CN112986335B - 一种在芯片上固定高分子物质的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物芯片领域，公开了一种在芯片上固定高分子物质的工艺，包括芯片活化步骤、芯片成膜步骤和芯片交联步骤，所述芯片包括电极片；在芯片活化步骤中，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，得到活化后的芯片；在芯片成膜步骤中，将APTES覆盖在所述电极片上，获得成膜后的芯片。本发明能够将生物分子良好地固定在芯片上，特别是良好地固定在芯片的电极片上，以便芯片能够用于基于电学检测的生物芯片检测方法中，促进基于电学检测的生物芯片检测方法的发展。并且，本发明中同一批次生产的成品芯片的质量稳定，重复度好。

Description

一种在芯片上固定高分子物质的工艺

技术领域

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种在芯片上固定高分子物质的工艺。

背景技术

生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。狭义的生物芯片概念是指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、gDNA、多肽、抗体、抗原等）固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相材质上形成的生物分子点阵。传统的生物芯片检测方法中，目标生物分子与生物芯片上包被的对应生物分子之间的特异性结合单纯地依靠扩散运动和随机布朗运动，因此，检测时间较长。为缩短生物芯片检测的时长，提高生物芯片检测的效率，目前提出了一种基于电学检测的生物芯片检测方法，生物芯片上设有电极片，向电极片提供交流电，在反应单元内产生介电泳效应以及电热效应，加快目标生物分子与生物芯片上包被的对应生物分子的结合，缩短检测时长，提高检测效率，并通过生物芯片阻抗值的变化，表征生物芯片上是否结合目标生物分子。

虽然电学生物芯片检测方法的效率高，但由于生物芯片采用电极片作为固相材质，生物分子无法在电极片上固定良好，因此，如何将生物分子良好地固定在电极片上成为了一个难题。

发明内容

本发明意在提供一种在芯片上固定高分子物质的工艺，以解决生物分子如何固定于电极片上的问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种在芯片上固定高分子物质的工艺，包括芯片活化步骤、芯片成膜步骤和芯片交联步骤，所述芯片包括电极片；在芯片活化步骤中，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，得到活化后的芯片；在芯片成膜步骤中，将APTES覆盖在所述电极片上，获得成膜后的芯片。

本方案的原理及优点是：本方案中，由于芯片包括电极片，后续应用于基于电学的生物芯片检测方法中，因此，需要将生物分子固定在电极片上。而现有生物芯片的固相材质通常是硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等导电不良或完全不导电的物质，因此一般的生物分子固定方法不适合用于电极片。因此，本方案中，在芯片活化步骤中，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，使得芯片的电极片上修饰上羟基、酮基、羧基、氨基等基团，从而结合APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷），APTES在芯片上成膜后进行醛基化修饰，再与生物分子结合，从而将生物分子固定在芯片上，进而解决了生物分子如何固定于电极片上的问题，且将芯片包被批内差变异系数控制在11.2-13.0%范围内，使得同一批次生产的成品芯片上固定的生物分子量的差异减小，从而使得同一批次生产的成品芯片的质量更加稳定。

优选的，作为一种改进，在芯片活化步骤中，等离子清洗机的真空度为0.3-0.5mbar，功率为50-200w，清洗时长为5-15min。

有益效果：限制等离子清洗机的真空度和功率，以及清洗时长在上述范围内，能够更好地清洗芯片，并使得芯片上修饰上对应的基团，保证下步工序高效率进行。

优选的，作为一种改进，在芯片成膜步骤中，将活化后的芯片浸泡至1-10wt%APTES的乙醇溶液中，将APTES覆盖在所述电极片上。

有益效果：本方案中，APTES的浓度为1-10wt%时，芯片成膜效果更好，使得同一批次生产的成品芯片的质量更稳定。

优选的，作为一种改进，在芯片交联步骤中，将成膜后的芯片加热固化，冷却后滴加1-10wt%戊二醛纯水溶液，放置0.5-2.0h后超纯水冲洗，氮气吹干，获得交联后的芯片。

有益效果：利用戊二醛纯水溶液对成膜后的芯片进行醛基化修饰，以便后续能够结合交联对应的生物分子。

优选的，作为一种改进，在芯片活化步骤前以及在芯片交联步骤前，对芯片进行镜检：利用金相显微镜观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片。

有益效果：在芯片活化步骤前以及在芯片交联步骤前，对芯片进行镜检，从而将不合格的芯片剔除，避免做无用功。其中，判断芯片表面无粘附杂质的依据为：在电极片叉指部位没有大于0.5μm的斑点，颗粒，赃物和尘埃粒子，如有就判定为不合格。

优选的，作为一种改进，在芯片交联步骤中，固化温度为50-100℃，固化时间为30-120min。

有益效果：将芯片交联步骤中的固化温度、固化时间限制在上述范围内时，有利于后续芯片上APTES膜的醛基化修饰。

优选的，作为一种改进，在芯片交联步骤中，滴加戊二醛纯水溶液后，芯片放入保湿盒中18-25℃放置，保湿盒的湿度为40-60%。

有益效果：芯片放入湿度为40-60%的保湿盒中进行醛基化修饰，更有利于芯片上APTES膜的醛基化修饰。

优选的，作为一种改进，还包括芯片包被步骤，芯片包被步骤中，在交联后的芯片上滴加生物分子溶液，于18-25℃孵育2-24h，得到包被后的芯片。

有益效果：在芯片包被步骤中，生物分子与醛基化修饰后的芯片结合，从而将生物分子固定在芯片上。

优选的，作为一种改进，在芯片包被步骤中，生物分子溶液的溶剂为硼酸缓冲液，硼酸缓冲液的配制方法为：在0.05-0.2M硼酸溶液中加入0.0125-0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为5-8。

有益效果：在芯片包被步骤中，利用上述硼酸缓冲液作为生物分子溶液的溶剂，可有效延缓电极片的腐蚀，延长芯片的有效储存周期。

优选的，作为一种改进，在芯片成膜步骤中，浸泡时间为5-60min，浸泡后使用无水乙醇冲洗，氮气吹干。

有益效果：限定芯片浸泡在APTES溶液中的时间，避免浸泡时间过长而影响芯片的质量。同时在浸泡后使用无水乙醇冲洗芯片，缩短氮气吹干的时间。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1

一种在芯片上固定高分子物质的工艺，包括芯片活化步骤、芯片成膜步骤、芯片交联步骤和芯片包被步骤，芯片包括电极片，本实施例中的芯片选用中国专利CN104965081B、专利名称为“基于移动设备的抗体抗原检测方法”中的反应单元，反应单元包括一个顶部开口的反应腔，反应腔底部设置有一块检测板，检测板上铺设有至少一对电极片，电极片的接线端穿过并固定在反应腔和盒体上。本实施例中，铺设有电极片的检测板的结构可以参见发明人在先发表论文（Development of an AC electrokinetics-based immunoassaysystem for on-site serodiagnosis of infectious diseases，Xiaozhu Liu，Sensorsand Actuators A， 171 (2011) 406–413，Fig. 3.（b））。通常反应腔和检测板为硅制材料（si），电极片均为金属材质（铝、金或铜，本实施为铝材质）。

1）预处理步骤

芯片活化步骤前，对芯片进行第一次镜检，利用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片，剔除不合格芯片。过程中，判断芯片表面无粘附杂质的依据为：在电极片叉指部位（即电极片之间的间隙）没有大于0.5μm的斑点、颗粒、赃物和尘埃粒子，如有就判定为不合格。

2）芯片活化步骤

使用空气作为清洗介质，利用现有技术中的等离子清洗机对芯片进行等离子清洗，其中，等离子清洗机的真空度为0.5mbar（可选择范围0.3-0.5mbar），功率为50w（可选择范围50-200w），清洗时长为10min（可选择范围5-15min），得到活化后的芯片。该步骤的目的是对芯片表面进行表面清洗和修饰，使用空气中氧气，通过氧化反应，在表面生成-OH、-C=O、-COOH等基团；并使用空气中氮气，在芯片表面生成-NH₂基团。

3）芯片成膜步骤

将活化后的芯片全部浸泡（芯片的接线除外）至10wt%APTES的乙醇溶液中（将APTES溶于无水乙醇中，APTES的质量分数为10%，APTES即为3-氨丙基三乙氧基硅烷），常温（常温指18-25℃）浸泡30min（可选择范围5-60min），然后使用无水乙醇冲洗每片芯片30s，然后氮气吹干，获得成膜后的芯片。

对成膜后的芯片进行第二次镜检，利用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，取断条、无连条、无粘附杂质的芯片，剔除不合格芯片。过程中，判断芯片表面无粘附杂质的依据同第一次镜检。

4）芯片交联步骤

将成膜后的芯片加热固化，固化温度为63℃（可选择范围50-100℃），固化时间为60min（可选择范围30-120min）。自然冷却后，向芯片的反应腔滴加10μL 2.5wt%戊二醛溶液（纯水配制），戊二醛溶液覆盖电极片，再将芯片放入保湿盒中22℃（可选择范围18-25℃）下放置1h（可选择范围0.5-2.0h），保湿盒的湿度为40%（可选择范围40-60%）。然后，超纯水冲洗芯片10s，氮气吹干，获得交联后的芯片。

5）芯片包被步骤

在交联后的芯片上滴加生物分子溶液，于22℃（可选择范围18-25℃）孵育20h（可选择范围2-24h），得到包被后的芯片。本实施例中，在交联后的芯片上滴加10μL 10μg/mL商业化的布鲁氏omp抗原，其中，使用硼酸缓冲液（BBS）作为溶剂分散和溶解上述抗原，硼酸缓冲液的配制方法为：在0.05-0.2M硼酸溶液中加入0.0125-0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为5-8。本实施例中，硼酸缓冲液（即100mM BBS）的配制方法为：在0.1M硼酸溶液中加入0.025四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。需要说明的是，本实施例中，可根据实际需要检测的生物分子的情况，选择不同的抗原。

在芯片包被步骤中，芯片孵育5min后，使用阻抗仪对芯片进行阻抗检测，具体地，使用组抗议连接于电极片的接线端进行阻抗频率扫描测量和分析，扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV-100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被前阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，如阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。

在包被前阻抗扫描结束后，将芯片放在保湿盒中，于22℃（可选择范围18-25℃）孵育20h（可选择范围2-24h），获得包被后的芯片。包被结束后，从保湿盒中取出芯片，然后用阻抗仪对包被后的芯片进行阻抗检测，同样地，扫描频率范围为1MHz到100Hz，激励电压为5mV（可选择范围1mV-100mV），采样点数201点，测量时间为3s，保存各芯片阻抗频率扫描数据（称为包被后阻抗扫描，获得在不同扫描频率下的电极片各响应参数，如阻抗、相位、电阻分量、电容分量、电感分量等，作图获得包被前上述参数随频率变化的曲线）。

对比包被前阻抗扫描和包被后阻抗扫描结果，判定芯片是否合格，判定方法为：在上述阻抗扫描频率下，计算包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，具体计算方法为：电容变化率=（包被后扫描的电容值-包被前扫描的电容值）/包被前扫描的电容值×100%。电容变化率需控制在-50.0～150.0%范围内，不在此范围内的芯片为不合格芯片，需要丢弃。特定阻抗扫描频率是通过包被前电容随频率变化的曲线和包被后电容随频率变化的曲线来确认的，具体的确认方法为：计算获得包被前扫描和包被后扫描的同一频率下的电容变化率，电容变化率最大值（在此处若该值为负数，则取其绝对值）所对应的扫描频率值即为特定阻抗扫描频率。在本实施例中，具体是在频率50KHz（即特定阻抗扫描频率）下计算电容变化率，并控制特定阻抗扫描频率下的电容变化率在60.0～100.0%范围内，其中，特定阻抗扫描频率下的电容变化率又称为扫描前后最大电容变化率。由于芯片批次以及包被的生物分子不一样会使得特定阻抗扫描频率存在差异，所以需要在包被前后进行阻抗扫描，获得特定阻抗扫描频率，在该特定阻抗扫描频率下的电容变化率需要维持在一定范围内，才能保证成品芯片的合格率。

接下来用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第三次镜检），判断方法同第一次镜检。

6）封闭与干燥

每片包被后的芯片用200μL移液器加入20μL的100mM BBS,然后用氮气吹干，重复1次。每片芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第四次镜检），判断方法同第一次镜检。用10μL移液器滴加10μL 10%牛血清白蛋白封闭液（溶剂为 100mM BBS)，于室温中封闭0.5h。每片芯片用200μL移液器加入20μL 100nM BBS,然后用氨气吹干，重复1次，获得成品芯片。

每片成品芯片用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面，拍照记录每片芯片的表面状况，如果表面损伤或者污染特别严重，则舍弃该芯片（称为第五次镜检），判断方法同第一次镜检。

实施例2-实施例4、对比例1-对比例4基本同实施例1，不同点如表1所示。表1中，对比例3中的“N/A”表示未进行芯片活化步骤，对比例4中的“N/A”表示未进行芯片成膜步骤。

表1 各实施例与各对比例中工艺步骤和参数的设置

	芯片活化步骤中介质选择	APTES浓度（%）
			实施例1	压缩空气	10
实施例2	压缩空气	5
			实施例3	压缩空气	1
实施例4	压缩空气	15
			对比例1	氮气	10
对比例2	氧气	10
			对比例3	N/A	10
对比例4	压缩空气	N/A

实验一

对于实施例1-实施例4以及对比例1-对比例4，每个实施例和每个对比例中，选取成品芯片20片，在每片芯片的特定阻抗扫描频率下，计算每片芯片包被后扫描获得的电容值与包被前扫描获得的电容值的变化率，继而计算得到每个实施例和对比例中，芯片的电容变化率的平均值和标准差，计算得到每个实施例和对比例的芯片包被批内差变异系数CV，芯片包被批内差变异系数CV的计算公式为：变异系数（CV）＝（标准差SD/平均值X）100％。各实施例和各对比例中，芯片包被批内差变异系数如表2所示。

表2 各实施例和各对比例的芯片包被批内差变异系数

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	对比例1	对比例2	对比例3	对比例4
									芯片包被批内差变异系数CV（%）	11.2	12.4	13.0	17.5	27.4	22.3	32.8	58.4%

由表2可知，实施例1的芯片包被批内差变异系数CV仅为11.2%，与对比例4的芯片包被批内差变异系数相比，可知，在芯片上形成APTES膜明显有助于生物分子稳定地固定在芯片上，且生物分子不易脱落，从而使得同一批次生产的成品芯片上固定的生物分子量更趋于相同，保证同一批次生产的成品芯片的质量的稳定性。

将实施例1与对比例3的芯片包被批内差变异系数相比，可知，未进行芯片活化步骤而制得的成品芯片，即使是同一批次内生产的，其上固定的生物分子量差异较大，导致同一批次生产的成品芯片的质量不稳定。

将实施例1至实施例4与对比例1、对比例2相比，实施例1至实施例4的芯片包被批内差变异系数均小于对比例1和对比例2，这说明，在芯片活化步骤中，对于清洗介质的选择，将会影响后续的芯片加工步骤。本发明中，选择空气作为清洗介质时，能够有效减小芯片包被批内差，提高成品芯片的质量的稳定性。

而将实施例1至实施例4作内部比较，不难发现，芯片成膜步骤中，APTES的浓度也会对芯片包被批内差变异系数造成影响，经实验发现，APTES的浓度在1-10wt%范围内时，芯片包被批内差变异系数在11.2-13.0%范围内，芯片包被批内差变异系数较小，成品芯片的质量的稳定性较好。

综上所述，本发明中，使用空气作为等离子清洗的清洗介质，并在芯片上形成APTES膜，且将芯片成膜步骤中的APTES的浓度限制在1-10wt%范围内，减小芯片包被批内差变异系数，使得同批批次内生产的成品芯片上固定的生物分子量更趋于相同，提高同一批次内成品芯片的质量的稳定性，从而使得同一批次内的成品芯片的重复度好。

实验二

实施例5-实施例10以及对比例5-对比例8基本同实施例1，不同点在于“5）芯片包被步骤”以及“6）封闭与干燥”中选择的缓冲液不同，具体不同点见表3。并且，将实施例5-实施例10以及对比例5-对比例8中制备的成品芯片置于干燥密封袋中（每个实施例和对比例中均使用10片成品芯片，均独自包装于干燥密封袋中），每日使用金相显微镜在10倍目镜下观察芯片表面（主要是电极片），判断电极片是否出现腐蚀现象，如果出现，记载该现象出现的日期，并统计抗腐蚀时长，结果见表3。

表3 抗腐蚀时长测试结果（mean±SD，N=10）

	测试缓冲液类型	测试缓冲液配制方法	抗锈蚀时长（天）
				实施例1	BBS	参见实施例1	67.20±3.91
实施例5	BBS	在0.05M硼酸溶液中加入0.0125M四硼酸钠溶液，直至pH值为5.0	63.10±3.60
				实施例6	BBS	在0.2M硼酸溶液中加入0.05M四硼酸钠溶液，直至pH值为8.0	62.90±3.70
实施例7	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为9	N/A
				实施例8	BBS	在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为4	N/A
实施例9	BBS	在0.3M硼酸溶液中加入0.1M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	55.20±2.70*
				实施例10	BBS	在0.02M硼酸溶液中加入0.005M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4	52.70±3.13*
对比例5	PBS	参见PBS配方（pH7.4）	N/A
				对比例6	碳酸缓冲液	在0.1M碳酸氢钠溶液中滴加0.1M碳酸钠溶液，直至pH值为9.0。	N/A
对比例7	硼酸溶液	0.1M硼酸溶液	N/A
				对比例8	四硼酸钠溶液	0.025M四硼酸钠溶液	N/A

1L表3中的PBS（pH7.4）的配制方法：磷酸二氢钾0.24g；磷酸氢二钠1.44g；氯化钠8g；氯化钾0.2g；加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。

表3中，*表示该实验组与实施例1的数据相比具有显著差异（T检验，p＜0.05）。N/A表示在芯片加工过程中电极片已经大量发生腐蚀（通过镜检发现），属于不合格芯片，使用实施例7、实施例8和对比例5至对比例8的缓冲液（溶液），不能有效获得合格的成品芯片。

由表3可知，采用本方案的硼酸缓冲液制备的成品芯片，可获得较长的保质期，但是如果硼酸缓冲液中的硼酸或者四硼酸钠的浓度过高或者过低，缓冲液的pH值过高或者过低，都不利于抗氧化膜的形成，获得的成品芯片的抗腐蚀效果差。如果换用其他缓冲液或者是单用硼酸溶液或者是单用四硼酸钠溶液，均不能获得理想的抗腐蚀效果。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (5)

1.一种在芯片上固定高分子物质的工艺，其特征在于：包括芯片活化步骤、芯片成膜步骤、芯片交联步骤和芯片包被步骤，所述芯片包括电极片；在芯片活化步骤中，使用空气作为介质对芯片进行等离子清洗，得到活化后的芯片；在芯片成膜步骤中，将活化后的芯片浸泡至1-10wt%APTES的乙醇溶液中，将APTES覆盖在所述电极片上，获得成膜后的芯片；所述电极片为铝材质；

在芯片活化步骤中，等离子清洗机的真空度为0.3-0.5mbar，功率为50-200w，清洗时长为5-15min；在芯片交联步骤中，将成膜后的芯片加热固化，冷却后滴加1-10wt%戊二醛纯水溶液，放置0.5-2.0h后超纯水冲洗，氮气吹干，获得交联后的芯片；在芯片包被步骤中，在交联后的芯片上滴加生物分子溶液，于18-25℃孵育2-24h，得到包被后的芯片；生物分子溶液的溶剂为硼酸缓冲液，硼酸缓冲液的配制方法为：在0.1M硼酸溶液中加入0.025M四硼酸钠溶液，直至pH值为7.4。

2.根据权利要求1所述的在芯片上固定高分子物质的工艺，其特征在于：在芯片活化步骤前以及在芯片交联步骤前，对芯片进行镜检：利用金相显微镜观察芯片表面，取无断条、无连条、无粘附杂质的芯片。

3.根据权利要求2所述的在芯片上固定高分子物质的工艺，其特征在于：在芯片交联步骤中，固化温度为50-100℃，固化时间为30-120min。

4.根据权利要求3所述的在芯片上固定高分子物质的工艺，其特征在于：在芯片交联步骤中，滴加戊二醛纯水溶液后，芯片放入保湿盒中18-25℃放置，保湿盒的湿度为40-60%。

5.根据权利要求4所述的在芯片上固定高分子物质的工艺，其特征在于：在芯片成膜步骤中，浸泡时间为5-60min，浸泡后使用无水乙醇冲洗，氮气吹干。