CN104450953B

CN104450953B - Rna恒温扩增的禽流感病毒h7n9（2013）核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN104450953B
Application number: CN201310415686.6A
Authority: CN
Inventors: 尹华立; 白立志; 马道亮; 于明辉; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: CN104450953A

Abstract

本发明涉及一种RNA恒温扩增的禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒，包括：病毒保存液、核酸提取液、洗涤液、H7N9（2013）反应液、H7检测液、N9检测液、SAT酶液、H7N9（2013）阳性对照、H7N9（2013）阴性对照试剂。本发明的检测试剂盒具有特异性高、灵敏度高、低污染和快速检测的特点，在禽流感病毒H7N9（2013）的早期感染的临床诊断中发挥重要作用。

Description

RNA恒温扩增的禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术（SAT）对禽流感病毒H7N9（2013）进行检测的试剂盒。通过本发明的试剂盒可实现对禽类粪便等分泌物和人类咽鼻等分泌物中禽流感病毒H7N9（2013）的检测。

背景技术

禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属，病毒颗粒呈多形性，其中球形直径80～120nm，有囊膜。禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。2013年发生的人感染禽流感H7N9为新型重配病毒，其内部基因来自于H9N2禽流感病毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亚型禽流感病毒引起的急性呼吸道传染病。

患者一般表现为流感样症状，如发热、咳嗽、少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，多在5-7天出现重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、感染性休克，甚至多器官功能障碍，部分患者可出现纵隔气肿、胸腔积液等。

目前，实验室检测方法有病毒分离法、直接测序、抗原检测法、核酸检测法。

病毒分离培养，常用有鸡胚接种法和细胞培养法，此法对病毒分离法较敏感，但操作繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。

抗原检测法灵敏度较低，不易推广应用；

H7N9为RNA病毒，如果通过直接测序，需先进行转录酶-聚合酶链式反应（ReverseTranscriptase-PCR，简称RT-PCR）。RT-PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染，且容易造成实验结果的假阳性现象。

核酸检测法包括检测DNA的实时荧光聚合酶链式反应（Real Time FluorescentPCR，简称RF-PCR）和检测RNA的恒温扩增检测法，如转录介导扩增（TranscriptionMediated Amplification，TMA），实时荧光核酸恒温扩增（Simultaneous Amplificationand Testing，SAT）。实时荧光PCR法，灵敏度和准确度较高，但同样存在易污染，易造成实验结果假阳性。因此，开发一种快速、灵敏、特异且不易污染的试剂盒非常必要。

TMA和SAT技术因直接扩增RNA，可快速、高灵敏度、高特异性的进行检测，目前尚未有TMA的H7N9试剂盒的任何报道。

本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法（Simultaneous Amplificationand Testing，SAT）（ZL 200810111479.0）以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法（ZL 200810111478.6）；在此两项技术的基础上，本发明禽流感H7N9（2013）核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸（RNA）的一个DNA拷贝，T7 RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。

在使用已知的磁珠-RNA富集技术和SAT技术（即RNA恒温扩增）检测临床样本中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高检测的准确性，一个关键性的技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的捕获探针、引物和单链核苷酸探针。本发明人将RNA恒温扩增检测技术应用于禽流感病毒H7N9（2013）的检测，成功完成了本发明。

发明内容

本发明涉及一种RNA恒温扩增的禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒，特别是涉及以磁珠-RNA富集技术和SAT恒温扩增检测技术早期、快速诊断人咽拭子和鼻拭子等临床样本中禽流感病毒H7N9（2013）存在的试剂盒。

因此，本发明的目的是提供一种使用磁珠-RNA富集技术和SAT恒温扩增检测技术来定性检测人咽拭子和鼻拭子等临床样本中禽流感病毒H7N9（2013）的试剂盒，特别是涉及禽流感病毒H7N9（2013）的早期感染在实验室诊断中的应用。其基本原理为：首先由捕获探针对靶核酸（靶核酸序列如序列表中序列2、序列6）进行捕获；然后利用带T7启动子的下游引物、特异上游引物和特异单链核酸探针，使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现核酸扩增，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由荧光检测仪器捕获。

本发明提供了一种RNA恒温扩增的禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒，试剂盒包括：（1）分别装有病毒保存液、核酸提取液、洗涤液、H7N9（2013）反应液、H7检测液、N9检测液、SAT酶液、H7N9（2013）阳性对照、H7N9（2013）阴性对照并加盖密封的多个试剂瓶或管，和（2）分隔并集中包装这些试剂瓶或者管的包装盒，其中H7检测液、N9检测液分别包含一对上游引物、5’端带有T7启动子序列的下游引物、两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸探针，所述的核酸提取液包括磁珠和捕获探针。

在另一优选例中，所述核酸提取液中用于靶核酸捕获的探针序列如序列表中序列1所示。

在另一优选例中，所述H7检测液的上游引物nT7的核苷酸序列如序列表中序列3所示；下游引物T7的核苷酸序列如序列表中序列4所示，H7检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

在另一优选例中，所述N9检测液的上游引物nT7的核苷酸序列如序列表中序列7所示；下游引物T7的核苷酸序列如序列表中序列8所示，N9检测探针的核苷酸序列如序列表中序列9所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

在另一优选例中，所述的待测核酸来自于禽类粪便等分泌物或人类咽鼻分泌物样品中的核酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)

中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方

案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1 H7灵敏度检测图。

图2 N9灵敏度检测图。

图3 H7特异性检测图。

图4 N9特异性检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒检测试剂的研制及优化

1、捕获探针（TCO）、引物和靶核酸检测探针的设计：

通过对Genbank数据库已有的禽流感病毒H7N9（2013）核酸序列进行序列比对分析，以禽流感病毒H7N9（2013）的HA的保守基因片段及NA的保守基因片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段设计引物和探针。

2、提取体系和反应体系的建立与优化：

本发明的提取体系和反应体系参照专利ZL 200810111479.0和ZL200810111478.6，除了捕获探针（TCO）、引物和检测探针序列、浓度及反应时间。因此本发明主要是对捕获探针（TCO）、引物和检测探针进行筛选，并对反应时间进行确定。

参考品的准备：以体外构建、转录和测序鉴定为HA基因RNA阳性及NA基因RNA阳性做为灵敏度参考品；

引物、靶核酸检测探针的筛选：以上述设计的多组引物、靶核酸检测探针分别检测以上参考品，经过反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物和靶核酸检测探针。

捕获探针（TCO）的筛选：以上述1中设计的多组捕获探针（TCO）对上述参考品进行提取，然后将提取产物用上述筛选出的最佳引物、靶核酸检测探针进行进行检测，经过反复试验，筛选出灵敏度和重复性好的最佳捕获探针（TCO）。

引物、靶核酸检测探针的浓度优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1μM至1μM浓度的引物和从0.05μM至0.5μM浓度梯度的H7、N9核酸检测探针进行SAT反应，经过多次重复试验，最终确定最佳的HA基因检测的上游引物浓度为0.27μM、下游引物浓度为0.27μM，H7检测探针浓度为0.18μM。NA基因检测的上游引物浓度为0.27μM、下游引物浓度为0.27μM，N9检测探针浓度为0.18μM。

捕获探针（TCO）浓度的优化：在提取体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1μM至10μM浓度梯度的TCO进行靶核酸提取，然后将提取产物用上述筛选好的引物、靶核酸检测探针进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定最佳的TCO浓度为0.25μM。

反应液中各组分浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，参照专利200810111479.0中反应液各组分的浓度范围进行SAT检测，最终确定反应液中最佳组分为：25mM Tris，20mM KCl，10mM MgCl₂，5mM NTPs，1mM dNTPs，5% (V/V) 甘油。

SAT酶液中各组分浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，经过多次重复试验，最终确定SAT酶液中最佳组分为：2000U M-MLV反转录酶、2000U T7 RNA聚合酶，20mM Tris，0.1% (V/V) Triton X-100，30mM KCl，0.01mM EDTA，0.1mM DTT，50% (V/V) 甘油。

病毒保存液中各组分浓度的优化：在提取体系其他组分不变的情况下，经过多次重复试验，确定病毒保存液最佳组分为：50mM Tris (pH7.0) ， 0.1% (V/V) SDS，1% (V/V)Triton X-100，0.1% (V/V) NP-40。

核酸提取液体中磁珠浓度的优化：在提取体系其他组分不变的情况下，经过多次重复试验，确定磁珠的最佳浓度为250mg/mL。

实施例2 禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒的组成及检测

1、制备包括下列组成组分的试剂盒：

试剂盒分为标本处理单元A盒和核酸扩增检测单元B盒。A盒包括病毒保存液，核酸提取液、洗涤液；B盒包括H7N9（2013）反应液、H7检测液、N9检测液、SAT酶液、H7N9（2013）阳性对照、H7N9（2013）阴性。

具体的：

病毒保存液：含有50mM Tris (pH7.0) ， 0.1% (V/V) SDS，1% (V/V) Triton X-100，0.1% (V/V) NP-40的溶液。

核酸提取液：含有250mg/mL磁珠和0.25μM捕获探针（TCO）的溶液。捕获探针序列为：5’accaaccaacaatttgagttgatagacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa’3。

洗涤液：含有150mM NaCl的溶液。

H7N9（2013）反应液：25mM Tris，20mM KCl，10mM MgCl₂，5mM NTPs，1mM dNTPs，5%(V/V) 甘油的溶液。

H7检测液：含有0.27μM上游引物（H7 nT7）、0.27μM下游引物（H7 T7）、0.18μM单链靶核酸检测探针的溶液，具体的为：

H7 nT7引物的序列为：5’ttacacatatgaagacaa’3。

H7 T7引物序列为：5’aatttaatacgactcactatagggagaatagaatacagattgacccagtca’3。

N9检测探针序列为：5’ccaggugaugccccgaagccugg’3。

N9检测液：含有0.27μM上游引物（N9 nT7）、0.27μM下游引物（N9 T7）、0.18μM单链靶核酸检测探针的溶液，具体的为：

N9 nT7引物的序列为：5’ attgacatcctggatttgcc’3。

N9 T7引物序列为：5’ aatttaatacgactcactatagggagaccctgataagctggccact’3。

N9检测探针序列为：5’ccaggcuaguacuugaccccugg’3。

SAT酶液：含有2000U M-MLV反转录酶、2000U T7 RNA聚合酶，20 mM Tris，0.1%(V/V) Triton X-100，30mM KCl，0.01mM EDTA，0.1mM DTT，50% (V/V) 甘油。

H7N9（2013）阳性对照：含有H7N9（2013）HA部分基因和NA部分基因的体外转录RNA稀释物，浓度分别为1×10⁶copies/mL。

H7N9（2013）阴性：为生理盐水和裂解液1：1混合的溶液。

2、样品采集、运送和保存

（1）样品采集，预处理

拭子和采集管要求：标本应使用头部为合成纤维的拭子（如聚酯纤维），用铝或塑料做柄（不推荐棉拭子和木柄）。标本采集管中应含有3毫升无菌病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。

（3）样本运输

标本采集后立即用冰块或冰排保存或置于4℃（冰箱），低温密闭送检，不能立即检测的保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。

3、检测步骤

（1）核酸提取

H7阳性对照制备：取0.2ml生理盐水，加入10μl阳性对照品，混匀备用。

N9阳性对照制备：取0.2ml 生理盐水，加入10μl阳性对照品，混匀备用。

H7阴性对照制备：取0.2ml生理盐水，加入10μl阴性对照品，混匀备用。

N9阴性对照制备：取0.2ml生理盐水，加入10μl阴性对照品，混匀备用。

使用洁净Tip头分别吸取0.2ml待测样本(每份样本取两份，一份用于H7检测，一份用于N9检测)、H7阳性对照、H7阴性对照、N9阳性对照和N9阴性对照，加入对应标记的样品处理管；

每管分别加入200μl病毒保存液和100μl核酸提取液（用前混匀），10μl 上述准备的内标，关盖震荡30秒；置于60℃ 保温 5分钟；然后室温放置10分钟。

将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5分钟（如果在磁珠吸附过程中有个别磁珠难以吸附至管壁则应适当延长吸附时间）。

待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。

用洗涤液（洗涤液如果有白色絮状沉淀物，用之前应先42℃加热，直至澄清）洗涤两次，每次加入1ml洗涤液后取下样品处理管震荡30 秒后置磁珠分离装置上，静置5分钟；保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。

将样品处理管移离磁珠分离装置，管中的磁珠-核酸复合物备用（此步应清晰可见磁珠）。

每管分别加入40μl相应扩增检测液，震荡混匀。

（2）SAT扩增

从震荡混匀后的上述扩增检测液中取，取30μl 磁珠悬液至新的微量反应管中，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；同时将SAT酶液也预热到42℃。

向微量反应管中加入10μl已预热的SAT酶液（加样tip头不要接触微量反应管，如有接触请务必更换tip头），加酶后盖上管盖1200rpm震荡15秒钟混匀。

将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42℃ 反应60分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测60次。

（3）结果与分析

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。读取dt值，dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）。

结果判断：

结果判定	H7和N9检测管结果*
		H7N9阳性	H7检测管与N9检测管同时阳性
H7N9阴性	H7检测管与N9检测管同时阴性，或者一阴一阳

* H7和N9检测管结果判断

A、H7检测管结果判断

（1）H7检测管阳性判断

dt≤55的样本为阳性， 55＜dt＜60的样本建议重新检测，检测结果dt＜60的样本为阳性。

(2) H7检测管阴性判断：

dt无数值或为60。

B、N9检测管结果判断

(1)N9检测管阳性判断：

(2) N9检测管阴性判断：

dt无数值或为60。

实施例3禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒的灵敏度检测

以实施例2所述试剂盒检测体外转录H7和N9的RNA。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

将浓度为1×10⁶copies/μl的HA基因体外转录RNA及1×10⁶copies/μl NA基因体外转录RNA，分别按10倍梯度稀释，按实施例2所述步骤进行检测。

从图1和图2检测结果可知，H7和N9的检测灵敏度均可达到10copies/反应，整个试剂盒的灵敏度为10copies/反应，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

实施例4 禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒的特异性检测

选取10份临床标本，分别为H7N9（2009）、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、人巨细胞病毒、鼻咽癌病毒、肺炎支原体、肠道病毒、流感H1N1（2009）临床标本并设一个阳性对照和一阴性对照，进行H7N9特异性检测实验。按实施例2步骤进行检测。

检测结果见图3、图4。其中阳性对照和H7N9临床标本分别在H7和N9检测中出现扩增曲线，为H7N9阳性；9份临床标本和阴性对照的扩增曲线分别在H7和N9检测中与基线均无交叉值，为H7N9阴性，说明本试剂盒对H7和N9的检测特异性高。

<110> 上海仁度生物科技有限公司

<120> RNA恒温扩增的禽流感病毒H7N9（2013）核酸检测试剂盒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 捕获探针

<400> 1

accaaccaac aatttgagtt gatagacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 58

<210> 2

<211> 574

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> HA基因

<400> 2

ttatatacaa atagtgcacc gcatgtttcc attctttaca catatgaaga caaggcccat 60

tacaatggct agaagtatga aacatgatgc cccgaagcta aaccaaagta tcacatcttt 120

gtagccgctg cttagtttga ctgggtcaat ctgtattcta ttttgcattg cctcttccct 180

gtatttgctg tgatcatagg tgttatttct aatactggcc atacagtcat catcacactt 240

gtgaaatatt tcaaagcaac cagtgccatc ttcttcagca ttctctctca gctgtctttt 300

cactcgttcg tacagtttgt ccatttctga atcagccaga tcaattgtat gctggttctc 360

cattgctacc aagagttcag cattgtatga ccacacttct gttatagaat ctctggtcca 420

atttatcaca ttaccgattt gcttctctac ctcattgaat tcattgtcta tcaactcaaa 480

ttgttggttg gttttttcta taagccggtt taattttcct gttatttgat caattgccga 540

ttgagtgctt ttgtaatctg cagcagttcc ctct 574

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> H7 nT7引物

<400> 3

ttacacatat gaagacaa 18

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> H7 T7引物

<400> 4

aatttaatac gactcactat agggagaata gaatacagat tgacccagtc a 51

<210> 5

<211> 23

<212> RNA

<213> unknown

<220>

<223> H7探针

<400> 5

ccaggugaug ccccgaagcc ugg 23

<210> 6

<211> 825

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> NA基因

<400> 6

tgtctgtaag aacaggactg catatatact gactagtgtg tgtcattgct actggatcta 60

tctgaatcac tggtctattt gagccctgcc aattgtcctt gcatgtgcag gtaattcctg 120

ttcgttcccc gtaacatgag cattcttcaa tatgcttagc agttccagtc agagactccc 180

atttcaatat tttcccctct ttaaaatagt atattcttgt gtctgcaggt ccagtggcag 240

acccatcggt gaacactact gggcatacgc cgttgtggca tacacattca gattcctgtg 300

ttcttagtat gtttcgggcc catgtgttaa tttctgcaac aggccttctg ttgtaccata 360

ctactgcaga tgcattgttg tttggtcctg atatacatat tgacatcctg gatttgccat 420

catggcaact agtacttgac cacccaatgc attccaccct gctgttgtac actgtgggcg 480

gtgatgatag tggccagctt atcagggcgc gatactggga cctatcgtgt attgttccgt 540

ttgagtgttt tcctctgatt gttgttcctt ggctgagagc atagaacctg cattcatctg 600

ggtcgcatga aacatagggt tctcttgtga ctaaaacatc cgagctctct ccaattctta 660

ccgcattgtc tttcccatat atgtgccatg aatttatagt acagagccct ttagttaagt 720

tattgaaatt cctgcttgtt ctctcttcca tttggatgtt ggtgatgttt gtttcattat 780

aatagttgtt tattattgtt tggcttgtgt tggttgtttc aggtt 825

<210> 7

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<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> N9 nT7引物

<400> 7

attgacatcc tggatttgcc 20

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> N9 T7引物

<400> 8

aatttaatac gactcactat agggagaccc tgataagctg gccact 46

<210> 9

<211> 23

<212> RNA

<213> unknown

<220>

<223> N9探针

<400> 9

ccaggcuagu acuugacccc ugg 23

Claims

1.一种RNA恒温扩增的禽流感病毒H7N9核酸检测试剂盒，试剂盒包括：(1)分别装有病毒保存液、核酸提取液、洗涤液、H7N9反应液、H7检测液、N9检测液、SAT酶液、H7N9阳性对照、H7N9阴性对照并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或者管的包装盒，其中所述的H7检测液、N9检测液分别包含一对上游引物、5’端带有T7启动子序列的下游引物、两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸探针，所述的核酸提取液包括磁珠和捕获探针；

其中，所述的捕获探针序列如序列表中序列1所示；

并且，所述的H7检测液的上游引物nT7的核苷酸序列如序列表中序列3所示；下游引物T7的核苷酸序列如序列表中序列4 所示，H7检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

并且，所述的N9检测液的上游引物nT7的核苷酸序列如序列表中序列7所示；下游引物T7的核苷酸序列如序列表中序列8所示，N9检测探针的核苷酸序列如序列表中序列9所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于检测禽类粪便分泌物或人类咽鼻分泌物样品中是否存在禽流感病毒H7N9。