CN111122679B - 一种dna生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种DNA生物传感器及其制备方法和应用。本发明通过将圆片级可控纳米线阵列场效应管硅烷化，以化学键的形式将末端带有羧基修饰的DNA修饰在硅纳米线的表面，构建出一种基于圆片级可控纳米线阵列的DNA生物传感器，利用纳米线阵列上的DNA探针与不同浓度的目标检测DNA孵化，产生栅压电场，来调控源漏极之间的电流，并通过这种电流变化，来迅速定量检测特定DNA。该方法操作简单，易实现，具有很好的生物相容性，应用广泛，且灵敏度高，检测限可以达到0.1fM，可实现实时检测。

Description

一种DNA生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物传感器技术领域，具体来说，涉及一种DNA生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
自二十世纪八十年代，纳米科学技术诞生并高速发展成为一种新型的交叉性技术。其主要在0.1nm-100nm的纳米尺度空间内研究电子、原子和其他类型物质运动规律、相互作用及特性。并且允许在该尺度范围内对原子、分子等进行控制和加工。由于纳米材料尺寸小，表现出许多特殊物理特性，如宏观量子隧道、量子尺寸效应、库伦阻塞效应等，在之后发展的20年里，纳米技术不断地应用于物理、化学、材料、制造、信息等多种学科中。
而纳米线作为一种重要的纳米材料，拥有极好的电学、机械性质，较大的比表面积、较好的生物相容性和表面可修饰性，而被广泛的应用于传感器的设计制备中。尤其当纳米线被修饰上金属粒子时，信号可以得到很大程度的提高，其增强因子可以达到107至109。因此这种材料可以用以制备超敏感生物传感器，以检测小分子生物(如DNA、蛋白质、细菌等)。另一方面，这种传感技术需要与光学仪器集成，将某种生化现象转化为可读信号，这也使得传感检测成本提高，因而满足低成本的需求和高效的信号转化成了传感器设计的关键。而场效应晶体管可以有效地将表面分子的相互作用转化成可读信号，并能实现高选择、高灵敏度、实时响应的检测。
癌症作为严重危害人类健康的重大疾病之一，有效提高早期诊断和术后治疗是降低死亡率，改善患者生活质量的关键。通常，一些特定的DNA序列则可被作为癌症标志物。目前已经提出了多种对特定核苷酸序列检测的分析策略，包括荧光法、聚合酶链反应法、表面增强拉曼散射法。但是这些方法过于复杂、耗时、成本较高，并且灵敏度不高。
因此，基于现有技术存在的缺陷，本发明开发了一种DNA生物传感器及其制备方法和应用，本发明的DNA生物传感器基于圆片级可控纳米线阵列制备而成，能够实现对特定的DNA序列的高灵敏度、高特异性、实时在线检测，为其在相关癌症的医疗临床诊断和术后治疗中的应用奠定了基础。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种DNA生物传感器及其制备方法和应用。本发明通过将圆片级可控纳米线阵列场效应管硅烷化，再将末端带有羧基修饰的DNA以化学键的形式修饰在硅纳米线的表面，构建而成一种基于圆片级可控纳米线阵列的DNA生物传感器，并利用生物栅压调控效应来改变源漏极电流，以快速检测DNA。
为了达到上述目的，本发明采取如下技术方案：
一种DNA生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
S1：合成末端带有羧基的单链探针DNA，所述的单链探针DNA与目标检测DNA链实现碱基互补配对；
S2：依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管，然后用惰性气体吹干；
S3：在圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管的集成芯片传感部位滴加氟化氢(HF)溶液，腐蚀处理，以除去纳米线表面的氧化膜，再用乙醇、去离子水依次冲洗处理；
S4：将S3处理后的圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管浸泡在硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液中过夜；
S5：在单链探针DNA中添加羧基活化试剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化处理；
S6：清洗浸泡处理后的圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管，用惰性气体吹干，并在纳米线表面添加单链探针DNA溶液，常温孵育；
S7：将步骤S6得到的圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管清洗后即可得到COOH-DNA/SiNWs电极，即DNA生物传感器。
优选的，S1所述的单链探针DNA序列为(SEQ ID No.1)：5’-COOH-CCC CCC AGT GATTTT AGA GAG-3’，所述的目标检测DNA链(SEQ ID No.2)为5’-CTC TCT AAA ATC ACT-3’。
优选的，S2中的丙酮超声清洗时间为10～30min，无水乙醇超声清洗时间为10～30min，去离子水超声时间为10～30min。
优选的，S2所述的圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管为硅纳米线场效应管(SiNWs-FET)。
优选的，S2所述的硅纳米线场效应管是(111)型SOI硅片，其结构分成3层，分别为硅基底，氧化硅层和顶层硅。
优选的，S2所述的纳米线阵列是以15×8叉指结构呈现，且纳米线尺寸大小为50～120nm。
优选的，S2和S6所述的惰性气体为氮气。
优选的，S3中氟化氢(HF)溶液质量浓度为2～5％，腐蚀处理时间为2～10s。
优选的，S3中乙醇、去离子水冲洗时间均为30～60s。
优选的，S4中硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液的质量浓度为1～5％，其浸泡时间为10～24h。
优选的，S5中单链探针DNA溶于磷酸缓冲溶液(PBS)，磷酸缓冲溶液主要成分为磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)。其浓度为1mol/L～0.001mol/L，PH＝7.0～7.4。
优选的，S5中单链探针DNA浓度为10-7M～10-5M。
优选的，S5中N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液浓度为0.2～0.8mM，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液浓度为0.8～3.2mM。
优选的，S5中单链探针DNA与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，磷酸缓冲溶液(PBS)体积配比为4：5：5：6。
优选的，S5中单链探针DNA溶液活化时间为15～30min。
优选的，S6中纳米线阵列场效应晶体管清洗所使用试剂为无水乙醇溶液，清洗方式为冲洗，清洗时间为10～60s，以除去过多残留的APTES溶液，使SiNWs表面末端连接上氨基。
优选的，S6中孵育温度为25～37℃，孵育时间为2～5h。
优选的，S7中的清洗试剂为磷酸缓冲溶液(PBS)，其浓度为0.001～1mol/L，以除去未固定上的单链探针DNA。
本发明还提供上述制备方法制备而得的一种DNA生物传感器。
本发明进一步上述DNA生物传感器的应用，所述DNA生物传感器用于定量检测特定DNA，包括如下步骤：
(1)针对所要检测的特定的DNA序列，利用DNA生物传感器检测目标DNA，将DNA生物传感器连接整个检测系统中，形成流道通路；
(2)启动检测装置，设定源漏极和栅源电压，并将所述DNA生物传感器浸泡于磷酸缓冲溶液(PBS)中10～30min，用数字源表检测源极和漏极之间的电流，记为基准电流；
(3)滴加定量不同浓度的目标DNA溶液于DNA生物传感器表面，于常温孵育1～3h；
(4)磷酸缓冲溶液(PBS)清洗传感器表面，以除去未结合上的多余目标DNA；同时用数字源表检测源极和漏极之间的电流变化情况。
优选的，所述(1)中，检测系统包括电压源和数字源表，通过对DNA生物传感器的源极和漏极之间施加一定的电压，以检测源极和漏极之间的电流变化。
优选的，所述(2)中，源漏极施加的电压为-3V～3V，栅源极施加的电压为-3～0V。
优选的，所述(3)中，不同浓度的目标DNA溶液的制备方法为：将目标DNA链用浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配比制成浓度为10-16M、10-15M、10-14M、10-13M、10-12M、10-11M、10-10M的目标检测DNA溶液。
优选的，所述(3)中，特定的目标DNA序列(SEQ ID No.2)为：5’-CTC TCT AAA ATCACT-3’，选用的羧基修饰的单链DNA探针序列(SEQ ID No.1)为：5’-COOH-CCC CCC AGT GATTTT AGA GAG-3’。
优选的，所述(3)中，目标DNA孵育温度为25～37℃。
本发明方法在检测特定DNA序列时，主要利用硅烷化在硅纳米线表面形成氨基键，通过脱水缩合反应将末端携带羧基的DNA探针稳定的固定在硅纳米线上。由于检测目标DNA序列携带大量的负电荷，导致在硅纳米线周围形成一个负电效应场，改变硅纳米线内部的载流子分布情况，致使电导和电流变化，产生生物栅压调制效应。
本发明的有益效果是：
1、本发明使用一种DNA生物传感器来定量检测特定DNA，其传感器具有优越的选择性，且稳定性高。
2、本发明的DNA传感器检测灵敏度高，其检测限可以达到0.1fM，检测范围广，可以检测到10-16M～10-10M。
3、本发明的DNA生物传感器，应用范围广，可以用于特定癌症筛查、遗传工程、食品安全等方面。
4、本发明操作过程简单，成本低，无需昂贵的检测装置，且具有很好的生物相容性。
5、本发明制备简单，无需繁琐的预处理，且尺寸小，可实现高效实时检测。
附图说明
图1DNA生物传感器的检测原理示意图。
图2针对不同浓度的ctDNA归一化电流响应函数图。
图3对不同浓度的ctDNA检测的电流响应图。
图4DNA生物传感器对1pM ctDNA的高度选择性电流响应图。
图5DNA生物传感器对10nM ctDNA的高度选择性电流响应图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但是本发明所要保护的范围并不限于此。
实施例1
一种DNA生物传感器定量检测特定DNA的方法包括如下步骤：
(1)合成末端带有羧基且可与目标检测DNA链完全配对的单链DNA探针。所述的单链DNA探针序列(SEQ ID No.1)为：5’-COOH-CCC CCC AGT GAT TTT AGA GAG-3’,所述的目标检测DNA链(SEQ ID No.2)为5’-CTC TCT AAA ATC ACT-3’。
(2)将制备好的硅纳米线场效应管集成芯片浸泡在丙酮溶液中，超声清洗10min，取出硅纳米线场效应管集成芯片，加入无水乙醇溶液超声清洗10min，再次取出芯片，放入去离子水中超声清洗10min，将清洗好的硅纳米线场效应管集成芯片用惰性气体氮气吹干。
(3)在硅纳米线场效应管集成芯片传感部位滴加20μL的2％氟化氢(HF)溶液，腐蚀处理2s，以除去硅纳米线表面的氧化膜。所述的传感部位为硅纳米线阵列集成部分。
(4)用无水乙醇溶液冲洗硅纳米线场效应管集成芯片30s，再用去离子水冲洗30s，以除去硅纳米线表面的氟化氢溶液，将清洗好的芯片用惰性气体氮气吹干。
(5)将吹干后的集成芯片放入真空干燥箱，于70℃下，干燥处理15min，以除去芯片表面及引脚处残留的水。
(6)将集成芯片置于氧等离子清洗机中，通入氧气，设定工作功率为70W，氧等离子处理5min，使芯片表面产生生成一层羟基链，更加亲水。
(7)将芯片浸泡在2％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液中12h，随后用无水乙醇冲洗残余的APTES溶液，再用惰性气体氮气吹干。并将芯片放置于真空干燥箱中，于120℃真空干燥处理15min。
(8)连接检测传感装置，施加源漏极之间的电压为-1V，串联接入电流检测装置，即数字源表以检测源漏极之间的电流。
(9)活化单链探针DNA。用0.01molPBS溶液配制成2.5μM的探针DNA溶液，0.8mM的NHS溶液，3.2mM的EDC溶液，0.01molPBS溶液，以4：5：5：6的体积配比进行活化处理30min，并滴加在硅纳米线上孵育2h。
(10)用0.01molPBS缓冲液冲洗30s，洗去尚未结合的探针DNA，用惰性气体氮气吹干。再滴加160μL 0.01mol的PBS缓冲液静置30min，测量其源漏极之间的电流，并作为基准电流。
(11)用0.01molPBS缓冲液配置成不同浓度的目标DNA溶液，浓度分别为10-16M、10-15M、10-14M、10-13M、10-12M、10-11M、10-10M。取160μL的目标DNA溶液滴加在传感器的表面，于37℃下杂交孵化2h。并实时检测源漏极之间的电流变化。
本实施例所述的探针DNA溶液配置的方法为：将探针DNA链干粉于离心机中以5000rpm高速离心1min，再用0.01mol的PBS缓冲溶液，PH＝7.4配置成浓度为2.5μM的探针DNA溶液，于混匀器混匀30～60s。
本实施例所述不同浓度的目标DNA溶液的制备方法为：将目标DNA链干粉在离心机中以5000rpm高速离心1min，再用0.01mol的PBS缓冲溶液，PH＝7.4配置成浓度为10-16M、10-15M、10-14M、10-13M、10-12M、10-11M、10-10M的目标DNA溶液，并于混匀器混匀30～60s。
参照图1，搭建DNA生物传感器定量检测特定DNA的平台，以硅纳米线为传输通道。在硅纳米线上以硅烷剂APTES作为连接物，将DNA探针以肽键的形式固定在纳米线表面。引入目标ctDNA后，通过碱基互补配对原则进行杂交以定量检测不同浓度的DNA。
参照图2和图3，DNA生物传感器定量检测不同浓度的ctDNA的结果，ctDNA由0.01mol的PBS缓冲液配比成10-16M、10-15M、10-14M、10-13M、10-12M、10-11M、10-10M。由图3可知，当引入10-16M的ctDNA时，电流出现了明显的上升趋势，随着浓度的不断增加，电流的变化也呈现阶梯式上升。将电流变化进行给归一化处理，则可得到图2的归一化电流响应拟合曲线。从拟合曲线中可以看出，电流响应响应随浓度增加而呈线性变化。同时也可以很好的反映出基于圆片级可控纳米线阵列的DNA生物传感器的灵敏度非常高，检测限可以低至0.1fM，这对后续实现更高精度的检测提供了一条有效途径。
实施例2
一种DNA生物传感器对特定DNA的特异性识别方法，包括如下步骤：
(1)合成末端带有羧基且可与目标检测DNA链完全配对的单链DNA探针及准备目标检测DNA和完全不匹配DNA。所述的单链DNA探针序列(SEQ ID No.1)为：5’-COOH-CCC CCCAGT GAT TTT AGA GAG-3’,所述的目标检测DNA链(SEQ ID No.2)为5’-CTC TCT AAA ATCACT-3’，所述的完全不匹配DNA链(SEQ ID No.3)为5’-TAC TCC GCG CTA ACG-3’。
(2)将制备好的硅纳米线场效应管集成芯片浸泡在丙酮溶液中，超声清洗10min，取出硅纳米线场效应管集成芯片，加入无水乙醇溶液超声清洗10min，再次取出芯片，放入去离子水中超声清洗10min，将清洗好的硅纳米线场效应管集成芯片用惰性气体氮气吹干。
(3)在硅纳米线场效应管集成芯片传感部位滴加20μL的2％氟化氢(HF)溶液，腐蚀处理2s，以除去硅纳米线表面的氧化膜。所述的传感部位为硅纳米线阵列集成部分。
(4)用无水乙醇溶液冲洗硅纳米线场效应管集成芯片30s，再用去离子水冲洗30s，以除去硅纳米线表面的氟化氢溶液，将清洗好的芯片用惰性气体氮气吹干。
(5)将吹干后的集成芯片放入真空干燥箱，于70℃下，干燥处理15min，以除去芯片表面及引脚处残留的水。
(6)将集成芯片置于氧等离子清洗机中，通入氧气，设定工作功率为70W，氧等离子处理5min，使芯片表面产生生成一层羟基链，更加亲水。
(7)将芯片浸泡在2％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)乙醇溶液中12h，随后用无水乙醇冲洗残余的APTES溶液，再用惰性气体氮气吹干。并将芯片放置于真空干燥箱中，于120℃真空干燥处理15min。
(8)连接检测传感装置，施加源漏极之间的电压为-1V，串联接入电流检测装置，即数字源表以检测源漏极之间的电流。
(9)活化单链探针DNA。用0.01molPBS溶液配制成2.5μM的探针DNA溶液，0.8mM的NHS溶液，3.2mM的EDC溶液，0.01molPBS溶液，以4：5：5：6的体积配比进行活化处理30min，并滴加在硅纳米线上孵育2h。
(10)用0.01molPBS缓冲液冲洗30s，洗去尚未结合的探针DNA，用惰性气体氮气吹干。再滴加160μL 0.01mol的PBS缓冲液静置30min，测量其源漏极之间的电流，并作为基准电流。
(11)用0.01molPBS缓冲液配置成不同浓度的完全不匹配DNA(ncDNA)溶液，浓度分别为10-12M、10-8M。取160μL的ncDNA溶液滴加在传感器的表面，于37℃下杂交孵化1h。并实时检测源漏极之间的电流变化。
(12)吸走ncDNA溶液，用0.01molPBS缓冲液配置成相同浓度的目标DNA溶液，浓度分别为10-12M、10-8M。取160μL的目标DNA溶液滴加在传感器的表面，于37℃下杂交孵化1h。并实时检测源漏极之间的电流变化。
参照图4和图5，为DNA生物传感器对特定DNA的特异性识别检测结果。图4反映了对1pM的ctDNA特异性识别的检测结果，以相同浓度1pM完全错匹配的ncDNA作为参照对象。当在0.01mol PBS缓冲液后引入1pM ncDNA时，电流没有明显的波动，随后加入1pM ctDNA时，电流出现迅速的增长。图5反映了对10nM的ctDNA特异性识别的检测结果。同样发现当在0.01mol PBS缓冲液后引入10nM ncDNA时，电流几乎没有变化，而加入10nM ctDNA时，电流出现迅速的增加。从两组不同浓度的特异性检测中，可以看出DNA生物传感器只对特定的ctDNA具有识别性，且具有很好的选择性。
虽然本发明已经以较佳的实施例披露如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围的情况下，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或者修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 杭州电子科技大学
<120> 一种DNA生物传感器及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
ccccccagtg attttagaga g 21
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
ctctctaaaa tcact 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
tactccgcgc taacg 15

Claims (10)

1.一种DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：合成末端带有羧基的单链探针DNA，所述的单链探针DNA与目标检测DNA链实现碱基互补配对；所述的单链探针DNA序列为(SEQ IDNo.1)：5’-COOH-CCC CCC AGT GAT TTTAGAGAG-3’；所述的目标检测DNA链(SEQ ID No.2)为5’-CTC TCT AAA ATC ACT-3’，其序列携带负电荷；
S2：依次利用丙酮、无水乙醇和去离子水超声清洗圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管，然后用惰性气体吹干；圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管为硅纳米线场效应管，硅纳米线场效应管是(111)型SOI硅片；
S3：在圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管的集成芯片传感部位滴加氟化氢(HF)溶液，腐蚀处理，以除去纳米线表面的氧化膜，再用乙醇、去离子水依次冲洗处理；其中，氟化氢(HF)溶液质量浓度为2～5％，腐蚀处理时间为2～10s；
S4：将S3处理后的圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管浸泡在硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液中过夜；
S5：在单链探针DNA中添加羧基活化试剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化处理；
S6：清洗浸泡处理后的圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管，用惰性气体吹干，并在纳米线表面添加单链探针DNA溶液，常温孵育；
S7：将步骤S6得到的圆片级可控纳米线阵列场效应晶体管清洗后即可得到COOH-DNA/APTES/SiNWs电极，即DNA生物传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2中清洗的时间为：丙酮10～30min，无水乙醇10～30min，去离子水10～30min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S2所述的纳米线阵列是以15×8叉指结构呈现，且纳米线尺寸大小为50～120nm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S3中乙醇、去离子水冲洗时间均为30～60s；S4中硅烷偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液的质量浓度为1～5％，其浸泡时间为10～24h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S5中单链探针DNA溶液浓度为10-7M～10-5M；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液浓度为0.2～0.8mM；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液浓度为0.8～3.2mM，且单链探针DNA与NHS溶液，EDC溶液，磷酸缓冲溶液(PBS)体积配比为4：5：5：6，且溶液活化时间为15～30min。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S6中纳米线阵列场效应晶体管清洗所使用试剂为无水乙醇溶液，清洗时间为10～60s，以除去过多残留的APTES溶液，其中孵育温度为25～37℃，孵育时间为2～5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S7中的清洗试剂为磷酸缓冲溶液(PBS)，其浓度为0.001～1mol/L，以除去未固定上的单链探针DNA。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制备而得的一种DNA生物传感器。
9.权利要求8所述的DNA生物传感器的应用，其特征在于，所述DNA生物传感器用于定量检测特定DNA，包括如下步骤：
(1)针对所要检测的特定的DNA序列，利用DNA生物传感器检测目标DNA，将DNA生物传感器连接整个检测系统中，形成流道通路；
(2)启动检测装置，设定源漏极和栅源电压，并将所述DNA生物传感器，浸泡于PBS溶液中10～30min，用数字源表检测源极和漏极之间的电流，记为基准电流；
(3)滴加定量不同浓度的目标DNA溶液于DNA生物传感器表面，于常温孵育1～3h；
(4)磷酸缓冲溶液(PBS)清洗传感器表面，以除去未结合上的多余目标DNA；同时用数字源表检测源极和漏极之间的电流变化情况。
10.权利要求9所述的DNA生物传感器的应用，其特征在于，所述(1)中，检测系统包括电压源和数字源表，通过对DNA生物传感器的源极和漏极之间施加一定的电压，以检测源极和漏极之间的电流变化；所述(2)中，源漏极施加的电压为-3V～3V，栅源极施加的电压为-3～0V；所述(3)中，不同浓度的目标DNA溶液的制备方法为：将目标DNA链用浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配比制成浓度为10-16M、10-15M、10-14M、10-13M、10-12M、10-11M、10-10M的目标检测DNA溶液，目标DNA孵育温度为25～37℃。
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