CN102703603B - 通用型甲型流感病毒(iav)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、IAV扩增引物T7引物和nT7引物、IAV检测探针、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明试剂盒能够检测拭子中的IAV RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达100copies/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(常规50分钟完成检测)的特点，将在通用型甲型流感早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的生物检测技术，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

流感病毒根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M)不同分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒基因组由8条负链RNA节段构成，根据表面血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和9个NA亚型。

甲型流感病毒为常见流感病毒，易变异，最具攻击力，可引起人的流感并有时引起肺炎和其他并发症，主要是气管和支气管纤毛柱状上皮细胞的坏死和脱落，有些病毒株能自然感染禽类和哺乳类动物，具有暴发突然、蔓延迅速、流行广泛的特点。世界范围的流感大流行共发生4次，其中1918-1919年世界流感大流行导致2000万人死亡。中国近半个世纪以来流感流行共计发生18次，其中3次为大流行。

目前，常用的甲型流感病毒实验室检查方法包括：1)免疫学检测方法，如快速流感抗原检测、免疫荧光法(或装配的IFA)，此法灵敏度较低，不易推广应用；2)细胞生物学检测方法，常用有鸡胚接种法和细胞培养法，此法对病毒分离法较敏感，但需要2-3周时间，无法实现早期快速诊断；3)分子生物学检测方法，目前有逆转录酶-聚合酶链式反应(Reverse Transcriptase-PCR，简称RT-PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real Time Fluorescent Quantified PCR，简称FQ-PCR)，RT-PCR采用“基因扩增+扩增子检测”的操作模式，易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，实时荧光定量PCR(FQ-PCR)虽在技术上解决了上述问题，其灵敏度和准确度较高，但操作复杂，检测成本相对昂贵，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA多聚酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

为解决现有的通用型甲型流感病毒(IAV)检测方法灵敏度较低，检测周期长、易引起扩增物的污染造成实验结果的假阳性或假阴性以及检测成本较高的问题，本发明提供了一种检测周期短、高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定以及检测成本低、易于推广应用的通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测技术，包括专用引物、探针、试剂盒及其使用。

本发明所提供的通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝的IAV扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的IAV检测探针。

所述捕获探针可与如序列表中序列1所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶标核酸(IAV RNA)序列特异结合，在有IAV内标(IAV IC RNA)时，其最好还可与该IAV内标序列特异结合，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述IAV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述IAV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和IAV检测探针存在于一IAV检测液中。

再进一步所述试剂盒还包含有IAV内标和内标检测探针；所述IAV内标为竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并与IAV靶标核苷酸(IAV RNA)使用同一对引物(T7和nT7)，IAV内标由序列表中序列7所示的IAV IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于IAV检测液中。

更进一步，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、IAV反应液、IAV检测液、SAT酶液、IAV阳性对照、IAV阴性对照和IAV内标，其中：

裂解液：含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

IAV反应液：含dNTP和NTP；

IAV检测液：含T7引物、nT7引物、IAV检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；

IAV阳性对照；含甲型流感病毒(IAV)M基因的体外转录RNA稀释物；

IAV阴性对照：不含有甲型流感病毒(IAV)靶标核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；

IAV内标：含IAV内标RNA(IAV IC RNA，序列如序列表中序列7所示)。

具体的，所述试剂盒中一个反应单位中上述各种试剂组成如下：

(1)裂解液：HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄ 5-50mM；

(2)核酸提取液：HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

(3)洗涤液：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500Mm，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(4)IAV反应液：Tris 10-50mM，MgCl₂ 10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM；

(5)IAV检测液：将IAV扩增引物和IAV检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可；其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，IAV检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mMTris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；

(7)IAV阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的体外转录RNA稀释物；

(8)IAV阴性对照：不含有甲型流感病毒(IAV)靶标核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液；

(9)IAV内标：含10⁵-10⁸拷贝/mL IAV IC RNA(序列如序列表中序列7所示)体外转录RNA稀释物。

另一种更具体形式，所述试剂盒由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述IAV反应液、IAV检测液、SAT酶液、IAV阳性对照、IAV阴性对照及IAV内标。

所述IAV阳性对照中的体外转录的IAV RNA以下述方法制备：

1)用化学合成法合成IAV M基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；

2)将片段克隆到

载体中，构建IAV阳性对照质粒；

3)IAV阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-IAV菌株，贮存于-70℃；

4)从

-T-IAV菌株中提取

-T-IAV质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

所述IAV内标中的体外转录的IAV IC RNA以下述方法制备：

1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同IAV靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；

2)将片段克隆到载体中，构建IAV内标质粒；

3)IAV内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-IAV IC菌株，贮存于-70℃；

4)从

-T-IAV IC菌株中提取

-T-IAV IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

所述通用型甲型流感病毒(IAV)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：

(1)可与序列表中序列1所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶标核酸(IAV RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

(2)用于在M-MLV反转录酶作用下产生IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝的IAV扩增引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

(3)用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的IAV检测探针，所述IAV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

(4)内标和内标检测探针，内标为IAV核苷酸序列(IAV RNA)的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和nT7引物)，内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示IAV IC RNA，内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

所述试剂盒的使用方法，用于通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下操作：

1)用裂解液裂解待测样品中的甲型流感病毒(IAV)，得到含有甲型流感病毒(IAV)核酸的裂解液；

2)向步骤1)的裂解液中加入核酸提取液和IAV IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，得到甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAV IC RNA；

3)将步骤2)提取的甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAV IC RNA加入由IAV反应液和IAV检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为3∶1；

4)根据荧光信号产生的时间和强度参照IAV阳性对照、IAV阴性对照和IAV内标检测结果对待测样品进行定性检测。

本发明提供了一种通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有的IAV检测相比，具有以下优点：

(1)高特异性、高纯度、低污染：针对IAV靶核酸设计的优选捕获探针，可高效、特异性捕获IAV的RNA。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测：将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50分钟。

(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

综上所述，本发明试剂盒能够检测拭子中的IAV RNA，具有特异性高、灵敏度高(可达100copies/反应)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(50分钟完成扩增检测)的特点，将在通用型甲型流感早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为临床样本咽拭子的靶标荧光检测结果

图2为临床样本咽拭子的内标荧光检测结果

图3为临床样本鼻拭子的靶标荧光检测结果

图4为临床样本鼻拭子的内标荧光检测结果

图5为采用已有甲型流感病毒通用型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)对照检测临床样本鼻拭子的结果

具体实施方式

本发明通用型甲型流感病毒(IAV)检测技术，将特异性靶标捕获技术与实时荧光核酸恒温扩增(SAT)技术结合而形成。

由于甲型流感病毒包括的亚型较多，如常见的H1、H3、H5、H7、H9，所以要覆盖如此多的亚型，在检测靶标的选择上就必须考虑试剂盒对各亚型检测的通用性，因此必须选择在各个亚型之间保守性较强的基因作为检测靶标。甲型流感病毒各亚型之间保守性强的基因为M基因，因此本发明的发明人通过研究分析确定了M基因上一段甲型流感各亚型之间保守性强，但对B、C型流感特异的序列作为检测靶标，这样既保证对甲型流感检测的高度覆盖，又保证了对B、C型流感检测的特异性。

本发明通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获IAV的RNA；核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化检测探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。

本发明中的专用引物和探针包括：

(1)捕获探针：一条可与序列表中序列1所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶标核酸(IAV RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，在有IAV内标(IAV IC RNA)时，其还可与该IAV内标序列特异结合；所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

(2)IAV扩增引物：一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝的IAV扩增引物，所述IAV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

(3)IAV检测探针：一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的IAV检测探针，所述IAV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

为便于进行结果分析，还包括：(4)一条内标检测探针和IAV内标，内标检测探针为在使用IAV内标时与该内标配合使用的内标检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；IAV内标为IAV核苷酸序列(IAV RNA)的竞争性内标，同时与所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物(T7和nT7引物)。IAV内标的核苷酸序列如序列表中序列7所示，命名为IAVIC RNA(IC含义为内标)。

基于以上设计，本发明进一步提供一种通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。

该试剂盒，至少包含所述捕获探针(序列2)，一对所述T7引物(序列3)和nT7引物(序列4)，以及一条所述IAV检测探针(序列5)。

进一步，所述试剂盒还可包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和IAV检测探针存在于IAV检测液中。

再进一步，所述试剂盒还可包含竞争性IAV内标(序列7)和内标检测探针(序列6)，所述的内标检测探针存在于IAV检测液中。

更具体来讲，所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、IAV反应液、IAV检测液、SAT酶液、IAV阳性对照、IAV阴性对照和IAV内标，各组分说明如下：

(1)裂解液：用于裂解和保存待测样品中的甲型流感病毒(IAV)，为含有去垢剂和HEPES缓冲液的溶液，去垢剂主要为硫酸铵((NH₄)₂SO₄，优选为5-50mM)；

(2)核酸提取液：用于提取和纯化IAV病毒RNA，为含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)的水溶液；

(3)洗涤液：用于磁珠清洗，为含1wt％SDS的水溶液。

(4)IAV反应液：SAT扩增所需组分，含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)和NTP 1-20mM(优选为1-10mM)的水溶液；

(5)IAV检测液：含SAT扩增所需引物和探针的水溶液，各引物或探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，IAV检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmo1/反应；

(6)SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；

(7)IAV阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的体外转录RNA稀释物；

(8)IAV阴性对照：不含有甲型流感病毒(IAV)靶标核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；

(9)IAV内标：含10⁵-10⁸拷贝/mL IAV内标RNA(序列7)，是IAV核苷酸序列(IAVRNA)的竞争性内标，为体外转录RNA(IAV IC RNA)稀释物。

以上所述试剂盒中各组成的进一步说明如下：

裂解液的主要有效成分是去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。捕获探针一端与靶标互补，一端与磁性颗粒互补连接，在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过洗涤液清洗磁性颗粒而获得纯净的病毒靶标核酸(RNA)。病毒RNA的提取通过特异性吸附原理来实现。

IAV检测液中IAV检测探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中设置了IAV阳性对照、IAV阴性对照和IAV内标。其中，IVA阳性对照和IAV内标为体外转录的RNA，不具有生物学活性。

通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。此外，通过阳性对照品可制备临界弱阳对照(以生理盐水和裂解液按1∶1混合成为稀释液，稀释阳性对照1000倍作为临界弱阳对照)，可以提示处于临界值状态时的检验操作情况，通过临界弱阳对照定期检测SAT实验室，可进行室内质量控制，以防止检测过程出现漏检(假阴性)的情况。IAV内标作为IAV RNA的竞争性内标，其最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

利用以上试剂盒对通用型甲型流感病毒(IAV)进行实时荧光核酸恒温扩增检测，包括以下步骤：

1)用裂解液裂解待测样品中的甲型流感病毒(IAV)，得到含有甲型流感病毒(IAV)核酸的溶液；

2)向步骤1)得到的溶液中加入核酸提取液和IAV IC RNA，使捕获探针与靶标或内标核酸特异结合后再与磁珠结合，用洗涤液洗涤，除去未与磁珠结合的核酸，保留在磁珠上的即为提取得到的甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAV IC RNA；

3)将步骤2)提取的甲型流感病毒(IAV)的核酸(RNA)和IAV IC RNA加入由IAV反应液和IAV检测液组成的第一阶段反应物中，在60℃下温育10分钟后，再在42℃下温育5分钟，然后加入第二阶段酶反应物SAT酶液，由此开始在42℃下继续温育50分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比可为3∶1；

4)根据荧光信号产生的时间和强度参照IAV阳性对照、IAV阴性对照和IAV内标检测结果对待测样品进行定量或定性检测。

在上述检测操作中，所述步骤1)中的待测样品为咽拭子或鼻拭子。

所述步骤4)中的IAV阳性对照为含10⁵-10⁸拷贝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的体外转录RNA稀释物；IAV阴性对照为不含有甲型流感病毒(IAV)靶标核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液；IAV内标为含10⁵-10⁸拷贝/mL IAV内标RNA(序列7)稀释物。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中所用主要原料SAT酶液、阳性对照及内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，MX3005荧光定量仪为Stratagene公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测通用型甲型流感病毒(IAV)的专用引物和探针的设计

本发明选择IAV病毒M基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，根据引物探针设计原理，使用DNA ATAR、DNAman软件和人工设计用于实时荧光核酸恒温扩增检测通用型甲型流感病毒(IAV)的专用引物和探针序列，得到如下具体序列∶

(1)一条可与如序列表中序列1所示的通用型甲型流感病毒(IAV)的靶标核酸(IAV RNA)序列特异结合的捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)，所述捕获探针的核苷酸序列为5’-AUCYUCCAGUCUCUGCGCGAaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(Y为简并碱基，代表C/T，序列表中序列2)；

(2)一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝的IAV扩增引物，所述IAV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列为5’-aatttatacgactcactatagggagaCCTAAVATYCCCTTAGTCAGAGGTGACA-3’(V、Y代表简并碱基，V代表A/G/C，Y代表C/T，序列表中序列3)，nT7引物序列为5’-AAGAAYACCGATCTTGAGGC-3’(Y代表简并碱基，代表C/T，序列表中序列4)；

(3)一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述IAV靶标核酸(IAV RNA)的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的IAV检测探针，所述IAV检测探针的核苷酸序列为5’-cacGCAAGACAAGACCAAuCgcgug-3’(序列表中序列5)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

(4)为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的竞争性IAV内标(序列7)，设计了竞争性内标检测探针，IAV内标与IAV靶标核苷酸(IAV RNA)拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述IAV内标可通过IAV靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与IAV检测探针序列、荧光标记不同，但碱基数一致的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为5’-ccagGUAAUUCGGCACGUGGccugg-3’(序列表中序列6)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例2、制备通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，Target CaptureOligo)、T7引物、nT7引物、IAV检测探针、内标检测探针、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶。

所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和IAV检测探针、内标检测探针存在于IAV检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，具体来讲，所述试剂盒分为2-30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15--35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)，A盒包括裂解液、核酸提取液和洗涤液，B盒包括IAV反应液、IAV检测液、SAT酶液、IAV阳性对照、IAV阴性对照和IAV内标，主要成分如下：

A盒(标本处理单元)组成为：

裂解液；含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)和磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

洗涤液：主要含1wt％SDS。

B盒(核酸扩增检测单元)组成为：

IAV反应液：含dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)；

IAV检测液：含引物和探针，各引物和探针的浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，IAV检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)，T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)；

IAV阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的体外转录RNA稀释物；

IAV阴性对照：不含有甲型流感病毒(IAV)靶标核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；

IAV内标：含10⁵-10⁸拷贝/mL IAV IC RNA稀释物(序列表中序列7)。

试剂盒中所包含的所有试剂均可按提示以常规方法制备取得或商业购买得到。

具体来讲，每一反应单位中，所述试剂盒各种试剂的具体组配如下：

(1)裂解液：为裂解和保存人咽拭子和鼻拭子中的甲型流感病毒(IAV)，含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄ 5-50mM；

(2)核酸提取液：为提取甲型流感病毒(IAV)RNA的含有oligo(dT)包被的磁珠和特异结合靶标核酸(IAV RNA)的一段RNA序列的溶液，具体包含HEPES 50-400mM，EDTA 40-200mM，LiCl 400-2000mM，捕获探针1-50μM(优选为5-25μM)，磁珠50-500mg/L(优选为50-250mg/L)；

(3)洗涤液：为含SDS、NaCl的溶液，具体包含HEPES 5-50mM，NaCl 50-500Mm，1％SDS 1-10mM，EDTA 1-10mM；

(4)IAV反应液：为含dNTPs和NTPs扩增所需组份，具体包含Tris 10-50mM，MgCl₂ 10-40mM，dNTP 0.1-10mM(优选为0.5-5mM)，NTP 1-20mM(优选为1-10mM)，PVP401-10％，KCl 5-40mM；

(5)IAV检测液：将恒温扩增时必需的IAV扩增引物和IAV检测探针溶解在TE溶液(10mM Tris和1mM EDTA的混合液)中配制而成，引物和探针浓度在5-10pmol/反应均可，其中T7引物浓度优选为7.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为7.5pmol/反应，IAV检测探针浓度优选为5pmol/反应，内标检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(6)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含M-MLV反转录酶400-4000U/反应(优选为500-1500U/反应)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应(优选为500-1000U/反应)、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zincacetate、10-100mM trehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；

(7)IAV阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL甲型流感病毒(IAV)M基因的体外转录RNA稀释物；

(8)IAV阴性对照：不含有甲型流感病毒(IAV)靶标核酸(IAV RNA)序列或不含有甲型流感病毒的溶液，如生理盐水；

(9)IAV内标：含10⁵-10⁸拷贝/mL IAV内标RNA(序列表中序列7)。

IAV阳性对照中的体外转录的IAV RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成IAV M基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)；

(2)将片段克隆到

载体中，构建IAV阳性对照质粒；

(3)IAV阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-IAV菌株，贮存于-70℃；

(4)从

-T-IAV菌株中提取-T-IAV质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

IAV内标中的体外转录的IAV IC RNA，可以通过多种方法制备所得。其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同IAV靶标序列区域(其核苷酸序列如序列表中序列9所示)；

(2)将片段克隆到

载体中，构建IAV内标质粒；

(3)IAV内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

-T-IAV IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从

-T-IAV IC菌株中提取

-T-IAV IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

实施例3、临床样本咽拭子的实时荧光核酸恒温扩增检测

用本发明试剂盒(组成见实施例2)检测临床样本咽拭子中的通用型甲型流感病毒(IAV)，具体方法包括以下步骤：

(1)样本采集、运输及保存

由临床医师根据实际情况进行标本采集，检测标本为咽拭子，采集方法为：专用采样棉签擦拭咽后壁及两侧咽扁桃体部分，将拭子侵入3-5mL生理盐水中，密封送检。样本采集后48小时内4℃保存送至流感监测网络实验室(或者-70℃保存待测，一周内送达)。

(2)核酸提取

2.1在样品处理管(1.5mL离心管)中加入200μl裂解液(含HEPES 35mM，(NH₄)₂SO₄20mM)，200μl拭子洗液(用生理盐水洗涤下的样本溶液，不足以生理盐水补足)，用裂解液裂解待测样品中的甲型流感病毒(IAV)，得到含有甲型流感病毒(IAV)核酸的裂解液。

2.2在样品处理管(1.5mL离心管)中加入100μl核酸提取液(含HEPES l00mM，EDTA 50mM，LiCl 500mM，捕获探针10μM，磁珠250mg/L)，10μl内标溶液(含10⁶拷贝/mL IAV内标RNA)，混匀，60℃保温5分钟，室温放置10分钟。

2.3将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液(含HEPES50mM，NaCl 100mM，1％SDS，EDTA 5mM)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，反复2次。

2.4将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

(3)SAT核酸扩增检测

3.1向样品处理管中加入40μl反应检测液(40μl IAV反应液+2.5μl IAV检测液)洗涤磁珠。IAV反应液具体包含Tris 30mM，MgCl₂ 10mM，dNTP 4mM，NTP 7mM，PVP405％，KCl 25mM；IAV检测液中T7引物浓度为7.5pmol，nT7引物浓度为7.5pmol，IAV检测探针浓度为5pmol，内标检测探针浓度为5pmol。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μ1加至洁净微量反应管，用7500型PCR仪(美国ABI公司产品)60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含M-MLV反转录酶1200U，T7RNA聚合酶800U/反应，10mM HEPES pH7.5，20mMN-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)，0.25mM zinc acetate(乙酸锌)、30mMtrehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0，200mM KCl，0.1mM EDTA，0.8％(v/v)Tri ton X-100和40％(v/v)glycerol(丙三三醇)；

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品，ABI仪器只可选VIC通道，但VIC与HEX波长相近)，42℃反应50分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测50次。

(4)结果判定

根据PCR扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

①阳性结果判定：

F1通道：dt≤45的样本为阳性；45＜dt＜50的样本建议重新检测，检测结果

F1通道：dt＜50的样本为阳性。

②阴性结果判定：F1通道dt无数值或为50，同时F2通道：dt≤45，则为阴性。

质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照F1通道：dt≤45；阴性对照F1通道：dt无数值或为50，同时F2通道：dt≤45，否则此次检测结果视为无效。

(5)结果

甲型流感病毒咽拭子临床样本编号为IAV咽拭子标本1-7，另设阴性对照(IAV阴性对照，为不含有甲型流感病毒的靶标核酸(IAV RNA)40倍稀释液)、阳性对照(IAV阳性对照，为含10⁷拷贝/mL甲型流感病毒M基因的体外转录RNA 40倍稀释液)各一个。结果如图1(F1荧光通道)和图2(F2荧光通道)所示，根据F1通道和F2通道的dt值情况，判定样本2，4，5，7为阳性，样本1，3，6为阴性。本结果与金标准培养法检测结果完全相同，表明本发明试剂盒用于检测临床样本咽拭子中的通用型甲型流感病毒(IAV)准确性高，但扩增检测时间仅需50分钟，具有周期短、高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定的特点。

实施例4、临床样本鼻拭子的实时荧光核酸恒温扩增检测

本检测模式为本发明的另一个应用：试剂盒组成同实施例2，试剂的生产在GMP车间进行；鼻拭子临床样本由临床医师根据实际情况进行标本采集，采集方法为：将带有聚丙烯纤维头的拭子分别插入鼻道内鼻腭处，将拭子侵入3-5mL生理盐水中，密封送检。样本采集后48小时内4℃保存送至流感监测网络实验室，或者-70℃保存待测，一周内送达。甲型流感病毒鼻拭子临床样本编号为IAV鼻拭子标本1-7，另设阴性对照、阳性对照各一个。检测方法同实施例3，检测中所用试剂量同实施例3。

另同步进行对照检测：

用北京华大吉比爱生物技术有限公司生产的甲型流感病毒通用型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法，FQ-PCR，国食药监械(准)字2011第3400098号)并参照试剂盒说明书对鼻拭子中的通用型甲型流感病毒(IAV)进行检测，具体方法包括以下步骤：

1、样本处理

a)取200ul鼻拭子浸液和该试剂盒提供的阴性对照品和阳性对照品各25ul，分别加入1.5mL无Rnase和Dnase的离心管中，加入300ul核酸提取液(为TriZol)，振荡混匀。然后再加入-20℃预冷200ul氯仿，振荡混匀后，室温放置2min，4℃13000rpm离心5min。

b)将步骤a)的上清转入另一1.5mL无Rnase和Dnase的离心管中，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，室温放置5min后，4℃13000rpm离心5min，弃上清。

c)向沉淀中加入1mL-20℃预冷的75％乙醇溶液，振荡混匀，4℃13000rpm离心5min，弃上清，重复一次，自然晾干。

d)向沉淀中加入50ul无Rnase和Dnase水，振荡混匀，立即用于检测或放入-70℃保存待测。

2、扩增试剂准备

从试剂盒中取出核酸反应液，待其溶解后，振荡混匀。向荧光定量PCR八联反应管中加入19.7ul核酸反应液和0.3ul逆转录酶，压紧管盖，迅速将其转移至样本处理区。

3、加样

在所设定各荧光定量PCR八连反应管中分别加入步骤1中提取的RNA各10ul，压紧管盖，2000rpm离心10sec。将荧光定量PCR八连管放入荧光PCR检测仪内。

4、PCR扩增

设置ABI7300和ABI7500的程序：50℃ 30min 1个循环；95℃ 15min 1个循环；94℃ 15sec，58℃ 45sec*40个循环(*为荧光信号采集步骤)。

仪器检测通道选择：

发光荧光基团为FAM荧光素，淬灭荧光基团为TAMAR荧光素，参考荧光基团为ROX荧光素，具体检测通道设置参照各仪器使用说明。

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线的最高点为准。

检测结果分析：

1、如果扩增曲线呈S型曲线，或阴性对照的Ct值应为0或无数值、弱阳性对照品的Ct值应＞26并且≤38、强阳性对照品的Ct值≤26，则本次试验有效，否则试验无效。

2、如果扩增曲线呈S型，且待测样本Ct值≤38，为甲型流感病毒检测阳性。

3、如果扩增曲线不呈S型，且待测样本Ct值为0或无数值，为甲型流感病毒检测阴性。

4、如果扩增曲线呈S型，且待测样本Ct值≥38，需重新检测。若重新检测Ct值＞38，则报告为检测阳性；若重新检测Ct值为0或无数值，为甲型流感病毒检测阴性。

5、结果判读

若甲型流感病毒通用型试剂检测结果为阳性，而甲型H1N1流感病毒(2009)试剂检测为阴性，则报告为甲型流感病毒RNA阳性。

若甲型流感病毒通用型试剂检测结果为阳性，而甲型H1N1流感病毒(2009)试剂检测为阳性，则报告为甲型H1N1流感病毒(2009)RNA阳性。

若甲型流感病毒通用型试剂检测结果为阴性，而甲型H1N1流感病毒(2009)试剂检测为阳性，实验异常须重新采集标本按试剂盒说明书要求进行检测。

检测为阴性，并不代表该患者为非流感患者，具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。

使用本发明试剂盒的检测结果如图3(F1荧光通道)和图4(F2荧光通道)所示，荧光素通道F1为FAM，F2为VIC，42℃反应50分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测50次。根据F1通道和F2通道的dt值情况，判定样本7检测为阴性，样本1-6为阳性(样本7图3显示为阴性，图4显示有信号，正说明内标可检测出，反应体系没有受环境影响，排除假阴性)，其结果与目前已上市试剂盒(华大吉比爱的通用甲流检测试剂盒)检测结果(见图5，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，在华大试剂盒中的Ct，指在94℃ 15sec，58℃ 45sec的过程中循环了40次，采集了40次荧光。这个过程中涉及升温和降温，1个循环约2～3分钟，因此整个PCR扩增反应至少100分钟)完全相同。FQ-PCR检测准确度较高，但其操作复杂，检测时间长，单PCR扩增就需100分钟(从PCR扩增程序中可计算出：30+15+40×2≈125分钟)，PCR扩增环节易造成环境DNA污染，而本试剂盒扩增产物为RNA，在环境中易降解，低污染。此外，样本处理环节需冷冻高速离心设备，PCR扩增环节需高温循环过程，整个检测过程的检测成本相对昂贵。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的通用型甲型流感病毒(IAV)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种通用型甲型流感病毒(IAV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的通用型甲型流感病毒即IAV的靶标核酸即IAV RNA的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生IAV靶标核酸的DNA拷贝的IAV扩增引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述IAV靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的IAV检测探针；

所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述IAV扩增引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述IAV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和IAV检测探针存在于一IAV检测液中。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有IAV内标和内标检测探针；所述TAV内标为IAV核苷酸序列的竞争性内标，与捕获探针特异性结合，并使用同一对引物即T7和nT7引物，由序列表中序列7所示的IAV IC RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于IAV检测液中。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含裂解液、核酸提取液、洗涤液、IAV反应液、IAV检测液、SAT酶液、IAV阳性对照、IAV阴性对照和IAV内标，其中：

裂解液：含硫酸铵((NH₄)₂SO₄)和HEPES；

核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液：含NaCl和SDS；

IAV反应液：含dNTP和NTP；

IAV检测液：含T7引物、nT7引物、IAV检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

IAV阳性对照；含甲型流感病毒M基因的体外转录RNA稀释物；

IAV阴性对照：不含有甲型流感病毒靶标核酸序列或不含有甲型流感病毒的溶液；

IAV内标：IAV IC RNA。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述IAV阴性对照为生理盐水。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)裂解液：HEPES25-250mM，(NH₄)₂SO₄5-50mM；

(2)核酸提取液：HEPES50-400mM，EDTA40-200mM，LiCl400-2000mM捕获探针1-50μM，磁珠50-500mg／L；

(3)洗涤液：HEPES5-50mM，NaCl50-500Mm，1％SDS，EDTA1-10mM；

(4)IAV反应液：Tris10-50mM，MgCl₂10-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，PVP401-10％，KCl5-40mM；

(5)IAV检测液：将IAV扩增引物和IAV检测探针溶解在TE溶液，即10mM Tris和1mM EDTA的混合液中配制而成，各引物和探针浓度在5-10pmol／反应；

(6)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U／反应、T7RNA聚合酶200-2000U／反应、2-10mM HEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mM trehalose、40-200mM Tris-HCl pH8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、体积百分浓度0.1-1％的Triton X-100和体积百分浓度20-50％的glycerol；

(7)IAV阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝／mL甲型流感病毒(IAV)M基因的体外转录RNA稀释物；

(8)IAV阴性对照：不含有甲型流感病毒靶标核酸序列或不含有甲型流感病毒的溶液；

(9)IAV内标：含10⁵-10⁸拷贝／mL IAV IC RNA体外转录RNA稀释物。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：试剂(2)核酸提取液中，捕获探针浓度为5-25μM，磁珠用量为50-250mg／L；试剂(4)IAV反应液中，dNTP浓度为0.5-5mM，NTP浓度为1-10mM；试剂(5)IAV检测液中，T7引物浓度为7.5pmol／反应，nT7引物浓度为7.5pmol／反应，IAV检测探针浓度为5pmol／反应，内标检测探针浓度为5pmol／反应；试剂(6)SAT酶液中，M-MLV反转录酶500-1500U／反应，T7RNA聚合酶500-1000U／反应。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：由A盒即标本处理单元和B盒即核酸扩增检测单元组成，其中A盒包装所述裂解液、所述核酸提取液和所述洗涤液，B盒包装所述IAV反应液、IAV检测液、SAT酶液、IAV阳性对照、IAV阴性对照及IAV内标。

9.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于：所述IAV阳性对照中的体外转录的IAV RNA以下述方法制备：

1)用化学合成法合成IAV M基因中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域的片段，其核苷酸序列如序列表中序列8所示；

2)将片段克隆到

载体中，构建IAV阳性对照质粒；

3)IAV阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

菌株，贮存于-70℃：

4)从

菌株中提取

质粒，将质粒进行转录FNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA；或

存在IAV内标时，体外转录的IAV IC RNA以下述方法制备：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同IAV靶标序列区域的片段，其核苷酸序列如序列表中序列9所示；

(2)将片段克隆到

载体中，构建IAV内标质粒；

(3)IAV内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为

IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从

IC菌株中提取

IC质粒，将质粒进行转录RNA，纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA。

10.权利要求3-9任一所述通用型甲型流感病毒(IAV)实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质：

(1)可与序列表中序列1所示的通用型甲型流感病毒的靶标核酸序列特异结合的捕获探针，所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

(2)用于在M-MLV反转录酶作用下产生IAV靶标核酸的DNA拷贝的IAV扩增引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

(3)用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述IAV靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的IAV检测探针，所述IAV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

(4)内标和内标检测探针，内标为IAV核苷酸序列的竞争性内标，可与(1)所述捕获探针特异性结合，并使用同一对引物即T7和nT7引物，其核苷酸序列如序列表中序列7所示；内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

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