CN104830996B - 一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法 - Google Patents

一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，包括：用1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐和N‑羟基琥珀酰亚胺活化羧基磁珠，然后将甲型流感病毒M2e单克隆抗体和/或乙型流感病毒M2单克隆抗体共价偶联在活化的羧基磁珠上，再用偶联后得到的抗体磁珠与待测生物样本混合，富集流感病毒。该方法操作简便、快速、富集效率高、选择特异性好、适用于多种样本。

Description

一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法
技术领域
本发明涉及一种流感病毒检测的前处理方法，特别是一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法。
背景技术
流行性感冒病毒(Influenza virus)，是正粘病毒科的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒。其中人感染甲型流感病毒传染性强、感染率高。在世界范围内，每年度流感流行造成约300万至500万例重症病例，其中死亡约25万至50万人。流感病毒的快速鉴定是应对和防控流感大流行的关键要素。在第一时间鉴定和明确新型流感病毒，了解病毒的来源和相关特征，有助于快速评估病毒的传播风险和健康危害，为疫情的及时有效控制提供重要的科学支撑。
流感病毒的实验室诊断方法主要有病毒分离培养，血清学诊断，抗原检测和病毒核酸检测。其中病毒核酸检测有PCR、实时荧光PCR(real-time PCR)、等温扩增等技术。由于具有速度快、通量高、灵敏度高、特异性强等突出优势，各国通常均以real-time PCR为最主要手段，辅助病毒分离培养和血清学检测流感病毒【1,2】。
虽然real-time PCR方法检测灵敏度高于其他检测手段，但有不少研究也指出，现行的real-time PCR方法仍存在敏感度不足的问题。部分样本使用磁珠法或离心柱法提取样本总核酸(或病毒核酸)后，检测结果处于阳性和阴性之间的“灰区”，还有部分样本当其检测呈阴性结果时，仍不能排除病人未感染流感病毒。此类现象的原因可能是患者处于感染初期或恢复期，导致样本中病毒含量过低，或临床样本中残存抑制扩增检测的物质等。因此需要使用适宜的方法对流感病毒进行富集浓缩。
目前应用的病毒富集方法主要有以下几类：(1)红细胞富集流感病毒法：利用醛化的红细胞凝集流感病毒，并在37℃解离释放病毒，达到富集流感病毒的目的。但该方法的富集效率较低。(2)流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)抗体磁珠富集法：以磁珠为载体，表面包被抗HA抗体，HA抗体磁珠在生物样本中与流感病毒结合后，在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到浓缩分离的目的。该方法一次只能富集一种亚型流感病毒，只能用于病毒颗粒的富集，且制备价格昂贵。(3)唾液酸胎球蛋白磁珠富集法：将HA抗体磁珠富集法中的HA抗体更换为唾液酸胎球蛋白，利用流感病毒与其结合的能力实现浓缩富集。该方法可用于各亚型病毒，但特异性不高【5】。
参考文献
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发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒前处理方法，该方法操作简便、快速、富集效率高、选择特异性好、适用于多种样本。
本发明提供的一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒前处理方法，包括：用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基磁珠，然后将甲型流感病毒M2e单克隆抗体和/或乙型流感病毒M2单克隆抗体共价偶联在活化的羧基磁珠上，再用偶联后得到的抗体磁珠与待测生物样本混合，富集流感病毒。
进一步地，该前处理方法包括如下步骤：
(1)对贮存在保存液中的羧基磁珠进行震荡分散，使其分散为均一悬浊液；
(2)向羧基磁珠悬浊液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在2-6℃下震荡反应25-35分钟；更优选地使在4℃下震荡反应30分钟；
(3)在步骤(2)得到的混合体系中加入N-羟基琥珀酰亚胺，在2-6℃下反应6小时，得到活化羧基磁珠；更优选地温度为4℃；
(4)将活化羧基磁珠加入到流感病毒M2e单克隆抗体的蛋白溶液中，在2-6℃下震荡反应8小时，得到抗体磁珠；更优选地为4℃；
(5)对抗体磁珠进行洗涤，然后在2-6℃下保持2个月；更优选地为4℃；
(6)将抗体磁珠加入到待测生物样本中，震荡条件下混合，进行流感病毒和流感病毒感染细胞的浓缩富集。
优选地，所述流感病毒单克隆抗体的蛋白溶液的制备方法为：1单位质量的流感病毒单克隆抗体，使用1.5单位质量的pH7.4的PBS缓冲液稀释，获得流感病毒单克隆抗体的蛋白溶液。
优选地，步骤(1)中的震荡分散采用涡旋振荡仪进行，转速为3000rpm。
优选地，所述震荡反应采用涡旋振荡仪进行，转速为300rpm。
进一步地，上述前处理方法还包括：
(7)对浓缩富集流感病毒后的抗体磁珠进行洗涤。
优选地，步骤(2)中羧基磁珠与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:20。
优选地，N-羟基琥珀酰亚胺的加入量为：步骤(2)得到的混合体系中每含6mol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，需要加入1mol的N-羟基琥珀酰亚胺。
优选地，步骤(4)中活化羧基磁珠与流感病毒M2e单克隆抗体的质量比为1:0.10-0.15。
优选地，步骤(6)中抗体磁珠的加入量为50μg
本发明提供的一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒前处理方法，其原理是根据流感病毒及被流感病毒感染的宿主细胞表面都展示有流感病毒基质蛋白胞外区(Matrixprotein 2external domain,M2e)蛋白的特性，将抗流感病毒M2e和或M2抗体共价偶联在活化磁珠上，将偶联后的抗体磁珠与待测生物样本混合孵育，再通过外加磁场的作用分离富集浓缩的流感病毒。该方法实现了流感病毒和病毒感染细胞的同步富集浓缩，在浓缩的同时实现了扩增检测抑制物质的去除。适用于各种亚型的流感病毒，适用于各类低病毒载量生物样本。操作简便，适应于多种流感病毒样本，特异性强，灵敏度高，成本较低。
附图说明
图1为实施例1及其阳性对照组、阴性对照组的实时荧光反转录PCR检测扩增曲线图；图1中1为甲型H1N109pdm亚型阳性对照；2为甲型H1N109pdm亚型检测样本(实施例1)；3为甲型H3N2亚型检测样本(实施例1)；4为甲型H3N2亚型阳性对照；5为甲型H1N109pdm亚型阴性对照；6为甲型H3N2亚型阴性对照。
图2为实施例2及其阳性对照组、阴性对照组的实时荧光反转录PCR检测扩增曲线图；图2中1为乙型流感病毒检测样本；2为乙型流感病毒阳性对照；3为乙型流感病毒阴性对照。
图3为实施例3实时荧光反转录PCR检测扩增曲线图；图3中1为甲型H3N2亚型检测阳性；2为甲型H1N109pdm亚型检测阴性；3为甲型H5N1亚型检测阴性；4为甲型H7N9检测阴性；5为阴性对照。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
本发明各实施例中的羧基磁珠为超顺磁珠，由市售渠道直接购得，甲型流感病毒M2e单克隆抗体与乙型流感病毒M2单克隆抗体购自美国Sigma公司。
实施例1
甲型H1N109pdm亚型或甲型H3N2亚型流感病毒咽拭子样本前处理
(1)使用涡旋振荡仪震荡(条件3000rpm，时间5分钟)羧基化超顺磁珠，使其完全分散为均一悬浊液。
(2)在0.2g超顺磁珠中加入4g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)，4℃300rpm条件下反应30分。
(3)在上述反应体系中加入0.4g N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)，4℃300rpm条件下反应6小时。
(4)取1/10的上述反应体系，加入2mg甲型流感病毒M2e单克隆抗体，使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释到2mL总反应体积，4℃反应(条件300rpm，时间8小时)。
(5)反应结束后使用磁力架吸附磁珠，使用pH 7.4的PBS缓冲液3mL洗涤抗体磁珠2次，后加入2mL pH 7.4的PBS缓冲液(含1/20体积比的抗体稳定剂)重悬，可在4℃条件下保存，2个月内使用。
(6)将50μg抗体磁珠加入到1.5mL甲型H1N109pdm亚型或甲型H3N2亚型流感病毒咽拭子样本中，300rpm条件下混合30分钟。
(7)使用磁力架吸附磁珠，使用pH 7.4的PBS缓冲液1mL洗涤抗体磁珠2次，后加入140μL pH 7.4的PBS缓冲液重悬。
实施例2
乙型流感病毒的下呼吸道灌洗液样本前处理
(1)使用涡旋振荡仪震荡(条件3000rpm，时间5分钟)羧基化超顺磁珠，使其完全分散为均一悬浊液。
(2)在0.2g超顺磁珠中加入4g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)，4℃300rpm条件下反应30分)。
(3)在上述反应体系中加入0.4g N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)，4℃300rpm条件下反应6小时。
(4)取1/10的上述反应体系，加入2mg乙型流感病毒M2单克隆抗体，使用pH 7.4的PBS缓冲液稀释到2mL总反应体积，4℃反应(条件300rpm，时间8小时)。
(5)反应结束后使用磁力架吸附磁珠，使用pH 7.4的PBS缓冲液3mL洗涤抗体磁珠2次，后加入2mL pH 7.4的PBS缓冲液(含1/20体积比的抗体稳定剂)重悬，可在4℃条件下保存，2个月内使用。
(6)将50μg抗体磁珠加入到1.5mL乙型流感病毒的下呼吸道灌洗液样本中，300rpm条件下混合30分钟。
(7)使用磁力架吸附磁珠，使用pH 7.4的PBS缓冲液1mL洗涤抗体磁珠2次，后加入140μL pH 7.4的PBS缓冲液重悬。
实施例3
未知型别流感病毒咽拭子样本前处理
(1)使用涡旋振荡仪震荡(条件3000rpm，时间5分钟)羧基化超顺磁珠，使其完全分散为均一悬浊液。
(2)在0.2g超顺磁珠中加入4g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)，4℃300rpm条件下反应30分)。
(3)在上述反应体系中加入0.4g N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)，4℃300rpm条件下反应6小时。
(4)按抗甲型流感病毒M2e单克隆抗体：抗乙型流感病毒M2单克隆抗体＝2：1的质量比，在PBS缓冲液中配置混合抗体。
(5)取1/10的活化羧基超顺磁珠，加入2mg混合单克隆抗体，使用pH7.4的PBS缓冲液稀释到2mL总反应体积，4℃反应(条件300rpm，时间8小时)。
(6)反应结束后使用磁力架吸附磁珠，使用pH 7.4的PBS缓冲液3mL洗涤抗体磁珠2次，后加入2mL pH 7.4的PBS缓冲液(含1/20体积比的抗体稳定剂)重悬，可在4℃条件下保存，2个月内使用。
(7)将50μg抗体磁珠加入到1.5mL未知型别流感病毒咽拭子样本中，300rpm条件下混合60分钟。
(8)使用磁力架吸附磁珠，使用pH 7.4的PBS缓冲液1mL洗涤抗体磁珠2次，后加入140μL pH 7.4的PBS缓冲液重悬。
试验例1
对实施例1中得到的重悬液进行核酸扩增检测。同时采用未经前处理的流感病毒阳性对照组、以及阴性对照组进行比对。由图1结果可知，采用本发明前处理方法后，在甲型H1N109pdm亚型或甲型H3N2亚型流感病毒检测过程中显示出更好的特异性和灵敏度。
试验例2
对实施例2中得到的重悬液进行核酸扩增检测。同时采用未经前处理的流感病毒阳性对照组、以及阴性对照组进行比对。由图3结果可知，采用本发明前处理方法后，在乙型流感病毒检测过程中显示出更好的特异性和灵敏度。
试验例3
对实施例3中得到的重悬液进行核酸扩增检测。实时荧光反转录PCR检出甲型H3N2亚型流感病毒核酸阳性，甲型H1N109pdm亚型、甲型H5N1亚型、甲型H7N9亚型流感病毒核酸阴性。
以上对本发明所提供的一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒前处理方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特在于，包括：用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基磁珠，然后将甲型流感病毒M2e单克隆抗体和/或乙型流感病毒M2单克隆抗体共价偶联在活化的羧基磁珠上，再用偶联后得到的抗体磁珠与待测生物样本混合，富集流感病毒。
2.根据权利要求1所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对贮存在保存液中的羧基磁珠进行震荡分散，使其分散为均一悬浊液；
(2)向羧基磁珠悬浊液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在2-6℃下震荡反应25-35分钟；
(3)在步骤(2)得到的混合体系中加入N-羟基琥珀酰亚胺，在2-6℃下反应6小时，得到活化羧基磁珠；
(4)将活化羧基磁珠与流感病毒单克隆抗体的蛋白溶液混合，在2-6℃下震荡反应8小时，得到抗体磁珠；所述流感病毒单克隆抗体为甲型流感病毒M2e单克隆抗体和/或乙型流感病毒M2单克隆抗体；
(5)对抗体磁珠进行洗涤，然后在2-6℃下保持2个月；
(6)将抗体磁珠加入到待测生物样本中，震荡条件下混合，进行流感病毒和流感病毒感染细胞的浓缩富集。
3.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，所述流感病毒单克隆抗体的蛋白溶液的制备方法为：1单位质量的流感病毒单克隆抗体，使用1.5单位质量的pH 7.4的PBS缓冲液稀释，获得流感病毒单克隆抗体的蛋白溶液。
4.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，步骤(1)中的震荡分散采用涡旋振荡仪进行，转速为3000rpm。
5.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，所述震荡反应采用涡旋振荡仪进行，转速为300rpm。
6.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，还包括：
(7)对浓缩富集流感病毒后的抗体磁珠进行洗涤。
7.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，步骤(2)中羧基磁珠与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:20。
8.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，N-羟基琥珀酰亚胺的加入量为：步骤(2)得到的混合体系中每含6mol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，需要加入1mol的N-羟基琥珀酰亚胺。
9.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，步骤(4)中活化羧基磁珠与流感病毒单克隆抗体的质量比为1:0.10-0.15。
10.根据权利要求2所述的基于抗体磁珠捕获的流感病毒检测前处理方法，其特征在于，步骤(6)中抗体磁珠的加入量为50μg。
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