CN114199969B - 一种基于核酸适配体的纳米电极生物传感器及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于核酸适配体的纳米电极生物传感器及其应用。所述基于核酸适配体的纳米电极生物传感器包括纳米电极芯片；纳米电极芯片包括基底和设于基底上的金属纳米线和信号采集电极，金属纳米线的两端连接信号采集电极；金属纳米线上修饰核酸适配体作为检测探针；核酸适配体为单链DNA或单链RNA，核苷酸序列长度为20～80nt。使用本发明提供的制作方法可以快速制备出金属纳米电极传感器芯片，针对特定的蛋白质或小分子类生物标志物，采取可以与之特异性结合的核酸适配体探针，将探针固定在金属纳米电极表面，将金属纳米电极的优异电学性能与核酸适配体的高结合能力以及高特异性优势相结合，对目标生物标志物进行高灵敏度检测。

Description

一种基于核酸适配体的纳米电极生物传感器及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于核酸适配体的纳米电极生物传感器及其应用，属于生物测试技术领域。
背景技术
微量生物标志物的定量检测对于癌症、心血管等重大疾病的早期诊断与预后具有重要意义。例如心肌肌钙蛋白I(cTnI)的检测用于急性心肌梗死(AMI)的临床诊断中，而低至0.01ng/mL水平的血浆cTnI可以预示慢性心力衰竭(CHF)的发生。目前临床应用中生物标志物的检测主要借助大型医学检测仪器或试剂盒等检测方法，通过对体液与排泄物样本的分析进行。针对某些生物标志物，目前的技术未实现高灵敏度的检出与浓度表征，无法满足某些疾病特别是早期疾病的诊断与预防需求。因此，开发一种具有高灵敏度的生物标志物检测方法十分重要。
纳米电极传感器具有优异的电学性能。与常规基于电阻抗的传感器相比，其纳米尺度的线宽使其具有更明显的表面电荷效应、更快的物质转移速度以及与待测物质尺度更相近的双电子层电容。因此将纳米电极作为传感单元，有望进一步提高生物传感器的灵敏度。
核酸适配体作为有一定立体结构的单链DNA或RNA分子，具有许多优点。经过系统进化方法可以筛选出针对特定生物标志物具有高结合能力的核酸适配体并得到其碱基序列。核酸适配体可通过化学合成得到，相较抗体等其他探针分子具有成本低，易于引入基团修饰，性质稳定的特点。因此核酸适配体作为生物传感器的探针具有极高的应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体的纳米电极生物传感器，可实现不同生物标志物的高灵敏度检测，以反映病人生理状态。
针对特定的蛋白质或小分子类生物标志物，采取可以与之特异性结合的核酸适配体探针，将探针固定在金属纳米线表面，将金属纳米线的优异电学性能与核酸适配体的高结合能力以及高特异性优势相结合，对目标生物标志物进行高灵敏度检测。
本发明所提供的基于核酸适配体的纳米电极生物传感器，包括纳米电极芯片和引流模块；
所述纳米电极芯片包括基底和设于所述基底上的金属纳米线和信号采集电极，所述金属纳米线的两端连接所述信号采集电极；
所述金属纳米线上修饰核酸适配体作为检测探针。
上述的纳米电极生物传感器中，所述基底为绝缘基底，其可以由绝缘材料制成，或者由导电材料或半导体材料制成后，生长绝缘层，如氮化硅、氧化硅等，绝缘层的厚度可为0.1～1μm。
上述的纳米电极生物传感器中，所述金属纳米线的宽度为100～500nm，长度为50～400μm；
所述金属纳米线为金纳米线，具体可为钛合金-金纳米线或铬合金-金纳米线；
所述信号采集电极为金电极、铂电极、铜电极或铝电极。
上述的纳米电极生物传感器中，所述核酸适配体为单链DNA或单链RNA，核苷酸序列长度为20～80nt，可以通过自身碱基互补配对形成一定的二级结构；
表面修饰有所述核酸适配体的所述金属纳米线可以捕获样本中的被分析物，使纳米电极生物传感器产生电学信号。
本发明还提供了所述纳米电极生物传感器的制作方法，包括如下步骤：
S1、在所述基底上依次制备所述金属纳米线和所述信号采集电极；
S2、通过自组装法或物理吸附法在所述金属纳米线上修饰所述核酸适配体，然后进行封闭得到所述纳米电极芯片。
上述的制作方法中，步骤S1中，制备所述金属纳米线之前，通过氧化炉处理或PECVD，在所述基底表面生长所述二氧化硅绝缘层；
通过曝光、显影和磁控溅射的方式制备所述金属纳米线，如按照下述步骤制备金纳米线：
在所述基底表面旋涂300～700nm厚的正性电子束光刻胶(包括聚甲基丙烯酸甲酯等)后，进行电子束曝光，显影后进行磁控溅射，顺序溅射5～35nm厚度铬合金或钛合金与35～95nm的金，形成所述金纳米线；
去胶之后在所述基底表面旋涂1.0～2.5μm厚的负性光刻胶(包括AR-N 4340、SU-8等)，使用常规光刻技术(借助掩膜版)实现所述信号采集电极的加工。
上述的制作方法中，步骤S2中，所述核酸适配体上的修饰基团包括巯基、氨基、羧基、醛基和生物素，修饰位置为5‘-端、3‘-端或中间碱基位置。
上述的制作方法中，步骤S2中，所述自组装法为金-硫键自组装法，包括如下方式1)或2)：
1)在所述金属纳米线的表面直接固定巯基修饰的所述核酸适配体；
2)利用带巯基的试剂(11-巯基十一烷酸等)引入羧基、氨基、链霉亲和素等连接基团；
所述物理吸附法的步骤为：利用修饰的大分子物质与所述金属纳米线的表面吸附作用，在所述金属纳米线的表面引入连接基团，然后将所述连接基团与所述核酸适配体连接。
上述的制作方法中，所述封闭采用的试剂包括但不限于BSA、6-巯基-1-己醇(MCH)、甘氨酸等，封闭时间为10min至1h，通过封闭以避免表面非特异性吸。
本发明进一步提供了一种生物标志物的检测方法，包括如下步骤：
将待测样本溶液进入至所述纳米电极生物传感器的所述金属纳米线上，进行静置孵育；采用电化学方法通过所述信号采集电极采集电学数据，经换算即得到待测样本中生物标志物的浓度；
通过如下1)或2)的方式引入所述待测样本溶液：
1)将所述金属纳米线浸没在所述待测样本溶液中；
2)通过引流模块引入所述待测样本溶液；
所述引流模块的底部设有流体孔道，所述流体孔道的两端连接导管通孔；
所述引流模块键合配合于所述纳米电极芯片上，所述金属纳米线位于所述流体孔道形成的封闭孔道内，所述信号采集电极暴露于所述封闭孔道的外部；
所述流体孔道的宽度为50～150μm；
所述引流模块的材质为聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯；
可通过如下方式制作所述引流模块：通过注塑成型或热压成型的方式在基材上形成所述流体孔道和所述导管通孔，得到所述引流模块；将所述引流模块键合于所述纳米电极芯片上，使所述金属纳米线位于所述流体孔道形成的封闭孔道内，所述信号采集电极暴露于所述封闭孔道的外部。
在室温下进行静置孵育，时间为0.5～2h；
所述生物标志物包括大分子蛋白质类生物标志物、小分子激素生物标志物和代谢物类生物标志物，包括但不限于：心肌肌钙蛋白cTnI、前列腺特异性抗原PSA、表面活性蛋白SPA、雌二醇、孕酮、皮质醇、葡萄糖、氨基酸和尿酸；对于特定的生物标志物分子，可以通过定向进化方法得到与之特异性结合的核酸适配体序列，并采取化学合成方式生产相应核酸适配体探针，以此可以满足不同生物标志物分子的检测需求。
所述电化学方法包括但不限于循环伏安法、电化学阻抗法、时间-电流曲线、差分脉冲伏安法、方波伏安法等。
本发明提供的纳米电极生物传感器的制作工艺具有极好的通用性，针对不同生物标志物，可选定与之特异性结合的核酸适配体作为探针，从而满足不同生物标志物的检测需求，
本发明提供的纳米电极生物传感器可对多种生物标志物进行高灵敏度检测，包含蛋白类标志物心肌肌钙蛋白(cTnI)、前列腺特异性抗原(PSA)以及小分子激素雌二醇(E2)等，满足疾病早期诊断需求。
使用本发明提供的制作方法可以快速制备出金属纳米电极传感器芯片，针对特定的蛋白质或小分子类生物标志物，采取可以与之特异性结合的核酸适配体探针，将探针固定在金属纳米电极表面，将金属纳米电极的优异电学性能与核酸适配体的高结合能力以及高特异性优势相结合，对目标生物标志物进行高灵敏度检测。
附图说明
图1为本发明纳米电极生物传感器的结构示意图。
图2为本发明纳米电极生物传感器的检测原理示意图。
图3为本发明纳米电极生物传感器与引流模块配合时的结构示意图。
图4为本发明纳米电极生物传感器中引流模的块结构示意图。
图5为利用本发明纳米电极生物传感器检测心肌肌钙蛋白I(cTnI)的结果。
图中各标记如下：
1纳米电极芯片、1-1硅基底、1-2二氧化硅绝缘层、1-3信号采集电极、1-4金纳米线、2引流模块、2-1流体孔道、2-2导管孔道。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如图1所示，为本发明提供的纳米电极生物传感器的结构示意图，包括纳米电极芯片1和引流模块2。纳米电极芯片1包括硅基底1-1和设于硅基底1-1上的金纳米线1-4和信号采集电极1-3，金纳米线1-4的两端连接信号采集电极1-3，硅基底1-1表面上生长有二氧化硅绝缘层1-2。
本实施例提供的纳米电极生物传感器中，金纳米线1-4上修饰核酸适配体作为检测探针，核酸适配体为单链DNA或单链RNA，核苷酸序列长度为20～80nt，可以通过自身碱基互补配对形成一定的二级结构；表面修饰有核酸适配体的金纳米线1-4可以捕获样本中的被分析物，使纳米电极生物传感器产生电学信号从而实现检测。
本发明纳米电极生物传感器的检测原理如图2所示，金属纳米线表面的核酸适配体可以特异性捕获溶液中的待测生物标志物分子，引起金属纳米线表面的双电层结构变化。可以通过电流-时间曲线、循环伏安法或电化学阻抗谱等方式检测到电学信号变化，由此检出溶液中的特定生物标志物分子。一定反应时间内，待测物的浓度与被捕获的分子数量存在依赖关系，因此可以通过线性或非线性拟合的方式建立电学信号与生物标志物浓度的关系，以此实现浓度表征。
如图3所示，为本发明纳米电极生物传感器与引流模块配合时的结构示意图，即通过该引流模块引入待测物和电阻抗谱(EIS)检测信号，其中，引流模块的结构示意图如图4所示，引流模块2的底部设有一流体孔道2-1，流体孔道2-1的两端连接导管通孔2-2。引流模块2键合配合于纳米电极芯片1上，金纳米线1-4位于流体孔道2-1形成的封闭孔道内，信号采集电极1-3暴露于封闭孔道的外部，如图3所示。
本实施例中，引流模块2的材料包括但不限于聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等，通过注塑成型与热压成型等方式加工形成微流控管道结构(流体孔道2-1和导管孔道2-2)。然后将引流模块2键合于纳米电极芯片1上，使金纳米线1-4位于流体孔道2-1形成的封闭孔道内，信号采集电极1-3暴露于封闭孔道的外部，如图3所示。
本实施例提供的纳米电极生物传感器中，二氧化硅绝缘层1-2的厚度为0.1～1μm；金纳米线1-4的宽度为100～500nm，长度为50～400μm；流体孔道2-1的宽度为50～150μm。
本发明纳米电极生物传感器可按照下述方法进行制备：
1)通过氧化炉处理，在硅基底1-1表面生长二氧化硅绝缘层1-2。在二氧化硅绝缘层1-2表面旋涂300～700nm厚的正性电子束光刻胶(包括聚甲基丙烯酸甲酯等)后，进行电子束曝光。显影后进行磁控溅射，顺序溅射5～35nm厚度铬合金或钛合金与35～95nm的金，形成金纳米线1-4。去胶之后在硅片表面旋涂1.0～2.5μm厚的负性光刻胶(包括AR-N 4340、SU-8等)，使用常规光刻技术(借助掩膜版)实现信号采集电极1-3的在硅片表面的加工。去胶即得到本专利所述的纳米电极芯片。
2)在金纳米线1-4的表面修饰核酸适配体作为探针分子。修饰的方式包括自组装法和物理吸附法等。采用的核酸适配体修饰基团包括但不限于巯基、氨基、羧基、醛基、生物素等，修饰位置可以是5‘-端，3‘-端或中间碱基位置。其中，自组装法利用金-硫键自组装，在金纳米线1-4表面直接固定巯基修饰的核酸适配体，或利用带巯基的试剂(11-巯基十一烷酸等)引入羧基、氨基、链霉亲和素等连接基团。物理吸附法利用修饰的BSA等大分子物质与金的表面吸附作用，在金纳米线1-4表面引入连接基团。通过氨基活化连接、羧基活化连接、生物素-链霉亲和素特异性结合等方式实现连接基团与核酸适配体的连接。
3)固定核酸适配体后需进行封闭，避免表面非特异性吸附。封闭试剂包括但不限于BSA、6-巯基-1-己醇(MCH)、甘氨酸等，封闭时间可为10min～1h。
具体地，基于心肌肌钙蛋白I(cTnI)核酸适配体的纳米电极生物传感器的制备方法如下：
基底表面生长0.5μm厚的二氧化硅绝缘层。在硅片表面旋涂300nm厚的正性电子束光刻胶(聚甲基丙烯酸甲酯)后，经过电子束曝光与显影后进行磁控溅射，顺序溅射10nm厚度的钛合金与90nm厚度的金，形成金纳米线，宽度为200nm，长度为150μm。去胶之后在硅片表面旋涂1.4μm厚的负性光刻胶(AR-N 4340)，借助掩膜版结构部分曝光。显影后使用磁控溅射的方式顺序溅射10nm厚度的钛合金与90nm厚度的金，得到信号采集电极。去胶即得到纳米电极芯片。
本实施例采用cTnI的核酸适配体序列为5‘-CGT GCA GTA CGC CAA CCT TTC TCATGC GCT GCC CCT CTT A-3‘(文献报道解离常数值Kd＝270pM)，核酸序列长度40nt，在5‘-端进行巯基修饰。
本实施例采用金-硫键自组装法进行纳米线表面的核酸适配体固定。巯基基团在使用前需要进行还原活化。将巯基修饰的核酸适配体探针溶于浓度为0.1M的三(2一氯乙基)磷酸酯(TCEP)的去离子水溶液，室温静置1h后加入1/10体积的3M醋酸钠溶液(pH＝5.2)，3倍体积的无水乙醇，-80℃静置1h。然后于4℃，13000g转速下离心30min，去上清，沉淀用-20℃预冷的无水乙醇洗涤。所得沉淀溶于1X PBS，使用Nanodrop进行浓度定量。
将金纳米线置于浓度为1uM的巯基修饰核酸适配体溶液中，4℃避光孵育16h，之后用1×PBS清洗，通过金-硫键自组装将核酸适配体固定在金纳米线表面。之后用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液的6-巯基-1-己醇(MCH)进行封闭，浓度为2mM，室温静置20min用Tris-HCl清洗。经过上述步骤得到表面修饰cTnI核酸适配体的纳米电极芯片。
本实施例引流模块中的流体孔道的宽度为120μm，材料为PDMS，通过注塑成型方式加工形成微流控管道结构。
将纳米电极芯片与引流模块紧密键合，使流体孔道形成封闭孔道，金纳米线暴露于封闭管道中，可以与待测样本溶液接触。
采用本实施例制备的基于心肌肌钙蛋白I(cTnI)核酸适配体的纳米电极生物传感器实现对样本溶液中cTnI的检测，使用辰华电化学工作站CHI660e，工作电极与对电极分别与传感器两端的信号采集电极连接，步骤如下：
将cTnI溶液(10pg/mL)通入导管孔道中，流速为1.5mL/h，与金纳米线接触室温孵育1h后，进行电化学阻抗(EIS)测试。
所得测试曲线如图5所示，可以看出，本实施例纳米电极生物传感器对极低浓度的cTnI仍有响应。

Claims (7)

1.一种基于核酸适配体的纳米电极生物传感器，包括纳米电极芯片；
所述纳米电极芯片包括基底和设于所述基底上的金属纳米线和信号采集电极，所述金属纳米线的两端连接所述信号采集电极；
所述金属纳米线上修饰核酸适配体作为检测探针；
所述金属纳米线为金纳米线；
所述核酸适配体指的是与生物标志物特异性结合的核酸探针，为单链DNA或单链RNA，核苷酸序列长度为20~80 nt；
所述生物标志物包括：雌二醇、孕酮、皮质醇、葡萄糖、氨基酸和尿酸；
通过自组装法或物理吸附法在所述金属纳米线上修饰所述核酸适配体；
所述自组装法为金-硫键自组装法，包括如下方式1）或2）：
1）在所述金属纳米线的表面直接固定巯基修饰的所述核酸适配体；
2）利用带巯基的试剂引入连接基团；
所述物理吸附法的步骤为：利用修饰的大分子物质与所述金属纳米线的表面吸附作用，在所述金属纳米线的表面引入连接基团，然后将所述连接基团与所述核酸适配体连接。
2. 根据权利要求1所述的纳米电极生物传感器，其特征在于：所述金属纳米线的宽度为100~500 nm，长度为50~400 μm；
所述信号采集电极为金电极、铂电极、铜电极或铝电极。
3.权利要求1或2所述纳米电极生物传感器的制作方法，包括如下步骤：
S1、在所述基底上依次制备所述金属纳米线和所述信号采集电极；
S2、通过自组装法或物理吸附法在所述金属纳米线上修饰所述核酸适配体，然后进行封闭得到所述纳米电极芯片；
所述自组装法为金-硫键自组装法，包括如下方式1）或2）：
1）在所述金属纳米线的表面直接固定巯基修饰的所述核酸适配体；
2）利用带巯基的试剂引入连接基团；
所述物理吸附法的步骤为：利用修饰的大分子物质与所述金属纳米线的表面吸附作用，在所述金属纳米线的表面引入连接基团，然后将所述连接基团与所述核酸适配体连接。
4.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于：步骤S2中，所述核酸适配体上的修饰基团包括巯基、氨基、羧基、醛基和生物素，修饰位置为5‘-端、3‘-端或中间碱基位置。
5.权利要求1或2所述纳米电极生物传感器在检测生物标志物中的应用；
所述生物标志物包括：雌二醇、孕酮、皮质醇、葡萄糖、氨基酸和尿酸。
6.一种生物标志物的检测方法，包括如下步骤：
将待测样本溶液进入至权利要求1或2项所述纳米电极生物传感器的所述金属纳米线上，进行静置孵育；采用电化学方法通过所述信号采集电极采集电学数据，经换算即得到待测样本中生物标志物的浓度。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：所述生物标志物包括：雌二醇、孕酮、皮质醇、葡萄糖、氨基酸和尿酸；
通过如下1）或2）的方式引入所述待测样本溶液：
1）将所述金属纳米线浸没在所述待测样本溶液中；
2）通过引流模块引入所述待测样本溶液；
所述引流模块的底部设有流体孔道，所述流体孔道的两端连接导管通孔；
所述引流模块键合配合于所述纳米电极芯片上，所述金属纳米线位于所述流体孔道形成的封闭孔道内，所述信号采集电极暴露于所述封闭孔道的外部；
所述流体孔道的宽度为50~150 μm；
所述引流模块的材质为聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
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