CN111443072B - 病毒检测用拉曼芯片、制备方法、及病毒快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种病毒检测用拉曼芯片、制造方法、以及病毒快速检测方法，其中，病毒检测用拉曼芯片包括：硅片基底；金属增强层，所述金属增强层形成于所述硅片基底表面；修饰层，所述修饰层形成于所述金属增强层表面，其中，所述修饰层含有待检测病毒的受体蛋白或抗体。采用根据本发明的病毒检测用拉曼芯片，在其上添加待测试样本后通过拉曼光谱仪进行检测，通过对得到的拉曼光谱数据进行分析，能够快速分析该样本中是否含有待检测病毒。
Description
技术领域
本发明涉及拉曼光谱检测技术和纳米材料技术领域，具体涉及一种病毒检测用拉曼芯片、制备方法、以及病毒快速检测方法。
背景技术
病毒往往具有感染力强、传播快、感染后潜伏期短、发病急等特点，因此，新型致病性病毒在人群中传染时，病毒的快速检测工作尤为重要。同时，由于病毒本身的这些致病特性，为了更好的制定病毒防疫消杀措施，其检测范围不仅包括受病毒侵染的人体，还包括针对医院病房、医疗废弃物、废水以及空气等易受病毒污染环境介质的检测。
目前用于病毒检测的常用技术方法，主要包括RT-PCR和ELISA测定法，这些检测技术都是基于病毒的基因序列(RNA)或者特定蛋白生物标志物(抗体)进行检测，其特异性强且敏感度高。但是这些检测技术也存在很大的缺点和局限性：
1)这些技术均需要相对复杂的样本前处理，包括病毒样本的采集、运输、预处理以及核酸提取等步骤，最后利用试剂盒的特异性探针(或抗体)结合后进行样本中病毒的测定；
2)通常RT-PCR技术的假阳性比较高，而ELISA所检测抗体的变化有可能是其他疾病导致的假阳性；
3)这些检测技术操作复杂，并且技术本身依赖于昂贵的试剂盒、检测仪器和专业技术人员的操作；
4)受限于检测的仪器和操作环境要求，这些技术都难以实现快速便捷化部署应用，同时也无法实现环境多介质的检测，特别是ELISA。同时，利用高通量测序技术检测病毒，在复杂的环境样品中提取所有的DNA或者RNA，进行测序，建库比对，分析存在的病毒，周期一般需要1～2周。
因此，亟需开发一种可应对多种场景介质的人类感染病毒快速检测技术，尤其需要满足在医疗废弃物、废水等环境介质中的检测应用需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于实现病毒快速检测的病毒检测用拉曼芯片、其制造方法、以及病毒快速检测方法。
拉曼光谱和红外光谱一样同属于分子振动光谱，可以反映分子的特征结构。但是拉曼散射效应是个非常弱的过程，其散射光强度约为入射光强度的10-6～10-9，极大地限制了拉曼光谱的应用和发展。研究发现，吸附在粗糙金银表面的分子的拉曼信号强度得到很大程度的提高，将这种与银、金、铜等粗糙表面相关的增强效应称为表面增强拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering,SERS)效应，对应的光谱称为表面增强拉曼光谱。当SERS芯片上形成有粗糙表面的纳米结构的贵金属层，待测物吸附于该贵金属层表面，构成SERS活性位点，在激发光作用下，SERS基底产生的表面等离激元共振，极大的增强了待检物的拉曼信号。通常导致吸附在SERS芯片上的待测物分子拉曼信号比未吸附时的分子拉曼信号增强约104～107倍。在此基础上SERS技术得到迅速发展，在分析科学、表面科学以及生物科学等领域得到广泛应用。
另一方面，自然界常见的已知可感染人类的病毒有很多种，多数病毒是通过被结合细胞表面的特定受体蛋白侵入细胞内部，例如：流行性乙型脑炎病毒是通过受体热休克蛋白90β，介导侵入细胞的；H1N1病毒能够结合JAM-A，并通过其相关的黏附分子通路来感染肺泡细胞；SARS病毒和新冠病毒则是通过受体-人血管紧张素转换酶2(ACE2)进行入侵感染的。
本发明人经反复研究发现，在表面增强型拉曼芯片表面，修饰这类待检测病毒的受体蛋白或抗体，此后将待测试样本添加在修饰后的拉曼芯片上，通过检测拉曼光谱信号，能够快速检测该待测试样本中是否含有待检测病毒。并在此基础上完成了本发明。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
根据本发明第一方面实施例的病毒检测用拉曼芯片，用于人类感染病毒快速检测，其特征在于，包括：硅片基底；金属增强层，所述金属增强层形成于所述硅片基底表面；修饰层，所述修饰层形成于所述金属增强层表面，其中，所述修饰层含有待检测病毒的受体蛋白或抗体。
进一步地，所述金属增强层中含有金、银、铜、铂、钌、铑、钯、锇、铱、及其混合物的任一种。
进一步地，所述待检测病毒包括SARS病毒、SARS-CoV-2病毒、HIV病毒、流行性乙型脑炎病毒、流感病毒中的任一种。根据本发明提供的检测方法，不仅限于检测上述病毒，还可以包括任何能够与被结合细胞表面的特定受体蛋白有一定结合性的病毒，均可以通过该方法进行检测。其中，尤其适用于传染性病毒例如SARS病毒、SARS-CoV-2病毒、HIV病毒、流行性乙型脑炎病毒、流感病毒进行快速检测。
进一步地，所述受体蛋白包括ACE2受体蛋白、表面抗原分化簇4受体、热休克蛋白90β受体、连接黏附分子JAM-A蛋白中的任一种。
根据本发明第二方面实施例的病毒检测用拉曼芯片的制备方法，包括如下步骤：
提供表面增强型拉曼芯片，所述表面增强型拉曼芯片包括硅片基底以及形成于所述硅片基底表面的金属增强层；
在所述表面增强型拉曼芯片的金属增强层表面形成修饰层，所述修饰层含有待检测病毒的受体蛋白或抗体以形成修饰层，得到所述病毒检测用拉曼芯片。
进一步地，所述金属增强层中含有金、银、铜、铂、钌、铑、钯、锇、铱、及其混合物的任一种，所述金属增强层通过溅射法沉积在所述硅片基底表面。
进一步地，所述表面增强型拉曼芯片通过如下方法制备：提供硅片基底；通过溅射法，在所述硅片基底表面沉积所述金属增强层。也就是说，作为修饰病毒受体蛋白或抗体用的表面增强型拉曼芯片，既可以入手市售品，也可以通过上述方法自行制备。
进一步地，所述在所述金属增强层表面修饰待检测病毒的受体蛋白或抗体以形成修饰层包括：将待检测病毒的受体蛋白或抗体使用缓冲溶液配制成修饰液；在所述金属增强层表面添加预定量的所述修饰液；在添加所述修饰液后，将其置于恒温恒湿的孵育箱中孵育1-6小时，在所述金属增强层表面形成所述修饰层。其中，具体的修饰添加方法，例如可以通过滴加法、旋涂法、浸渍法等实现。此外，具体的孵育条件，也可以根据所修饰的受体蛋白或抗体进行适当调整。
进一步地，所述缓冲溶液为硼酸盐标准缓冲溶液、碳酸盐标准缓冲溶液、醋酸盐标准缓冲溶液中的任一种。需要说明的是，所用缓冲溶液也不仅限于上述缓冲溶液，可以使用医学上允许的任意缓冲溶液。
进一步地，所述修饰液中，所述待修饰的受体蛋白或抗体的浓度为0.05-1mg/ml。根据具体的分析方法、所分析的病毒与抗体的反应活性、分析精度要求不同、所测试样本不同(例如环境样本还是人体取样样本)等，可以适当调整所述修饰液中待修饰的受体蛋白或抗体的浓度。
进一步地，在所述金属增强层表面添加0.5-10μl的所述修饰液。根据修饰液浓度不同，以及具体的分析方法、所分析的病毒与抗体的反应活性、分析精度要求不同、所测试样本不同(例如环境样本还是人体取样样本)等，可以适当调整添加量。
根据本发明第三方面的病毒快速检测方法，包括如下步骤：
提供上述根据本发明第一方面任一项所述的病毒检测用拉曼芯片；
在所述病毒检测用拉曼芯片上，滴加待测试样本；
将含有待测试样本的病毒检测用拉曼芯片以及空白的所述病毒检测用拉曼芯片，分别通过拉曼光谱仪测定其拉曼光谱；
分析测定所得的拉曼光谱，确定所述待测试样本是否含有所述待检测病毒。
进一步地，对于每个待测试的、含有待测试样本的所述病毒检测用拉曼芯片以及空白的病毒检测用拉曼芯片，分别采集多个位点的拉曼光谱信号，每个位点进行多次扫描，以获得其拉曼光谱。对于检测得到的多个位点的多次扫描结果，例如，可以删除其中最大值和最小值，对其余求平均值，以该平均值作为最终分析用拉曼光谱。由此，能够避免某些位点信号异常导致的偏差等。当然，也可以考虑各个位点的特征，设定不同的权重，在此基础上求和。
进一步地，所述分析测定所得的拉曼光谱包括：分析拉曼光谱的峰值变化、峰的位置变化、以及基于有效区段的整谱数据分析中的一种或多种。可以综合考虑拉曼光谱的峰值变化、峰的位置变化、以及基于有效区段的整谱数据分析来分析检测得到的拉曼光谱。其中，作为拉曼光谱有效区段的整谱数据分析有多种，包括定性分析和定量分析，其中，定性分析方法又包括K-近邻法(K-Nearest Neighbor Method，KNN)、PCA类中心最小距离法、光谱相似度匹配、簇类的独立软模式法(SIMCA)、支持向量机(Support Vector Machine,SVM)、线性判别分析(LDA)、贝叶斯判别法、有监督人工神经网络、偏最小二乘判别分析(Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)、高斯混合判别分析(Gaussian Mixture Discriminant Analysis，GMDA)、基于分类回归树(ClassificationAnd Regression Tree，CART)的随机森林(Random Forests，RF)方法等。为了得到最佳分类效果,不同的检测体系往往需要不同的分类器。作为定量分析方法，可以通过分析己知光谱信息与待测属性间的内在联系,建立适当的校正模型,从而预测待测样品的相关属性。
进一步地，所述对于测定所得的拉曼光谱，分析其峰值变化、峰的位置变化以及基于有效区段的整谱数据分析包括：对于所测定得到的所述拉曼光谱的数据进行预处理；对预处理后的所述拉曼光谱的数据，截取900-1800cm-1波段的数据进行分析，当确定含有待测试样本的所述病毒检测用拉曼芯片与空白的所述病毒检测用拉曼芯片的拉曼光谱的差异满足预设条件时，确定所述待测试样本中含有所述待检测病毒。通过预处理，可以去除噪点、使其平滑化，通过截取有效波段进行分析，可以降低干扰等。此外，例如，分析峰值变化时，例如，以峰值变化30％为阈值，当超过30％时认为存在明显差异，可以考虑测试样本中含有待检测病毒。
本发明的上述技术方案至少具有如下有益效果之一：
根据本发明实施例的病毒快速检测方法，通过在SERS拉曼芯片表面修饰人类感染病毒受体蛋白或者抗体，对病毒进行特异性捕获，利用SERS技术所具有的灵敏度高、快速和无损等优势，能通过信号的高增益，实现快速高灵敏度的病毒检测。同时结合使用SERS拉曼光谱数据的分析方法，可以有效实现SERS芯片检测结果的快速准确分析。此外，本发明中的病毒快速检测技术还具有以下优势：1)样本预处理简单，无需额外的核酸或者蛋白提取步骤；2)检测方法快速、灵敏度高，可以快速出结果；3)仪器操作简便、可靠，不需要专业培训，并且易于实现便携化，方便现场操作；4)适用范围广，可以用于各种人体样本和环境介质的检测。
附图说明
图1为本发明实施例2中检测得到的拉曼光谱图；
图2为本发明实施例3中检测得到的拉曼光谱图；
图3为本发明实施例3中检测得到的拉曼光谱数据的PCA-LDA分类图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面，结合具体实施例进一步详细描述根据本发明的病毒检测用拉曼芯片、其制造方法、以及病毒检测方法。
实施例1 SARS-CoV-2检测用芯片—ACE2蛋白修饰芯片的制备
一、SERS芯片的制备
a.在干净干燥的容器中加入10～15ml浓盐酸，将硅片放入浓盐酸中，超声清洗30min；
b.将硅片取出，依次用去离子水和酒精反复冲洗，直至表面无残留，并烘干；
c.将清洗干净的硅片放入等离子溅射仪中，在惰性气体保护下，以高纯度贵金属(贵金属可以选用金、银、铂、钌、铑、钯、锇或铱)为靶材，本实施例中，使用金属银为靶材，采用间歇式溅射方式将金属银沉积到硅片上，使其在硅片表面垂直生长出一层银纳米棒阵列；
d.将制备完成的整块硅片，切割成合适的大小备用。本实施例中切割成5mm×5mm的SERS芯片，并将SERS芯片固定在载玻片，方便使用。
二、ACE2蛋白修饰
接下来，针对制备的SERS芯片，使用病毒受体蛋白进行修饰，以达到特异性捕获病毒的目的。本实施例中，针对新冠病毒SARS-CoV-2，使用ACE2蛋白作为受体蛋白进行表面修饰。
a.使用pH为7.2的硼酸盐标准缓冲溶液，将ACE2蛋白配制成浓度为0.15mg/ml的蛋白溶液；
b.上述步骤一得到的SERS芯片在使用前，先用去离子水冲洗，去除表面灰尘等杂质，使用氮吹干，备用；
c.取上述配置的1μl ACE2蛋白溶液，滴加于SERS芯片上，并置于恒温恒湿条件下培养箱中孵育4h，使得ACE2修饰在SERS芯片表面，得到ACE2修饰芯片。
接下来，使用上述制备得到的ACE2蛋白修饰芯片进行SARS-CoV-2病毒检测。为此，分别使用上述实施例1制备得到的ACE2蛋白修饰芯片，进行新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白(Spike protein)的检测、环境样品中新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)的检测。
实施例2 ACE2修饰芯片对新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白(Spikeprotein)的检测
本实施例中，针对上述得到的ACE2修饰芯片，使用实验室分离获得的新冠病毒表面S蛋白(新冠病毒与细胞表面ACE2受体的结合蛋白)，进行SARS-CoV-2病毒检测测试。
检测使用的拉曼光谱仪，激光器波长选择范围：可见光以及近红外范围内的激发光源(例如：商业化常用拉曼光源包括488、532、633、785以及1064nm波长激光器等)，拉曼光谱采集范围设置为0-4000cm-1。
本实施例中，该步骤采用Horiba HR evolution 785nm激发波长的拉曼光谱仪进行检测，在0-4000cm-1波长范围内采集拉曼光谱，采集信号时间为7s。
具体的检测方法，包括如下步骤：
a.S蛋白使用缓冲溶液稀配置成约0.15mg/ml的溶液，分别取1μl滴加在SERS芯片(即实施例1中步骤一得到的芯片)以及ACE2修饰芯片(即实施例1中步骤二得到的芯片)表面，在恒温恒湿箱中孵育5min。
b.对ACE2修饰芯片、滴加S蛋白的SERS芯片、滴加S蛋白的ACE2修饰芯片，使用去离子水，轻轻冲洗一次。
c.使用拉曼光谱仪进行检测。
拉曼检测的样本包括：1)ACE2修饰芯片；2)滴加S蛋白的SERS芯片；3)滴加S蛋白的ACE2修饰芯片。
单个样本，采集3个位点以上的拉曼光谱信号，每个位点进行3次以上的扫描。
本实施例中，通过初步分析，根据实际样本信息，选取拉曼检测获取900-1800cm-1范围的数据进行进一步比对分析，如图1和表1所示，三种样本的拉曼光谱信号在多个拉曼峰处存在明显差异，由此说明，ACE2修饰芯片(即ACE2修饰SERS芯片)可以有效捕获识别新冠病毒SARS-CoV-2的S蛋白，使用该ACE2修饰芯片可以实现新冠病毒SARS-CoV-2的有效检测。
上述结果说明本发明实例制备的表面增强拉曼病毒检测芯片具有高可靠性。
表1实施例2中病毒SARS-CoV-2的S蛋白验证检测中的谱图差异
其中，表1中，S蛋白表示滴加S蛋白的SERS芯片的拉曼光谱；S蛋白@ACE2S表示滴加了S蛋白的ACE2修饰芯片的拉曼光谱；ACE2表示ACE2修饰芯片的拉曼光谱。
实施例3 ACE2修饰芯片对环境样品中新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)的检测
本实施例中，针对环境中采集的实际病毒样本，采用785nm激发波长的便携式拉曼光谱仪进行检测，在0-4000cm-1波长范围内采集拉曼光谱，信号采集时间为7s。
具体的检测方法，包括如下步骤：
a.环境中采集实际含SARS-CoV-2病毒环境样本，使用缓冲溶液配置成约0.2mg/ml的溶液，分别取0.5-1μl滴加在SERS芯片(即实施例1中步骤一得到的芯片)以及ACE2修饰芯片(即实施例1中步骤二得到的芯片)表面，在恒温恒湿箱中孵育5min。
b.对ACE2修饰芯片、滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的SERS芯片、滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰芯片，使用去离子水，轻轻冲洗一次。
c.使用拉曼光谱仪进行检测。
拉曼检测的样本包括：1)ACE2修饰芯片；2)滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的SERS芯片；3)滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰芯片。
单个样本，采集3个位点以上的拉曼光谱信号，每个位点进行3次以上的扫描。
本实施例中，完成实际样本检测后，对获取的拉曼数据进行分析，包括以下步骤：
a.对检测获取的数据，进行背景扣除、基线校正等光谱数据预处理操作；
b.对预处理后的数据，截取900-1800cm-1波段的数据(如图2所示)；
c.对于上述波段的数据进行分析，确认了空白的ACE2修饰芯片和滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰芯片的拉曼光谱峰位存在明显差异，如图2和表2所示，在以下拉曼光谱特征峰出有显著差异：1030、1040、1080、1182、1189、1447、1527以及1584cm-1。
表2实施例3中SARS-CoV-2验证检测中的谱图差异
备注：↓表示峰强降低；↑表示峰强增强；-表示峰猝灭(消失)
其中，SARS-CoV-2@ACE2表示滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰芯片，ACE2表示ACE2修饰芯片。
d.对于有效区段的整谱数据进行分析：PCA-LDA数据降维聚类分析。
分析结果示于图3。由图3可知，空白的ACE2修饰芯片和滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰芯片的拉曼光谱的PCA-LDA数据也存在显著区别。
上述表2、图2、图3结果均说明了，本发明的基于ACE2修饰的SERS芯片的病毒检测技术，可以实现环境多介质中新型冠状肺炎病毒(SARS-CoV-2)的高灵敏度、特异性快速检测。
Claims (1)
1.一种环境样品中SARS-CoV-2病毒的检测方法，基于SERS芯片和ACE2修饰的SERS芯片进行检测，所述ACE2修饰的SERS芯片通过对SERS芯片进行ACE2蛋白修饰得到，所述ACE2修饰的SERS芯片包括：硅片基底；金属增强层，所述金属增强层形成于所述硅片基底表面；修饰层，所述修饰层形成于所述金属增强层表面，其中，所述修饰层含有受体蛋白ACE2；所述金属增强层中含有金、银、铜、铂、钌、铑、钯、锇、铱、及其混合物的任一种，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤:
a.环境中采集实际含SARS-CoV-2病毒环境样本，使用缓冲溶液配置成0.2mg/ml的溶液，分别取0.5-1μl所述溶液滴加在SERS芯片以及ACE2修饰的SERS芯片表面，在恒温恒湿箱中孵育5min；
b.对ACE2修饰的SERS芯片、滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的SERS芯片、滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰的SERS芯片，使用去离子水，轻轻冲洗一次；
c.使用拉曼光谱仪进行检测：
其中，拉曼检测的样本包括：1)ACE2修饰的SERS芯片；2)滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的SERS芯片；3)滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰的SERS芯片；
每个样本采集3个位点以上的拉曼光谱信号，每个位点进行3次以上的扫描；
完成样本检测后，对获取的拉曼数据进行分析，具体包括：对检测获取的数据，进行光谱数据预处理操作，所述光谱数据预处理操作包括背景扣除和基线校正；对预处理后的数据，截取900-1800cm-1波段的数据；对于上述波段的数据进行分析，确认空白的ACE2修饰SERS芯片和滴加含SARS-CoV-2病毒环境样本的ACE2修饰SERS芯片的拉曼光谱峰位在以下拉曼光谱特征峰有显著差异：1030 cm-1、1040 cm-1、1080 cm-1、1182 cm-1、1189 cm-1、1447cm-1、1527 cm-1以及1584cm-1。
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