上进行电沉积纳米金修饰;在所述纳米金修饰后的电极上自组装核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,其特征在于,所述核酸适配体的序列为:5’-GATTAACATTAGCCCACCGCCCACC-thiol-3’。
3.根据权利要求1或2所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,其特征在于,所述“在电极上进行电沉积纳米金修饰”前,还包括:用多壁碳纳米管修饰电极,包括:在电极表面均匀滴涂终浓度为0.5-5mg/mL的羧基化多壁碳纳米管溶液,35-60℃干燥时间20-45min。
4.根据权利要求3所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,其特征在于,所述羧基化多壁碳纳米管溶液的溶剂为0.1-2mg/mL的壳聚糖乙酸溶液。
5.根据权利要求1或2所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,其特征在于,所述的“在电极上进行电沉积纳米金修饰”,操作包括:将电极放置于HAuCl4溶液中,以石墨电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,在-1.4-0.0V范围内,以扫速0.1V/s扫描15圈,自然晾干,得到纳米金修饰的电极。
6.根据权利要求1或2所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,其特征在于,所述的“在所述纳米金修饰后的电极上自组装核酸适配体”的操作包括:将纳米金修饰后的电极置于浓度为2.5-10μM的核酸适配体溶液中,4-35℃下孵育10-25小时后取出,自然晾干。
7.根据权利要求1或2所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的制备方法,其特征在于,在所述纳米金修饰后的电极上自组装核酸适配体之后,还包括:用巯基己醇溶液中孵育,封闭电极上的空白金位点。
8.权利要求1至7任意一项所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的使用方法,其特征在于,包括:
S1:将所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极孵育不同浓度的黄体酮溶液,获得不同浓度的黄体酮溶液的电化学信号,构建标准曲线和线性方程;
S2:样品检测及浓度计算:按照与步骤S1相同的孵育操作,将所述基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极孵育待检样品,获得待检样品的电化学信号;用待检样品的电化学信号根据步骤S1得到标准曲线和/或线性方程中计算得出待检样品的黄体酮浓度。
9.根据权利要求8所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的使用方法,其特征在于,所述S1中黄体酮溶液的浓度包括:0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、200nM、400nM、500nM、1000nM;所述黄体酮溶液的溶剂为2%的牛血清白蛋白溶液。
10.根据权利要求8所述的基于截短型核酸适配体检测黄体酮的工作电极的使用方法,其特征在于,获得所述不同浓度的黄体酮溶液和待检样品的电化学信号的具体方法包括:以石墨电极为对电极,Ag/AgCl电极为参比电极,将电极体系与电化学工作站连接,通过交流阻抗法和差分脉冲伏安法在0.5mM[Fe(CN)6]3-/4-体系中扫描,记录电化学信号。
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