CN105807070B - 一种检测乙肝病毒的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断检测技术领域，提供了一种检测乙肝病毒的试剂盒，其包括：包被的微孔反应板、铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体、分析缓冲液、荧光增强液、浓缩清洗液。本发明实施例提供了一种操作简便、价格低廉的检测乙肝病毒的试剂盒。

Description

一种检测乙肝病毒的试剂盒
【技术领域】
本发明涉及体外诊断检测技术领域，特别是涉及一种检测乙肝病毒的试剂盒。
【背景技术】
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是导致肝硬化和干细胞癌的主要原因之一，受HBV慢性感染的人群罹患原发性肝细胞癌的相对危险性至少增加300倍。全世界约有3亿人感染乙型肝炎病毒，而中国作为乙型肝炎的高流行区，就有约1.2亿人感染乙型肝炎病毒，因此对人群的HBV感染标志物的检测和筛查尤为重要。
临床上应用较多的检测乙肝病毒的试剂盒主要有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法和时间分辨免疫荧光分析法。但是现有的定量分析两种以上的分析物的试剂盒都操作比较繁琐，且价格也比较高。
鉴于此，克服该现有技术所存在的缺陷是本技术领域亟待解决的问题。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供一种定量检测两种以上的分析物，且操作简便、价格低廉的检测乙肝病毒的试剂盒。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种检测乙肝病毒的试剂盒，该检测乙肝病毒的试剂盒包括：包被的微孔反应板、铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体、分析缓冲液、荧光增强液、浓缩清洗液。
优选地，包被的微孔反应板的制作过程为：
用包被液将捕获抗体AFP和HBsAg稀释，获得稀释液；
将稀释液加入微孔反应板中，对该微孔反应板进行震荡、去除包被液、洗涤、干燥，并加入封闭液封闭一段时间后，去除封闭液，真空抽干后冷藏。
优选地，包被液为Tris-HCl缓冲液。
优选地，封闭液为50ml/L Tris-HCl缓冲体系中加入0.1％BSA、4％海藻糖、0.05％NaN3，0.22μm过滤后调PH值至7.2于4℃保存。
优选地，铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体的制备方法为：
将AFP抗体或者ABsAg抗体加入带滤膜的离心管；
在离心管内加入标记缓冲液，离心后，去除滤液；
重复上一步骤两次以上，以获得浓缩的抗体原料；
按照质量比AFP抗体/Eu＝5:1或者HBsAg抗体/Sm＝2:1向离心管加入一定量的螯合物配体，以获得铕标记的AFP标记抗体或者钐标记的HBsAg标记抗体，密封后静置；
将离心管内的铕标记的AFP标记抗体或者钐标记的HBsAg标记抗体纯化、收集后加入保护液，密封冷藏。
优选地，标记缓冲液为Na2CO3溶液被过滤并调整PH值至9.0获得。
优选地，保护液为0.1％的BSA溶液。
优选地，螯合物配体为β-NTA螯合物。
优选地，分析缓冲液是由Tween-40、NaCl、BSA、NaN3、牛血清蛋白、荧光红染料加入Tris-HCl缓冲液中溶解、过滤获得的。
优选地，浓缩清洗液中为0.84％NaCl，0.01％NaN3，0.06％Tween20加入50mmol/LTris-HCl缓冲液中制备而成。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明中，检测乙肝病毒的试剂盒可以同时定量检测AFP、HBsAg两种抗原，且其重复性好、精密度高、特异性好，而且操作快速简便、价格相对较低、具有易实现自动化等优点。
【附图说明】
图1为本发明一种检测乙肝病毒的试剂盒的一个实施例的结构示意图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不限定本发明。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1:
本发明实施例1提供了一种检测乙肝病毒的试剂盒。图1为本发明一种检测乙肝病毒的试剂盒的一个实施例的结构示意图，如图1所示，检测乙肝病毒的试剂盒包括：包被的微孔反应板、铕标记的AFP(alpha fetoprotein，甲胎蛋白)标记抗体、钐标记的HBsAg(Hepatitis B Surface Antigen，乙型肝炎病毒表面抗原)标记抗体、分析缓冲液、荧光增强液、浓缩清洗液。
微孔反应板是一种事先包被而专用于放置待测样本的透明塑料板，透明塑料板上有多排大小均匀一致的小孔，每个小孔内都包埋着相应的AFP和HBsAg抗体，从而形成包被的微孔反应板。微孔板上每个小孔可盛放零点几毫升的溶液，其常见规格有96孔板，48孔板，32孔板等多种。优选地，微孔反应板可以是聚苯乙烯等材料构成，其具有透明性好，无毒无味等优点。
甲胎蛋白(AFP)是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。但是在一般病毒性肝炎患者，AFP升高者约13％，在慢性活动性肝炎患者中可有20％－40％的人会产生AFP升高。从暴发性肝炎恢复的患者AFP升高者可达85％，而且患有癌症性肝病的患者的AFP含量也会有急剧的升高。因此，检测AFP对检测急性乙肝，以及乙肝是否具有向肝癌转化的趋势具有重大意义。
乙肝表面抗原(HBsAg)一般是在感染乙肝病毒1～2周之后出现，意味着乙肝病毒的感染。乙肝表面抗原阳性(+)为HBV感染的标志。因此，AFP与HBsAg的同时检测，不仅可以检测乙肝病毒感染的初期，也可以检测乙肝是否具有向肝癌转变的趋势。
具体地，在本发明实施例中，包被的微孔反应板的制作过程为：
1)用包被液将抗体AFP和HBsAg稀释，获得稀释液。优选地，本实施例中包被液为Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液。Tris-HCl缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。
2)将上述稀释液加入微孔反应板中，对该微孔反应板进行震荡、去除包被液、洗涤、干燥，并加入封闭液封闭一段时间后，去除封闭液，真空抽干后冷藏。
由于抗体和抗原之间的结合是有一定的识别位点的，不是随便结合的，这就是所谓的特异性。但是也可能因为一些特殊的原因而导致本来不应该结合的一对抗体与抗原相互结合了，那么这就是非特异性的结合，因此，没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免非特异性结合。封闭液应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭液是BSA(BullSerum Albumi，牛血清蛋白)、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶。优选地，本实施例中，封闭液为50ml/L Tris-HCl缓冲体系中加入0.1％BSA、4％海藻糖、0.05％NaN3，0.22μm过滤后调PH值至7.2于4℃保存，经实验验证具有良好的效果。
本实施例中，检测乙肝病毒的试剂盒包括铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体。在双标记镧系离子配对中，Tb3+、Eu3+由于发射波长相差较远，有利于灵敏度的提高，是比较常用的一个离子配对。但是Tb3+不能和β-NTA(β-Naphthoyltrifluoroacetone，β-萘甲酰三氟丙酮)螯合物结合。Eu3+，Sm3+的最大发射波长相差不大，但是本发明发明人在实验中发现二者都是窄峰发射，可以通过仪器充分地分辨二者，且都能利用β-NTA螯合物进行解离和增强荧光强度，是优选地离子配对。本实施例中，铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体的制备方法为：
1)将AFP抗体或者ABsAg抗体加入带滤膜的离心管。
2)在离心管内加入标记缓冲液，离心后，去除滤液。优选地，标记缓冲液为将Na2CO3溶液过滤，并调整PH值至9.0获得。
3)重复上一步骤两次以上，以获得浓缩的抗体原料。由于保存抗体的缓冲液中常含有叠氮钠或一级胺，需要去除此类物质，另外抗体要达到一定的浓度才有良好的标记效果，故需对抗体进行浓缩巧去除杂质处理。
4)按照质量比AFP抗体/Eu＝5:1或者HBsAg抗体/Sm＝2:1向离心管加入螯合物配体，以获得铕标记的AFP标记抗体或者钐标记的HBsAg标记抗体，密封后静置。这里的螯合物配体优选地为β-NTA螯合物。
5)将离心管内的铕标记的AFP标记抗体或者钐标记的HBsAg标记抗体纯化、收集后加入保护液，密封冷藏。优选地，这里的保护液为0.1％的BSA溶液。
另外，分析缓冲液可以模拟生物体内环境，有保证的结果稳定性。本实施例中，分析缓冲液是由Tween-40(聚山梨酯)、NaCl、BSA、NaN3、牛血清蛋白、荧光红染料加入Tris-HCl缓冲液中溶解、过滤获得的。浓缩清洗液中为0.84％Nacl，0.01％NaN3，0.06％Tween20加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液中制备而成。
使用时，将待测血清被加入包被的微孔反应板，接着加入分析缓冲液，AFP和HBsAg抗体包被于微孔反应板内形成包被的微孔反应板，用于捕获血清中的抗原，形成AFP和HBsAg抗体复合物。利用浓缩清洗液清洗后，再加入铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体，附着在微孔反应板上的抗原再分别同铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体形成免疫复合物。洗去游离的铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体，加入荧光增强液，将Eu3+和Sm3+解离到溶液中，并与荧光增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物。最终通过结果Eu和Sm的信号测值来判断抗原的数值，从而定量分析血清中的抗原。本发明实施例中检测乙肝病毒的试剂盒重复性好、精密度高、特异性好，而且操作快速简便、价格相对较低、具有易实现自动化等优点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种检测乙肝病毒的试剂盒，其特征在于，该检测乙肝病毒的试剂盒包括：包被的微孔反应板、铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体、分析缓冲液、荧光增强液、浓缩清洗液；
所述包被的微孔反应板的制作过程为：
用包被液将抗体AFP和HBsAg稀释，获得稀释液；所述包被液为Tris-HCl缓冲液；
将所述稀释液加入微孔反应板中，对该微孔反应板进行震荡、去除所述包被液、洗涤、干燥，并加入封闭液封闭一段时间后，去除所述封闭液，真空抽干后冷藏；所述封闭液为50ml/L Tris-HCl缓冲体系中加入0.1％BSA、4％海藻糖、0.05％NaN3，0.22μm过滤后调PH值至7.2于4℃保存；
所述铕标记的AFP标记抗体、钐标记的HBsAg标记抗体的制备方法为：
将AFP抗体或者ABsAg抗体加入带滤膜的离心管；
在所述离心管内加入标记缓冲液，离心后，去除滤液；所述标记缓冲液为将Na2CO3溶液过滤并调整PH值至9.0获得；
重复上一步骤两次以上，以获得浓缩的抗体原料；
按照质量比AFP抗体/Eu＝5:1或者HBsAg抗体/Sm＝2:1向所述离心管加入螯合物配体，以获得所述铕标记的AFP标记抗体或者钐标记的HBsAg标记抗体密封后静置；所述螯合物配体为β-NTA螯合物；
将所述离心管内的所述铕标记的AFP标记抗体或者钐标记的HBsAg标记抗体纯化、收集后加入保护液，密封冷藏；所述保护液为0.1％的BSA溶液。
2.如权利要求1所述的检测乙肝病毒的试剂盒，其特征在于：所述分析缓冲液是由Tween-40、NaCl、BSA、NaN3、牛血清蛋白、荧光红染料加入Tris-HCl 缓冲液中溶解、过滤获得的。
3.如权利要求1所述的检测乙肝病毒的试剂盒，其特征在于：所述浓缩清洗液中为0.84％NaCl，0.01％NaN3，0.06％Tween20加入50mmol/L Tris-HCl缓冲液中制备而成。
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