JP2012502282A - 試料中の個々のウイルスを同定するための方法 - Google Patents

試料中の個々のウイルスを同定するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明の課題は任意の試料中の個々のウイルスを迅速に、曖昧さ無く、高い信頼性で同定することにあり、調製や技術に関連る費用を可能な限り少なくし、抗体を利用した固定化を必要とせず、存在する可能性のあるウイルスの存在を示すものや少なくとも存在の疑いを示すものを必要とすることなく同定することにある。本発明に従えば、試料の高さプロファイルをスキャンニングにより得て、その結果からウイルスの存在が疑われるスキャン場所を選択し、選択された場所を単色励起光で照射し、発生するラマン散乱光に対して分光分析する。
【選択図】図１

Description

本発明は試料中の任意の個々のウイルスを少ない労力で、迅速に且つ高い信頼性で同定するための方法に関する。
本発明に係る方法は、任意の（固体、液体又は気体）試料中の個々のウイルスを検出することを目的とする。本発明によれば、時間と材料コストが掛かる試料調製を行うことなくウイルス又はバクテリオファージ種が正確に同定される。本発明によれば、試料中のウイルス粒子の種類と組成に関して信頼できる情報が得られ、その結果ウイルス粒子を正確且つ曖昧さ無く同定することが可能となる。本方法は、ウイルスに侵される細胞や個々のウイルスの種類にかかわらずに全てのウイルスに対して広範に適用できる。本方法はウイルスの存在場所に係わらずウイルスが決定できることから、多くの分野（例えば、植物中のタバコモザイクウイルスの検出、空気中のウイルス粒子の検出、バイオテクノロジー生産におけるウイルス及びバクテリオファージの検出等）に応用される。
ウイルスによる汚染の最も古い検出方法は、感染試験であると考えられている。感染試験においては、バクテリア培養物又は細胞培養物をウイルスに汚染された材料で感染させる。次に特定の培養期間を経て、細胞培養物又はバクテリア培養物中の視覚的に検知できる変化（溶解スキーム）によりウイルス感染を検出する。しかし、この検出方法は相当な時間を要し、しかも、一般的なウイルス試験は可能であるとはいえ、ウイルス種を正確に特定することまではできない。また、ウイルス感染によって侵された宿主細胞は必ずしも溶解するとは限らない。この理由は、選択した試験条件がウイルス増殖にとって適切でないか、或いはウイルス増殖を阻害してしまうことがあり、また、ウイルスがいわゆる溶原サイクルの状態にあって、ウイルス又はファージのＤＮＡが宿主細胞のＤＮＡに組み込まれ、実際にウイルス感染があるにもかかわらず、溶解スキームを形成するに至らないためと考えられる。この場合、ウイルス感染は検出もされず、決定もできない。
これらの問題点を克服するために、今日では他の分子生物学的手法がウイルス及びバクテリオファージを検出するルーチン的方法としてよく利用される。このように利用される検出方法としては、ＥＬＩＳＡ（例えばＳ．Ｓ．ニールセン、Ｎ．トフト「パラ結核死亡前診断：ＥＬＩＳＡ、インターフェロンγアッセイ及び糞便培養技術の精度に関するレビユー」ヴェテリナリー・ミクロバイオロジー２００８年、１２９巻、２１７〜２３５ページ）、又はＰＣＲ（Ｓ．アンチノリ、Ｓ．カラッチーニ、Ｅ．ロンギ、Ｇ．ベステッティ、Ｒ．ピオリーニ、Ｃ．マーニ、Ｇ．オルランド、Ｍ．グラミッチア、Ｖ．アクアヴィヴァ、Ａ．フォスキ、Ｓ．コルヴァスチェ、Ｃ．コロンバ、Ｌ．チトーネ、Ｃ．パッラヴィチーニ、Ａ．カッシオ、Ｍ．コルベッリーノ「ＨＩＶ感染患者及び非ＨＩＶ感染患者における内臓リーシュマニア症の診断及びモニタリングのために末梢血及び骨髄サンプルで行われるポリメラーゼ連鎖反応の臨床的使用：イタリアの単一施設における８年間の経験及び文献調査」クリニカル・インフェクシャス・ディジージズ２００７年、４４巻、１６０２〜１６１０ページ；Ｊ．ペッキア、Ｍ．ヘルナンデス「ポリメラーゼ連鎖反応に基づく微生物の同定、個体群特性化及び定量化のエアロゾル科学への統合：総説」アトモスフェリック・エンバイロメント２００６年、４０巻、３９４１〜３９６１ページ；Ｌ．Ａ．ベンヴェヌーティ、Ａ．ロッジェリオ、Ｎ．Ｖ．サンビアーゼ、Ａ．フィオレッリ、Ｍ．ド・ルルド・ヒグチ「心臓移植におけるシャーガス病再燃をモニタリングするための心内膜心筋生検におけるポリメラーゼ連鎖反応−症例報告と文献調査」カーディオバスキュラー・パソロジー２００５年、１４巻、２６５〜２６８ページ）がある。
しかしながらこれらの方法の問題点は、個々のウイルスの検出は非常に困難であるか、又は不可能であることである。従って、これらの検出方法においてもまず菌培養物及び細胞培養物を更に培養することによりウイルス濃度を高める。しかしこの培養にも相当な時間と労力が必要である。この方法において、ウイルスの検出自体はウイルスのＤＮＡ若しくはＲＮＡ（ＰＣＲ）又は免疫学的検定（ＥＬＩＳＡ）によって行われる。
ＰＣＲにおいては、ウイルスの遺伝物質（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を酵素反応によって増幅させてから分析する。ウイルスの遺伝物質は試料から単離し、酵素反応を阻害し得る細胞、細胞成分、及び他の因子から可能な限り分離する必要がある。この試料調製には相当な時間と労力が必要である。ＰＣＲにおいては、単離された遺伝物質に高価な試薬や特異的プライマーを添加する必要がある。プライマーは短い１本鎖ＤＮＡ断片であり、ウイルスゲノム中の後にウイルスの正確な同定に利用され得る特異的な部分のみが増幅されることを保証する。従って、ＰＣＲ調製物が不適切なプライマーを含んでいると、ＤＮＡの増幅もウイルスの検出もできないことになる。従って、種々の異なる科及び種のウイルスを特異的に検出可能とするためには、特定のプライマーを開発しなければならない。しかしウイルスの遺伝物質内に僅かな変化が生じてもプライマーはＤＮＡと結合できなくなり、この場合ＤＮＡ増殖は起こらない。検出対象のウイルスに対して信頼できるプライマーシステムが存在しない場合、ＰＣＲによってそのウイルスを検出することは全く不可能である。
ＥＬＩＳＡ等を用いる免疫学的検出においては、ウイルス粒子と抗体の間の特異的反応が検出に利用される。しかし、対象のウイルスが低濃度の場合には培養及び増殖した後で初めて検出される。この場合にも検出を行うために特定の生体分子が必要である。この免疫学的検出の場合、実験動物又は細胞培養物から得られる抗体が使用される。ＰＣＲの場合同様、免疫学的検出においても特異的にウイルスを検出するためには適切な生体分子（ＰＣＲ：プライマー；免疫学的検出：抗体）を選択しなければならない。しかし適切な抗体が存在しないか、或いは不適切な抗体が使用されると、ウイルスは検出できない。更に、抗体の作成には手間がかかり、ウイルスや抗体を固体基板に結合させる追加の固定化ステップも必要となる。
ウイルスの検出方法としてはイメージング技法も知られている。例えば各種診断における電子顕微鏡による検出方法として、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）をネガティブ染色法と組み合わせて利用する。この組合せ方法によれば、種々異なるウイルス科の間で微細構造が十分明確に区別されるので、個々のウイルスを科に分類することができる（Ｍ．ジェンティーレ、Ｈ．Ｒ．ゲルダーブローム「迅速なウイルス診断法：電子顕微鏡の役割」ザ・ニュー・マイクロビオロジカ２００５年、２８巻、（１）、１〜１２ページ；Ｐ．Ｒ．ハーゼルトーン、Ｈ．Ｒ．ゲルダーブローム「緊急事態における感染因子の迅速診断法のための電子顕微鏡」エマージング・インフェクシャス・ディジーズ２００３年、９巻、２９４〜３０３ページ）。透過型電子顕微鏡法では、ウイルスを科を超えて正確に分類することは不可能である。また、この方法は装置と調製に掛かるコストが大きい。
他のイメージング技法として原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）も使用される（Ｙ．Ｆ．ドリジン、Ｏ．Ａ．ボルドゥノヴァ、Ｍ．Ｏ．ガリアモフ、Ｉ．Ｖ．ヤミンスキー「タバコモザイクウイルス及びビリオンＲＮＡの原子間力顕微鏡検査」ＦＥＢＳレターズ１９９８年、４２５巻、（２）、２１７〜２２１ページ）。このイメージング技法においては、非常に平滑な固体の試料支持体上に固定化されたウイルス粒子が非常に微細な探針でスキャンされる。次に、撮像された個々の粒子の大きさと形状を分析することにより、ウイルスを特定の科に帰属させることができる。しかしながらこの場合、誤評価（偽陽性結果）を招くことが多い。特に試料が、起源は異なるが形状と大きさが類似しているウイルス粒子で汚染されている場合、曖昧な結果を招く。また、試料支持体の表面が非常に粗い場合や、試料支持体上の粒子が多過ぎる場合にも、微小なウイルス粒子の検出はできない。
イメージング技法全てに共通の重大な問題は、撮像された粒子の組成に関する情報が得られないことである。従って、粒子の帰属及び特定は粒子の形状と大きさのみにより行われるが、球形ウイルスの場合は特に誤った結果、更には誤評価を招きやすい。
ウイルス粒子の組成に関する情報は、原理的に分光法、例えばラマン分光法によって得られる。
振動分光法による試験によれば、得られたスペクトルに基づいてウイルスを科又は種に分類することができる。しかしながらこの方法の基礎をなすラマン効果はかなり弱いため、ラマン分光法はバルク試料に対してのみ適用可能である（Ｇ．Ｊ．トーマスＪｒ．「ラマン分光法とウイルス研究」アプライド・スペクトロスコピー１９７６年、３０巻、（５）、４８３〜９４ページ；Ｔ．Ａ．トゥラーノ、Ｋ．Ａ．ハルトマン、Ｇ．Ｊ．トーマスＪｒ．「ラマン分光法によるウイルス構造の研究、３．カブ黄斑モザイクウイルス」ジャーナル・オブフィジカルケミストリー１９７６年、８０巻、（１１）、１１５７〜６３ページ）。このことは、非常に高濃度で可能な限り不純物の少ないウイルスを入手しなければならないことを意味する。この方法では個々のウイルスの同定は不可能である。
比較的低濃度のウイルスを検出する目的で、いわゆる表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）を利用することができる。この方法においては、金属のナノ構造及びナノ粒子を用いることによりラマン分光法の感度を高める。しかしながら、ラマン効果の増強は使用されたナノ構造及びナノ粒子によりばらつきが非常に大きく、高い検出信頼性が得られないことから、日常的な診断には利用できない。更に、この方法を利用しても個々のウイルスの検出は不可能である（Ｓ．シャンムク、Ｌ．ジョーンズ、Ｊ．ドリスケル、Ｙ．ツァオ、Ｒ．ドゥラヒ、Ｒ．Ａ．トリップ「 呼吸器系ウイルスの迅速な高感度検出、銀ナノロッドアレイＳＥＲS基質を用いる分子署名」ナノレターズ２００６年、６巻、（１１）、２６３０〜２６３６ページ）。
ラマン測定の局所分解能を高める目的で、前記表面増強ラマン分光法はＡＦＭやＳＴＭ（走査型トンネル顕微鏡法、scanning tunneling microscopy）等のイメージング技法と組み合わされる。この組合せ方法は探針増強ラマン分光法（tip-enhanced Raman spectroscopy−ＴＥＲＳ）と呼ばれる（Ｒ．Ｍ．シュテックレ、Ｙ．Ｄ．ズー、Ｖ．デッケルト、Ｒ．ツェノビ「探針増強ラマン分光法によるナノスケール化学分析」ケミカル・フィジックス・レターズ２０００年、３１８巻、１３１〜１３６ページ）。
近年、バクテリアやＲＮＡを分析するための様々な応用手法が生物学分野において盛んに利用されている。バクテリアの研究においては、銀を蒸着したＡＦＭ探針がバクテリア上に配置される。しかしバクテリアと銀蒸着探針とのサイズに差があるため、バクテリア表面の非常に限定された部分しか探査できない。従って、この方法による結果も満足できるものではなかった。検出されたＴＥＲＳスペクトルは互いに再現性がなく、この事実から外側の細胞壁内の運動性が推測されることから、当業者はこの方法がバクテリアの同定には適さないと考えている（Ｕ．ノイゲバウアー、Ｐ．レッシュ、Ｍ．シュミット、Ｊ．ポップ、Ｃ．ジュリエン、Ａ．ラスムッセン、Ｃ．ブディッヒ、Ｖ．デッケルト「探針増強ラマン分光法によるバクテリア表面のナノメートルサイズの情報への途上」Ｃｈｅｍ. Ｐｈｙｓ. Ｃｈｅｍ. ２００６年、７巻、１４２８〜１４３０ページ）。また、１本鎖ポリＣ−ＲＮＡでＴＥＲＳ試験も行われた。この結果、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡの直接シーケンスを提供する（Ｅ．バイロ、Ｖ．デッケルト「１本鎖ＲＮＡの探針増強ラマン分光法：新たな直接シーケンス法に向けて」アンゲヴァンテ・ヘミーＩｎｔ．２００８年、４７巻、１６５８〜１６６１ページ）。
この方法を個々のウイルスの認識及び同定に応用することは、当業界では全く知られていない。
現在ウイルス診断法に関して知られている全ての方法を考慮した場合、個々のウイルスを高い信頼性で曖昧さ無く同定でき、検出感度が高く、迅速で、手間がかからず、日常的な臨床検査にも使用できる方法は現在のところ知られていない。
Ｓ．Ｓ．ニールセン、Ｎ．トフト「パラ結核死亡前診断：ＥＬＩＳＡ、インターフェロンγアッセイ及び糞便培養技術の精度に関するレビユー」ヴェテリナリー・ミクロバイオロジー２００８年、１２９巻、２１７〜２３５ページ Ｓ．アンチノリ、Ｓ．カラッチーニ、Ｅ．ロンギ、Ｇ．ベステッティ、Ｒ．ピオリーニ、Ｃ．マーニ、Ｇ．オルランド、Ｍ．グラミッチア、Ｖ．アクアヴィヴァ、Ａ．フォスキ、Ｓ．コルヴァスチェ、Ｃ．コロンバ、Ｌ．チトーネ、Ｃ．パッラヴィチーニ、Ａ．カッシオ、Ｍ．コルベッリーノ「ＨＩＶ感染患者及び非ＨＩＶ感染患者における内臓リーシュマニア症の診断及びモニタリングのために末梢血及び骨髄サンプルで行われるポリメラーゼ連鎖反応の臨床的使用：イタリアの単一施設における８年間の経験及び文献調査」クリニカル・インフェクシャス・ディジージズ２００７年、４４巻、１６０２〜１６１０ページ Ｊ．ペッキア、Ｍ．ヘルナンデス「ポリメラーゼ連鎖反応に基づく微生物の同定、個体群特性化及び定量化のエアロゾル科学への統合：総説」アトモスフェリック・エンバイロメント２００６年、４０巻、３９４１〜３９６１ページ Ｌ．Ａ．ベンヴェヌーティ、Ａ．ロッジェリオ、Ｎ．Ｖ．サンビアーゼ、Ａ．フィオレッリ、Ｍ．ド・ルルド・ヒグチ「心臓移植におけるシャーガス病再燃をモニタリングするための心内膜心筋生検におけるポリメラーゼ連鎖反応−症例報告と文献調査」カーディオバスキュラー・パソロジー２００５年、１４巻、２６５〜２６８ページ Ｍ．ジェンティーレ、Ｈ．Ｒ．ゲルダーブローム「迅速なウイルス診断法：電子顕微鏡の役割」ザ・ニュー・マイクロビオロジカ２００５年、２８巻、（１）、１〜１２ページ Ｐ．Ｒ．ハーゼルトーン、Ｈ．Ｒ．ゲルダーブローム「緊急事態における感染因子の迅速診断法のための電子顕微鏡」エマージング・インフェクシャス・ディジーズ２００３年、９巻、２９４〜３０３ページ Ｙ．Ｆ．ドリジン、Ｏ．Ａ．ボルドゥノヴァ、Ｍ．Ｏ．ガリアモフ、Ｉ．Ｖ．ヤミンスキー「タバコモザイクウイルス及びビリオンＲＮＡの原子間力顕微鏡検査」ＦＥＢＳレターズ１９９８年、４２５巻、（２）、２１７〜２２１ページ Ｇ．Ｊ．トーマスＪｒ．「ラマン分光法とウイルス研究」アプライド・スペクトロスコピー１９７６年、３０巻、（５）、４８３〜９４ページ Ｔ．Ａ．トゥラーノ、Ｋ．Ａ．ハルトマン、Ｇ．Ｊ．トーマスＪｒ．「ラマン分光法によるウイルス構造の研究、３．カブ黄斑モザイクウイルス」ジャーナル・オブフィジカルケミストリー１９７６年、８０巻、（１１）、１１５７〜６３ページ Ｓ．シャンムク、Ｌ．ジョーンズ、Ｊ．ドリスケル、Ｙ．ツァオ、Ｒ．ドゥラヒ、Ｒ．Ａ．トリップ「 呼吸器系ウイルスの迅速な高感度検出、銀ナノロッドアレイＳＥＲS基質を用いる分子署名」ナノレターズ２００６年、６巻、（１１）、２６３０〜２６３６ページ Ｒ．Ｍ．シュテックレ、Ｙ．Ｄ．ズー、Ｖ．デッケルト、Ｒ．ツェノビ「探針増強ラマン分光法によるナノスケール化学分析」ケミカル・フィジックス・レターズ２０００年、３１８巻、１３１〜１３６ページ Ｕ．ノイゲバウアー、Ｐ．レッシュ、Ｍ．シュミット、Ｊ．ポップ、Ｃ．ジュリエン、Ａ．ラスムッセン、Ｃ．ブディッヒ、Ｖ．デッケルト「探針増強ラマン分光法によるバクテリア表面のナノメートルサイズの情報への途上」Ｃｈｅｍ. Ｐｈｙｓ. Ｃｈｅｍ. ２００６年、７巻、１４２８〜１４３０ページ Ｅ．バイロ、Ｖ．デッケルト「１本鎖ＲＮＡの探針増強ラマン分光法：新たな直接シーケンス法に向けて」アンゲヴァンテ・ヘミーＩｎｔ．２００８年、４７巻、１６５８〜１６６１ページ
本発明の目的は任意の固体、液体又は気体試料中の個々のウイルスを迅速に、曖昧さ無く、高い信頼性で同定することにあり、試料調製や分析技法に関する費用を可能な限り低減し、抗体を利用した固定化を必要とせず、存在する可能性のあるウイルスの存在を示すものや少なくとも存在の疑いを示すものを必要とすることなく同定することにある。
本発明によれば、検査対象の試料が結合された支持体表面の高さプロファイルを、例えば自体公知のＡＦＭ法等によりプローブでスキャンして得る。この表面スキャンニングによって得られた高さプロファイルから、その表面構造（高さプロファイル）からウイルスを含むことが疑われるスキャン場所を選択する（前記スキャン操作と同時又はその後）。これらの高さプロファイルに従って選択されたスキャン場所にそれぞれ単色励起光を照射し、光励起の結果スキャン場所で発生するラマン散乱光に関して分光学的分析を行う。前記ラマン散乱光の分析結果を参照値、特に電子的データベースの参照値と比較することにより、スキャン場所に存在する個々のウイルスを同定する。
本方法においては、推定されたウイルス粒子の形状と大きさに関する情報が初めて振動分光データとリンクされ、ウイルスの、更には個々のウイルスの曖昧さ無く迅速な同定が初めて可能となることが提案される。これはイメージング技法（表面スキャンニング）をラマン分光法と組み合わせることによって達成される。
試料中に存在する或いは存在している可能性のあるウイルスの個体数と種類に関する情報については事前に入手可能である必要はなく、ウイルスの構造に基づいて選択された試料表面のスキャン場所において見出され且つ定義されるウイルス構造は、それらの振動分光データを、参照値として得られる全データ（詳細な全ウイルス情報）と比較することにより分析され、高い信頼性で同定される。
上述の従来法と比べ本発明方法は種々の利点を提供する。例えば、高価な分子生物学的試薬を必要とすることなくウイルスの、更には個々のウイルスの曖昧さ無く比較的迅速な同定が可能である点、及び非常に時間と方法の手間がかかる前培養及び試料調製が要らない点である。これにより本発明は、精度、信頼性、検出速度及び労力の点で上述したウイルス検出方法より明らかに優れている。更に、前述のように個々のウイルスもそれらの形状によって分析されるだけでなく、振動分光法によっても分析される。従って、大きさと構造の他に、分析されたウイルス粒子の化学的組成に関する正確な情報も得られ、これらウイルスの種を正確に曖昧さ無く特定することが初めて可能となる。
本発明に係る方法は、ウイルスの免疫学的検出又はＰＣＲ検出で利用される分子生物学的な検出反応を利用しないため、分子生物学的方法に伴う手間のかかる試料の調製及び精製も行う必要がない。更にこれら検出反応に必要なプライマー、抗体、酵素及びその他の試薬に伴う高くなりがちなコストも節約される。
イメージング技法を振動分光法と組み合わせることにより、前述の純粋なイメージング技法（ＡＦＭ、ＴＥＭ）とは異なり、高い検出感度でスキャンされた試料の物質組成に関する非常に詳細な情報を得ることができ、参照データとの非常に詳細な構造比較、更には非常に正確で曖昧さの無いウイルスの検出及び特定が可能となる。
この組み合わせ手法は、形状と大きさが等しいか近似しているため空間位置情報のみでは曖昧さ無く評価できないウイルスに対して有利である。
本発明によれば、個々のウイルスについても検出が可能であるため、検出及び特定の信頼性のために最低濃度も得る必要なく、これに伴う前培養も省略できる。本発明を応用するために有利な試料調製としては、例えば濾過による大きさ仕分けのみである。これはウイルスから大きい粒子を分離して試料を純化し、それによって評価、即ち支持体表面の高さプロファイルに基づくスキャン場所の選択、及びウイルスの検出及び特定を簡単にするために行う。その際に例えば孔径が次第に減少するフィルタアレイを使用して試料を濾過する。続いて、一定の孔径を有するフィルタ上に濃縮されたウイルスを載置し、埃やバクテリア等の大きい粒子からウイルスを分離する。
支持体に結合された試料の高さプロファイルをＡＦＭ法によるスキャンニングにより得て、レーザ励起によるラマン散乱光を調べるための模式的な構成。
以下、本発明を図面を参照して実施例に基づいて詳細に説明する。
図１は、支持体に結合された試料の高さプロファイルを自体公知のＡＦＭ法（原子間力顕微鏡法）によりスキャンすることにより得て、レーザ励起によるラマン散乱光を調べるための模式的な構成を示す。レーザ光による試料の照射は、顕微鏡レンズを用いてプローブと反対側の下方から行われる。増強されたラマン信号は、試料に照射した際と同一の顕微鏡レンズで集められ、更にレーザ顕微鏡の評価用センサーに送られる。
ウイルス２を有する支持体１からなる検査試料を同模式図に示す。この試料は、試料に向けられた端部に金属粒子４を備えたＡＦＭ探針３によってスキャンされ、高さプロファイルが得られる。この試料の高さプロファイルのためのスキャンニングにおいては、支持体１に結合されたウイルス２の構造、即ちウイルスを含んでいると思われる目立った構造が図１に示すスキャン場所において検出される。本発明に従えば、スキャン場所を検出選択するプロセス（該プロファイルスキャンニングと同時或いはプロファイルスキャンニングの完了後）と、選択されたスキャン場所において発生する試料のラマン散乱光の分析を組み合わせる。この目的で、レーザ顕微鏡のレンズ６（詳細図示せず）を通して集束されたレーザビーム５が試料に当てられる。レーザビーム５による試料の光励起の結果、散乱光が発生し、この散乱光がレーザ顕微鏡のレンズ６により検知され評価される。この散乱光の評価データを既存の参照値、特にデータベースの参照値（同様に図１に示さず）と比較することによって、試料のスキャン場所に存在するウイルスが同定される。
植物試料中のタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の検出
ＴＭＶは経済的に重大な影響を及ぼすタバコモザイク病を引き起こすが、他の科の植物に感染することもある。このウイルスは非常に安定で、伝染しやすい。この伝染は、例えば植物間の直接接触や植物汁により、植物種によっては種子により、或いは殆どの農作業において感染植物を扱うことによって起こる。
多大な経済的損害を回避するために、このウイルスを可能な限り迅速且つ正確に同定する必要がある。
この同定には植物汁又は植物の一部（葉、芽、実、幹、茎、根等）を用いる。植物の一部を使用する場合は、最初の段階でこれらを機械的に、或いは適切なバッファー中で化学的に溶解させて、細胞構造からウイルスを遊離させる。次に得られた液体（植物搾汁様）を、孔径が次第に減少するフィルタ構成に通す。続いて１５ｎｍ〜４００ｎｍのウイルス粒子が把捉されたフィルタのみを、前記の装置と方法を用いてウイルスの存在について調べる。この手続きの長所は、他の植物病原性ウイルスも同時に同定できる点である。
口蹄疫（ＭＫＳ）ウイルスの検出
ＭＫＳは感染性が強く届出義務のあるウシ及びブタの疾患である。しかしながらヤギ、ヒツジ、その他の偶蹄類にも感染する。更にはゾウ、ハリネズミ、ラット及びヒトへの感染も文献に報告されている。
このウイルス同定のために、例えば口内（アフタ）液、器官ホモジネート、咽頭粘膜試料（咽頭ゾンデ試料）、分泌物及び細胞培養上清を使用することができる。これらを適切な溶解バッファーに移して、細胞からウイルスを遊離させる。次に、このように得られた液体を実施例１に記載されたフィルタ構成に通し、対象となるフィルタを上述のように分析する。
空気試料中のインフルエンザウイルスの検出
ヒトにおいてインフルエンザはインフルエンザウイルスＡ型又はＢ型によって起こる。この場合、感染は所謂飛沫感染又は付着感染を通して起こることが多い。感染した患者の呼吸飛沫（呼気飛沫）を直接吸引することを医学的には飛沫感染と呼ぶ。
ウイルスの接触感染又は付着感染は、物体や体表面に落下した感染性の高い呼吸飛沫、又は付着した鼻分泌物によって起こる。
空気試料中のウイルスを検出するために、所定の量の空気を上述したフィルタ構成（実施例１参照）に通して濾過する。続いてフィルタを前記の方法で分析する。
バクテリア培養物中のバクテリオファージの検出
原核細胞を宿主として利用するウイルスは一般にバクテリオファージと呼ばれる。バクテリオファージを迅速に同定することへの関心は特に高い。バクテリオファージはバクテリアのみに感染し、バクテリアを用いる剤の生物工学的生産において甚大な被害を招くことが多い。検査すべき試料（培地、バクテリア培養物等）を最初に適切な溶解バッファーに移して、バクテリア細胞の構造を破壊してウイルスを遊離させる。次にこの溶液を上述したフィルタ構成に通して、対象のフィルタを上述のように分析及び評価する。
１ 支持体
２ ウイルス
３ ＡＦＭ探針
４ 金属粒子
５ レーザビーム
６ レーザ顕微鏡のレンズ

Claims (8)

  1. 試料中の個々のウイルスを同定するための方法であって、サイズ仕分けのために試料を好ましくは前処理してから支持体表面に結合させ、イメージング技法によりウイルスを分析する方法において、前記試料が結合した支持体表面の高さプロファイルをプローブによるスキャンニングで得て、支持体表面の高さプロファイルのためのスキャンニングに加えて少なくとも支持体表面の高さプロファイルから決定されたスキャン場所を選択して単色励起光を照射し、光励起の結果としてそれぞれのスキャン場所で発生するラマン散乱光のスペクトルをプローブで把捉し、前記スキャン場所で得られたラマン散乱光を参照値と比較して、この比較に基づき対応するスキャン場所に存在する個々のウイルスを推定することを特徴とする方法。
  2. 支持体表面の高さプロファイルのためのスキャンニングと同時に支持体表面のそれぞれのスキャン場所についてラマン散乱光をプローブで把捉し、高さプロファイルのためのスキャンニングと同時に把捉されたラマン散乱光を、高さプロファイルに従って選択されたそれぞれのスキャン場所について該場所におけるウイルス同定のために参照値と比較することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 最初に支持体表面の高さプロファイルをプローブによるスキャンニングで完全に又は部分的に得て、スキャンニングで得られた高さプロファイルを評価して重要なスキャン場所を確定し、次にこれらの場所に単色励起光を照射し、発生するラマン散乱光をプローブで把捉し、該場所におけるウイルス同定のために参照値と比較することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. ウイルス同定のためにラマン散乱光をそれぞれ電子的データベースのデータと比較することを特徴とする、請求項１記載の方法。
  5. サイズ仕分けのために液体試料を濾過による前処理に付すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. サイズ仕分けのために固体試料を均質化（機械的粉砕）による前処理に付すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. サイズ仕分けのために気体試料を直接ガスフィルトレーションによる前処理に付すことを特徴とする、請求項１記載の方法。
  8. サイズ仕分けのために試料成分を溶解する目的で気体試料を液体に導入し、次に濾過することを特徴とする、請求項１に記載の方法。




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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010023099B3 (de) 2010-06-09 2011-11-17 Celltool Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Charakterisieren von biologischen Objekten
RU2491338C2 (ru) * 2011-06-30 2013-08-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский Институт гриппа" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ "НИИ гриппа" Минздравсоцразвития России) Применение моноклональных антител для идентификации ямагатской или викторианской эволюционных линий вируса гриппа типа в, штамм гибридомы 4н7 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в ямагатской ветви, штамм гибридомы в/4н1 для получения моноклональных антител, предназначенных для определения вирусов гриппа в викторианской ветви
RU2013150539A (ru) * 2011-08-22 2015-05-20 Спектрал Плэтформс, Инк. Быстрое обнаружение метаболической активности
EP3347691B1 (de) 2015-09-11 2022-01-12 Leibniz-Institut für Photonische Technologien e.V. Anordnung für die individualisierte patientenblutanalyse und verwendung
DE102015115342A1 (de) * 2015-09-11 2017-03-16 Leibniz-Institut für Photonische Technologien e. V. Anordnung für die individualisierte Patientenblutanalyse
CN110940690A (zh) * 2018-09-21 2020-03-31 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种黄瓜绿斑驳花叶病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法
GB2580186B (en) * 2018-12-24 2021-09-15 Cell Therapy Catapult Ltd Monitoring viral titre using Raman Spectroscopy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH095237A (ja) * 1995-06-19 1997-01-10 Hitachi Ltd ラマンスペクトル測定装置及び測定方法
JP2008501982A (ja) * 2004-06-07 2008-01-24 ウェイン エー ワイマー 表面増強ラマン分光（ｓｅｒｓ）用基板表面の製造方法及びシステム、及びそれを用いた装置

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7738096B2 (en) * 2004-10-21 2010-06-15 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) systems, substrates, fabrication thereof, and methods of use thereof
DE102006039492A1 (de) * 2006-08-21 2008-03-06 Nölting, Bengt, Dr. Ramanmikroskopie
WO2008028521A1 (en) * 2006-09-07 2008-03-13 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. A probe, a raman spectrometer and a method of manufacturing a probe

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH095237A (ja) * 1995-06-19 1997-01-10 Hitachi Ltd ラマンスペクトル測定装置及び測定方法
JP2008501982A (ja) * 2004-06-07 2008-01-24 ウェイン エー ワイマー 表面増強ラマン分光（ｓｅｒｓ）用基板表面の製造方法及びシステム、及びそれを用いた装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5011012696; Ｋｕｄｅｌｓｋｉ，　Ａ．　ｅｔ．ａｌ: 'ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ　ＯＦ　ＲＡＭＡＮ　ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＹ' ＴＡＬＡＮＴＡ Ｖｏｌ．７６，　Ｎｏ．１, 20080630, ｐｐ．１-８, ＥＬＳＥＶＩＥＲ *

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